Name: تسليط الضوء على المؤلف: تطوير مقايسة Acetyl-Click لفحص مثبطات HAT1
Uploaded: 2024-01-26T14:20:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Author Spotlight: Developing Acetyl-Click Assay for HAT1 Inhibitor Screening at JoVE.com

نشكر جورج تشنغ على توفير H4K12CoA. نشكر أعضاء Gruber Lab على المناقشات والتعليقات المفيدة. نشكر الدعم المقدم من المعاهد الوطنية للصحة / NCI (1K08CA245024) و CPRIT (RR200090) ومؤسسة V (V2022-022).

1. الطريقة الأولى: إنتاج وتنقية مركب HAT1 / Rbap46 المؤتلف
<ol><li>إذابة خلايا HEK293f واستعادتها وتوسيعها<ol><li>قم بإذابة 1-10 مليون خلية ثديية HEK293f26 إلى وسائط تعبير حرة 293 سعة 30 مل في قارورة سعة 100 مل. احتضان في 8٪ CO2 عند 37 درجة مئوية أثناء الدوران عند 60 دورة في الدقيقة.</li>
		<li>في ا?...

تطوير مقايسة قائمة على النقر لفحص نشاط إنزيم HAT1

<ol>
	<li>Kleff, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+gene+encoding+a+yeast+histone+H4+acetyltransferase.">Identification of a gene encoding a yeast histone H4 acetyltransferase.</a> J Biol Chem. 270 (42), 24674-24677 (1995).</li><li>Parthun, M. R., Widom, J., Gottschling, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+major+cytoplasmic+histone+acetyltransferase+in+yeast:+links+to+chromatin+replication+and+histone+metabolism.">The major cytoplasmic histone acetyltransferase in yeast: links to chromatin replication and histone metabolism.</a> Cell. 87 (1), 85-94 (1996).</li><li>Verreault, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleosomal+DNA+regulates+the+core-histone-binding+subunit+of+the+human+Hat1+acetyltransferase.">Nucleosomal DNA regulates the core-histone-binding subunit of the human Hat1 acetyltransferase.</a> Curr Biol. 8 (2), 96-108 (1998).</li><li>Parthun, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+acetyltransferase+1:+more+than+just+an+enzyme.">Histone acetyltransferase 1: more than just an enzyme.</a> Biochim Biophys Acta. 1819 (3-4), 256-263 (2013).</li><li>Gruber, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HAT1+coordinates+histone+production+and+acetylation+via+H4+promoter+binding.">HAT1 coordinates histone production and acetylation via H4 promoter binding.</a> Mol Cell. 75 (4), 711-724 e5 (2019).</li><li>Fan, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overexpressed+histone+acetyltransferase+1+regulates+cancer+immunity+by+increasing+programmed+death-ligand+1+expression+in+pancreatic+cancer.">Overexpressed histone acetyltransferase 1 regulates cancer immunity by increasing programmed death-ligand 1 expression in pancreatic cancer.</a> J Exp Clin Cancer Res. 38 (1), 47 (2019).</li><li>Xia, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA-377+exerts+a+potent+suppressive+role+in+osteosarcoma+through+the+involvement+of+the+histone+acetyltransferase+1-mediated+Wnt+axis.">MicroRNA-377 exerts a potent suppressive role in osteosarcoma through the involvement of the histone acetyltransferase 1-mediated Wnt axis.</a> J Cell Physiol. 234 (12), 22787-22798 (2019).</li><li>Yang, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+acetyltransferase+1+is+a+succinyltransferase+for+histones+and+non-histones+and+promotes+tumorigenesis.">Histone acetyltransferase 1 is a succinyltransferase for histones and non-histones and promotes tumorigenesis.</a> EMBO Rep. 22 (2), e50967 (2021).</li><li>Xue, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNAi+screening+identifies+HAT1+as+a+potential+drug+target+in+esophageal+squamous+cell+carcinoma.">RNAi screening identifies HAT1 as a potential drug target in esophageal squamous cell carcinoma.</a> Int J Clin Exp Pathol. 7 (7), 3898-3907 (2014).</li><li>Zhang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+plasticity+of+histones+H3-H4+facilitates+their+allosteric+exchange+between+RbAp48+and+ASF1.">Structural plasticity of histones H3-H4 facilitates their allosteric exchange between RbAp48 and ASF1.</a> Nat Struct Mol Biol. 20 (1), 29-35 (2013).</li><li>Campos, E. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+program+for+processing+newly+synthesized+histones+H3.1+and+H4.">The program for processing newly synthesized histones H3.1 and H4.</a> Nat Struct Mol Biol. 17 (11), 1343-1351 (2010).</li><li>Agudelo Garcia, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+multiple+roles+for+histone+acetyltransferase+1+in+replication-coupled+chromatin+assembly.">Identification of multiple roles for histone acetyltransferase 1 in replication-coupled chromatin assembly.</a> Nucleic Acids Res. 45 (16), 9319-9335 (2017).</li><li>Nagarajan, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+acetyl+transferase+1+is+essential+for+mammalian+development,+genome+stability,+and+the+processing+of+newly+synthesized+histones+H3+and+H4.">Histone acetyl transferase 1 is essential for mammalian development, genome stability, and the processing of newly synthesized histones H3 and H4.</a> PLoS Genet. 9 (6), e1003518 (2013).</li><li>Annunziato, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembling+chromatin:+the+long+and+winding+road.">Assembling chromatin: the long and winding road.</a> Biochim Biophys Acta. 1819 (3-4), 196-210 (2013).</li><li>Annunziato, A. T., Seale, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+deacetylation+is+required+for+the+maturation+of+newly+replicated+chromatin.">Histone deacetylation is required for the maturation of newly replicated chromatin.</a> J Biol Chem. 258 (20), 12675-12684 (1983).</li><li>Dahlin, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assay+interference+and+off-target+liabilities+of+reported+histone+acetyltransferase+inhibitors.">Assay interference and off-target liabilities of reported histone acetyltransferase inhibitors.</a> Nat Commun. 8 (1), 1527 (2017).</li><li>Baell, J. B., Miao, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+acetyltransferase+inhibitors:+where+art+thou.">Histone acetyltransferase inhibitors: where art thou.</a> Future Med Chem. 8 (13), 1525-1528 (2016).</li><li>Lasko, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+of+a+selective+catalytic+p300/CBP+inhibitor+that+targets+lineage-specific+tumours.">Discovery of a selective catalytic p300/CBP inhibitor that targets lineage-specific tumours.</a> Nature. 550 (7674), 128-132 (2017).</li><li>Baell, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibitors+of+histone+acetyltransferases+KAT6A/B+induce+senescence+and+arrest+tumour+growth.">Inhibitors of histone acetyltransferases KAT6A/B induce senescence and arrest tumour growth.</a> Nature. 560 (7717), 253-257 (2018).</li><li>Falk, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+efficient+high-throughput+screening+method+for+MYST+family+acetyltransferases,+a+new+class+of+epigenetic+drug+targets.">An efficient high-throughput screening method for MYST family acetyltransferases, a new class of epigenetic drug targets.</a> J Biomol Screen. 16 (10), 1196-1205 (2011).</li><li>He, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+biology+approaches+for+investigating+the+functions+of+lysine+acetyltransferases.">Chemical biology approaches for investigating the functions of lysine acetyltransferases.</a> Angew Chem Int Ed Engl. 57 (5), 1162-1184 (2018).</li><li>Lipchik, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+peptide-based+biosensor+assay+to+detect+intracellular+Syk+kinase+activation+and+inhibition.">A peptide-based biosensor assay to detect intracellular Syk kinase activation and inhibition.</a> Biochemistry. 51 (38), 7515-7524 (2012).</li><li>Song, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemoproteomic+profiling+of+protein+substrates+of+a+major+lysine+acetyltransferase+in+the+native+cellular+context.">Chemoproteomic profiling of protein substrates of a major lysine acetyltransferase in the native cellular context.</a> ACS Chem Biol. 17 (5), 1092-1102 (2022).</li><li>Gaddameedi, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acetyl-click+screening+platform+identifies+small-molecule+inhibitors+of+histone+acetyltransferase+1+(HAT1).">Acetyl-click screening platform identifies small-molecule inhibitors of histone acetyltransferase 1 (HAT1).</a> J Med Chem. 66 (8), 5774-5801 (2023).</li><li>Ngo, L., Brown, T., Zheng, Y. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bisubstrate+inhibitors+to+target+histone+acetyltransferase+1+(HAT1).">Bisubstrate inhibitors to target histone acetyltransferase 1 (HAT1).</a> Chem Biol Drug Des. 93 (5), 865-873 (2019).</li><li>Parker, C. G., Pratt, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Click+chemistry+in+proteomic+investigations.">Click chemistry in proteomic investigations.</a> Cell. 180 (4), 605-632 (2020).</li><li>Islam, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+bump-and-hole+tactic:+Expanding+the+scope+of+chemical+genetics.">The bump-and-hole tactic: Expanding the scope of chemical genetics.</a> Cell Chem Biol. 25 (10), 1171-1184 (2018).</li><li>Radziwon, K., Weeks, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+engineering+for+selective+proteomics.">Protein engineering for selective proteomics.</a> Curr Opin Chem Biol. 60, 10-19 (2021).</li><li>Rich, R. L., Myszka, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Survey+of+the+year+2007+commercial+optical+biosensor+literature.">Survey of the year 2007 commercial optical biosensor literature.</a> J Mol Recognit. 21 (6), 355-400 (2008).</li></ol>

في العقد الماضي ، أصبحت كيمياء النقر بارزة20 ، مما يتيح التصميم الدقيق للهياكل الكيميائية المتفاعلة. في هذا السياق ، ظهرت العديد من الاتصالات التساهمية المتعامدةالحيوية 21 كخيارات واعدة لتشكيل مجمعات في بيئتها الطبيعية. تستخدم كيمياء النقرات أزواجا من المجموعات ...

من بين العديد من أسيتيل ترانسفيراز حقيقية النواة ، كان HAT1 هو أسيتيل ترانسفيراز هيستون الأولي الذي تم عزله1،2،3. أثبتت التحقيقات اللاحقة دورها المحوري في تكرار الكروماتين ، لا سيما في تخليق نيوكليوسومات جديدة خلال المرحلةS-phase 4. أدت مساعينا البحثية إلى إدراك أن HAT1 يتم تحفيزه بشكل كبير من خلال علاج عامل نمو البشرة (EGF) في الخلايا الثديية5. علاوة على ذلك ، فقد تبين أن HAT1 مطلوب للتكاثر السريع للخلايا وتشكيل الورم في الجسم الحي6،7،8،9. تشير البيانات إلى أن HAT1 أمر بالغ الأهمية في تنسيق العمليات الابتنائية واللاجينية لانقسام الخلايا ، مما يؤدي إلى نمو الورم.
HAT1 ثنائي الأسيتيلات الذيل الأميني الطرفي للهيستون H4 على الليسين 5 و 12 في مركب مع بروتين chaperone Rbap46 ، الذي يربط الهستون ويقدم المحطة الأمينية إلى HAT1. ثم يتم استيراد رباعيات الهستون أو disomes10 ، جنبا إلى جنب مع HAT1 / Rbap46 وغيرها من مرافقي هيستون11 ، إلى النواة. ثم يتم إطلاق الهستونات ليتم إيداعها في شوكة النسخ المتماثل ، أو مواقع أخرى لدعم تنشيط الجينات أو قمعها. وظيفة علامة HAT1 di-acetylation على هيستون H4 ليست مفهومة تماما. من المحتمل إزالته بسرعة في غضون 15-30 دقيقة بفعل هيستون ديسيتيلاز12،13،14،15 بعد إدخال H4 في الكروماتين. وبالتالي ، لا يتم نشر علامة HAT1 di-acetylation في الكروماتين وقد لا تؤدي دورا جينيا حقيقيا ، على الرغم من افتراض دور في تجنيد الإنزيمات المعدلة للكروماتين إلى الكروماتينالناشئ 12. أيضا ، HAT1 لا أسيتيل الكروماتين مباشرة. يقتصر نشاطها على الهستونات القابلة للذوبان.
تم إعاقة تطوير مثبطات هيستون أسيتيل ترانسفيراز ذات الجزيئات الصغيرة بسبب المقايسات غير المحددة ومنخفضة الإنتاجية ، مما يؤدي في كثير من الأحيان إلى توليد مركبات تفاعلية بيولوجيا16،17. يتطلب اختبار المعيار الذهبي لقياس أنشطة أسيتيل ترانسفيراز استخدام 3H-acetyl-CoA ، مما يحد من الإنتاجية ويتطلب الإشعاع. ومع ذلك ، في الآونة الأخيرة ، تم وصف وتأكيد مثبطات أسيتيل ترانسفيراز جزيء صغير محددة وقوية للغاية تستهدف CBP / p30018 و KAT6A / B19،20 من خلال استخدام 3H-acetyl-CoA. للمضي قدما ، يتم وضع فحوصات محسنة لتحقيق إنتاجية أفضل وتجنب المخاطر المختبرية.
استخدمت التطورات الحديثة في مراقبة أستلة21 كيمياء النقر لتمكين مراقبة التفاعل الأنزيمي. هناك مجموعة متنوعة من السلائف التي تدعم النقر والتي يمكن الوصول إليها عن طريق طرق اصطناعية بسيطة أو متاحة للشراء والتي يمكن دمجها في تفاعلات الإنزيم. عادة ما يتم إجراء هذه التفاعلات في الأنظمة المؤتلفة ، على الرغم من أن المقايسات القائمة على الخلايا ممكنة أيضا22. تتمثل ميزة العوامل والركائز التي تدعم النقر في أن الفحص يمكن أن يقيس نشاط الإنزيم مباشرة دون الحاجة إلى أنظمة قراءة مقترنة غالبا ما تزعجها مركبات الفحص وتتطلب خطوات معالجة إضافية. وهذا يسمح بمعالجة المثبطات فقط خلال الخطوة الأنزيمية ، في حين يتم تنفيذ جميع خطوات التشغيل والكشف النهائية بعد الغسيل المكثف لإزالة المركبات ، مما يحد من احتمال حدوث تداخل المقايسة. هذه المزايا تجعل تصميم المقايسات التي تدعم النقر أفضل من المقايسات المقترنة التي تعتمد عادة على اكتشاف أنزيم A الحر.
أحد الاعتبارات المهمة هو قبول العوامل المساعدة التي تدعم النقر في الموقع النشط للإنزيم. قد لا تكون العوامل المشتركة الحالية التي تم تمكين النقر عليها متوافقة تماما مع الموقع النشط المحسن للعامل المساعد الأصلي. يمكن استخدام المعلومات الهيكلية والنمذجة لتصميم بدائل الأحماض الأمينية لتوسيع الموقع النشط لدمج الركائز المعدلة23. قد يتيح ذلك الفحص باستخدام حركية إنزيم محسنة ومستويات أقل من الركيزة والإنزيم. عيب هذا النهج هو أن الجيوب التحفيزية المتغيرة قد لا تحدد المثبطات التي تتفاعل بقوة مع الإنزيم الأصلي. في النهاية ، هناك حاجة إلى مجموعة من الأساليب لتحديد مثبطات الإنزيم المحتملة والتحقق من صحتها.
هنا ، نصف طريقة تم تطويرها لتنقية وفحص نشاط إنزيم HAT1 باستخدام العامل المساعد للنقر 4-pentynoyl-CoA24. يستخدم هذا الفحص (الشكل 1) تسلسل الإنزيم الأصلي في مركب مع البروتين الشريك المطلوب Rbap46 ، والذي ثبت أنه يعزز نشاط الإنزيم. يسمح تنقية الإنزيم من الخلايا البشرية بتنشيط الإنزيم في السليلولو ، مما قد يحافظ على تحفيز تعديلات ما بعد الترجمة المهمة لنشاط الإنزيم الكامل. تم استخدام تصميم وتحسين مقايسات الإنزيم المؤتلف للشاشات الكيميائية عالية الإنتاجية بنجاح لتحديد وتوصيف مثبطات الجزيئات الصغيرة HAT1.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>4P CoA</td>
			<td>Cayman Chemical</td>
			<td>10547</td>
			<td>Click chemistry co-factor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amplex Red</td>
			<td>Fisher Sci</td>
			<td>A12222</td>
			<td>Fluorescence substrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin-PEG-Azide</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>J64996MC</td>
			<td>Click chemistry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Copper Sulfate</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>&#160;7758-98-7</td>
			<td>Click chemistry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>&#160;67-68-5</td>
			<td>diluent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>03-12-3483</td>
			<td>reducting agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forskolin</td>
			<td>VWR</td>
			<td>102987-310</td>
			<td>Protein expression</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freestyle 293 Expression Medium</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>12338018</td>
			<td>Media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freestyle 293-F cells</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>R790-07</td>
			<td>Protein expression</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H4-peptide/1-23-GGK-biotin</td>
			<td>Anaspec</td>
			<td>AS65097</td>
			<td>peptide substrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>&#160;7365-45-9</td>
			<td>EB buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen peroxide 30% solution</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>&#160;Z00183-99-0</td>
			<td>initiator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M2 FLAG antibody slurry</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>A2220</td>
			<td>Protein purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Macrosep 10K Filter (Pall Lab)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89131-980</td>
			<td>Protein purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neutravidin Plate</td>
			<td>Thermo Sci</td>
			<td>15127</td>
			<td>BSA-pre-blocked</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NP40 (IGEPAL)</td>
			<td>MP Biomedical</td>
			<td>198596</td>
			<td>20x buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pHEK-293 plasmid</td>
			<td>Takara Bio</td>
			<td>3390</td>
			<td>Protein expression</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline 10x</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>&#160;Z00082-33-6</td>
			<td>wash buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pra peptide</td>
			<td>Genscript</td>
			<td>Custom synthesis</td>
			<td>biotinylated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Ascorbate</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>&#160;134-03-2</td>
			<td>Click chemistry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>&#160;7647-14-5</td>
			<td>EB buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>7558-80-7</td>
			<td>buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>189730</td>
			<td>competitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin-HRP</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>3999S</td>
			<td>enzyme</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>THPTA ligand</td>
			<td>Fisher Sci</td>
			<td>1010-500</td>
			<td>Click chemistry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris base</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>&#160;77-86-1</td>
			<td>20x buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton-X 100</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>&#160;9002-93-1</td>
			<td>EB buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>&#160;9005-64-5</td>
			<td>Wash buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>57-13-6</td>
			<td>quencher</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an acetyl-click chemistry assay to measure histone acetyltransferase 1 acetylation

يلعب HAT1 ، المعروف أيضا باسم Histone acetyltransferase 1 ، دورا مهما في تخليق الكروماتين عن طريق تثبيت وأستلة H4 الوليدة قبل تجميع النيوكليوسوم. وهو مطلوب لنمو الورم في أنظمة مختلفة ، مما يجعله هدفا محتملا لعلاج السرطان. لتسهيل تحديد المركبات التي يمكن أن تمنع النشاط الأنزيمي HAT1 ، ابتكرنا مقايسة نقرة الأسيتيل للفحص السريع. في هذا الفحص البسيط ، نستخدم HAT1 / Rbap46 المؤتلف ، والذي يتم تنقيته من الخلايا البشرية المنشطة. تستخدم الطريقة الأسيتل-CoA التناظري 4-pentynoyl-CoA (4P) في نهج كيمياء النقر. يتضمن ذلك النقل الأنزيمي لمقبض الألكاين من خلال تفاعل أسيلة يعتمد على HAT1 إلى ببتيد H4 N-terminal البيوتينيل. ثم يتم تجميد الببتيد الذي تم التقاطه على ألواح النيوترفيدين ، متبوعا بوظيفة كيمياء النقر باستخدام البيوتين أزيد. بعد ذلك ، يتم استخدام توظيف streptavidin-peroxidase لأكسدة amplex red ، مما يؤدي إلى ناتج فلوري كمي. من خلال إدخال مثبطات كيميائية أثناء تفاعل الأسيل ، يمكننا تحديد التثبيط الأنزيمي بناء على تقليل إشارة التألق. الأهم من ذلك ، أن هذا التفاعل قابل للتطوير ، مما يسمح بفحص عالي الإنتاجية للمثبطات المحتملة للنشاط الأنزيمي HAT1.

Among the numerous eukaryotic acetyltransferases, HAT1 was the initial histone acetyltransferase to be isolated1,2,3. Subsequent investigations have firmly established its pivotal role in chromatin replication, particularly in the synthesis of new nucleosomes during S-phase4. Our research endeavors led to the recognition that HAT1 is highly stimulated by epidermal growth factor (EGF) treatment in mammary cells5. Furthermore, it has come to light that HAT1 is required for rapid cell proliferation and tumor formation in vivo6,7,8,9. Data indicate that HAT1 is critical in coordinating anabolic and epigenetic processes for cell division, driving tumor growth.
HAT1 di-acetylates the amino-terminal tail of histone H4 on lysines 5 and 12 in complex with the chaperone protein Rbap46, which binds the histone and presents the amino-terminus to HAT1. Histone tetramers or disomes10, together with HAT1/Rbap46 and other histone chaperones11, are then imported to the nucleus. Histones are then released to be deposited at the replication fork, or other sites to support gene activation or repression. The function of the HAT1 di-acetylation mark on histone H4 is not fully understood. It is likely quickly removed within a span of 15-30 min by the action of histone deacetylases12,13,14,15 after H4 is inserted into chromatin. Thus, the HAT1 di-acetylation mark is not propagated in chromatin and may not serve a true epigenetic role, although a role in the recruitment of chromatin-modifying enzymes to nascent chromatin has been postulated12. Also, HAT1 does not directly acetylate chromatin; its activity is restricted to soluble histones.
The development of small-molecule histone acetyltransferase inhibitors has been hampered by nonspecific and low-throughput assays, often resulting in the generation of biologically reactive compounds16,17.&#160;The gold-standard assay to measure acetyltransferase activities requires the use of 3H-acetyl-coA, which limits throughput and requires radiation. Nonetheless, recently, specific and highly potent small molecule acetyltransferase inhibitors targeting CBP/p30018 and KAT6A/B19,20 have been described and confirmed through the use of 3H-acetyl-CoA. Moving forward, improved assays to achieve better throughput and avoid laboratory hazards are being devised.
Recent advances in acetylation monitoring21 have used click chemistry to enable enzymatic reaction monitoring. There are a variety of click-enabled precursors that are accessible by simple synthetic routes or available for purchase that can be incorporated into enzyme reactions. These reactions are typically carried out in recombinant systems, although cell-based assays are also feasible22. The advantage of click-enabled co-factors and substrates is that screening can directly measure enzyme activity without the need for coupled read-out systems that are often perturbed by screening compounds and require additional handling steps. This allows for inhibitor treatments only during the enzymatic step, whereas all downstream functionalization and detection steps are carried out after extensive washing to remove compounds, thus limiting the potential for assay interference to occur. These advantages make the design of click-enabled assays preferable to coupled assays that commonly rely on the detection of free coenzyme A.
One important consideration is the acceptance of click-enabled co-factors into the enzyme active site. Existing click-enabled co-factors may not be fully compatible with the active site optimized for the native co-factor. Structural information and modeling can be used to design amino acid substitutions to enlarge the active site to incorporate altered substrates23. This may enable screening with improved enzyme kinetics and lower substrate and enzyme levels. The drawback of this approach is that altered catalytic pockets may not identify inhibitors that interact strongly with the native enzyme. Ultimately, a combination of approaches is required to identify and validate potential enzyme inhibitors.
Here, we describe a method developed to purify and assay HAT1 enzyme activity using the click co-factor 4-pentynoyl-CoA24. This assay (Figure 1) uses the native enzyme sequence in complex with its required partner protein Rbap46, which has been shown to boost enzyme activity. Purification of the enzyme from human cells allows for enzyme activation in cellulo, which may preserve stimulating post-translational modifications important for full enzyme activity. Design and optimization of recombinant enzyme assays for high-throughput chemical screens have successfully been used to identify and characterize HAT1 small molecule inhibitors.

تسليط الضوء على المؤلف: تطوير مقايسة Acetyl-Click لفحص مثبطات HAT1

مقايسة كيميائية أسيتيل كليك لقياس هيستون أسيتيل ترانسفيراز 1 أسيتيل

Our developed acetyl-click assay serves as a tool to assess HAT1 acetyl transferase activity, which is key in isolating H4 histones before nucleosome incorporation. We aim to use this method for high throughput screening of small molecule inhibitors against the HAT1 enzyme. This method measures enzymatic activity directly on the peptide substrate.This offers advantages compared to other enzymatic assays by avoiding biologic variability and antibody related costs. This is also high throughput and can be adapted to use with other acetyl transferases. We have recently published a small molecule HAT1 inhibitor based on this assay that has activity in cells and animals.We continue to use this assay to screen additional chemical libraries and perform structure activity relationships. We are advancing methods to track histone production, folding, chaperoning, and chromatin integration. This highlights the need for improved chemical tools to explore biological mechanisms and stimulate drug discovery.Our goal is to demonstrate that targeting histone production can have therapeutic benefit for diseases such as cancer.

يجب تضمين المنحنيات القياسية في نسختين (16 بئرا) على كل لوحة لضمان أداء الفحص المناسب. يجب إعداد بيانات المنحنى القياسي في شكل جدول ، مع نطاق من 100٪ إلى 0٪ وفقا لنسبة الببتيد المحتوي على Pra إلى الببتيد H4 الأصلي في المحلول (الجدول 1). ستكون إشارة Amplex الحمراء هي الأعلى في آبار الببتيد H4 ا?...

Watch this Scientific Journal Video about Author Spotlight: Developing Acetyl-Click Assay for HAT1 Inhibitor Screening at JoVE.com

تعد المقايسات الكيميائية السريعة والدقيقة للكشف عن مثبطات محددة أداة مهمة في ترسانة تطوير الأدوية. هنا ، نقدم مقايسة كيميائية قابلة للتطوير فوق الأسيتيل لقياس تثبيط نشاط أستلة HAT1.

HAT1, also known as Histone acetyltransferase 1, plays a crucial role in chromatin synthesis by stabilizing and acetylating nascent H4 before nucleosome ...

يعمل مقايسة النقر على الأسيتيل المطورة لدينا كأداة لتقييم نشاط HAT1 acetyl transferase ، وهو أمر أساسي في عزل هستونات H4 قبل دمج النيوكليوسوم. نهدف إلى استخدام هذه الطريقة لفحص الإنتاجية العالية لمثبطات الجزيئات الصغيرة ضد إنزيم HAT1. تقيس هذه الطريقة النشاط الأنزيمي مباشرة على ركيزة الببتيد.يوفر هذا مزايا مقارنة بالمقايسات الأنزيمية الأخرى عن طريق تجنب التقلبات البيولوجية والتكاليف المتعلقة بالأجسام المضادة. هذا أيضا إنتاجية عالية ويمكن تكييفه للاستخدام مع ترانسفيراز الأسيتيل الأخرى. لقد نشرنا مؤخرا مثبط جزيء صغير HAT1 بناء على هذا الفحص الذي له نشاط في الخلايا.نستمر في استخدام هذا الاختبار لفحص مكتبات كيميائية إضافية وإجراء علاقات نشاط الهيكل. نحن نطور طرقا لتتبع إنتاج الهستون ، والطي ، والمرافقة ، وتكامل الكروماتين. وهذا يسلط الضوء على الحاجة إلى أدوات كيميائية محسنة لاستكشاف الآليات البيولوجية وتحفيز اكتشاف الأدوية.هدفنا هو إثبات أن استهداف إنتاج الهستون يمكن أن يكون له فائدة علاجية لأمراض مثل السرطان.

an-acetyl-click-chemistry-assay-to-measure-histone-acetyltransferase

Research

JoVE Journal

Biochemistry

An Acetyl-Click Chemistry Assay to Measure Histone Acetyltransferase 1 Acetylation

HAT1, also known as Histone acetyltransferase 1, plays a crucial role in chromatin synthesis by stabilizing and acetylating nascent H4 before nucleosome assembly. It is required for tumor growth in various systems, making it a potential target for cancer treatment. To facilitate the identification of compounds that can inhibit HAT1 enzymatic activity, we have devised an acetyl-click assay for rapid screening. In this simple assay, we employ recombinant HAT1/Rbap46, which is purified from activated human cells. The method utilizes the acetyl-CoA analog 4-pentynoyl-CoA (4P) in a click-chemistry approach. This involves the enzymatic transfer of an alkyne handle through a HAT1-dependent acylation reaction to a biotinylated H4 N-terminal peptide. The captured peptide is then immobilized on neutravidin plates, followed by click-chemistry functionalization with biotin-azide. Subsequently, streptavidin-peroxidase recruitment is employed to oxidize amplex red, resulting in a quantitative fluorescent output. By introducing chemical inhibitors during the acylation reaction, we can quantify enzymatic inhibition based on a reduction of the fluorescence signal. Importantly, this reaction is scalable, allowing for high throughput screening of potential inhibitors for HAT1 enzymatic activity.

Quick and accurate chemical assays to screen for specific inhibitors are an important tool in the drug development arsenal. Here, we present a scalable acetyl-click chemistry assay to measure the inhibition of HAT1 acetylation activity.