Name: Autor im Rampenlicht: Entwicklung eines Acetyl-Click-Assays für das HAT1-Inhibitor-Screening
Uploaded: 2024-01-26T14:20:00
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Wir danken George Zheng für die Bereitstellung von H4K12CoA. Wir danken den Mitgliedern des Gruber Lab für hilfreiche Diskussionen und Feedback. Wir danken der Unterstützung durch das NIH/NCI (1K08CA245024), CPRIT (RR200090) und die V Foundation (V2022-022).

1. Methode 1: Herstellung und Aufreinigung des rekombinanten HAT1/Rbap46-Komplexes
<ol><li>Auftauen, Wiederherstellen und Expandieren von HEK293f-Zellen<ol><li>Auftauen von 1-10 Millionen HEK293f-Säugetierzellen26 in 30-ml-Freestyle-293-Expressionsmedien in einem 100-ml-Kolben. Inkubieren Sie in 8 % CO2 bei 37 °C und drehen Sie bei 60 U/min.</li>
		<li>Zählen und überprüfen Sie am nächsten Tag die Lebensfähigkeit der Zellen und stellen Sie dann die Rotationsges...

Entwicklung eines Click-basierten Assays zum Screening der HAT1-Enzymaktivität

<ol>
	<li>Kleff, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+gene+encoding+a+yeast+histone+H4+acetyltransferase.">Identification of a gene encoding a yeast histone H4 acetyltransferase.</a> J Biol Chem. 270 (42), 24674-24677 (1995).</li><li>Parthun, M. R., Widom, J., Gottschling, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+major+cytoplasmic+histone+acetyltransferase+in+yeast:+links+to+chromatin+replication+and+histone+metabolism.">The major cytoplasmic histone acetyltransferase in yeast: links to chromatin replication and histone metabolism.</a> Cell. 87 (1), 85-94 (1996).</li><li>Verreault, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleosomal+DNA+regulates+the+core-histone-binding+subunit+of+the+human+Hat1+acetyltransferase.">Nucleosomal DNA regulates the core-histone-binding subunit of the human Hat1 acetyltransferase.</a> Curr Biol. 8 (2), 96-108 (1998).</li><li>Parthun, M. 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J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HAT1+coordinates+histone+production+and+acetylation+via+H4+promoter+binding.">HAT1 coordinates histone production and acetylation via H4 promoter binding.</a> Mol Cell. 75 (4), 711-724 e5 (2019).</li><li>Fan, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overexpressed+histone+acetyltransferase+1+regulates+cancer+immunity+by+increasing+programmed+death-ligand+1+expression+in+pancreatic+cancer.">Overexpressed histone acetyltransferase 1 regulates cancer immunity by increasing programmed death-ligand 1 expression in pancreatic cancer.</a> J Exp Clin Cancer Res. 38 (1), 47 (2019).</li><li>Xia, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA-377+exerts+a+potent+suppressive+role+in+osteosarcoma+through+the+involvement+of+the+histone+acetyltransferase+1-mediated+Wnt+axis.">MicroRNA-377 exerts a potent suppressive role in osteosarcoma through the involvement of the histone acetyltransferase 1-mediated Wnt axis.</a> J Cell Physiol. 234 (12), 22787-22798 (2019).</li><li>Yang, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+acetyltransferase+1+is+a+succinyltransferase+for+histones+and+non-histones+and+promotes+tumorigenesis.">Histone acetyltransferase 1 is a succinyltransferase for histones and non-histones and promotes tumorigenesis.</a> EMBO Rep. 22 (2), e50967 (2021).</li><li>Xue, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNAi+screening+identifies+HAT1+as+a+potential+drug+target+in+esophageal+squamous+cell+carcinoma.">RNAi screening identifies HAT1 as a potential drug target in esophageal squamous cell carcinoma.</a> Int J Clin Exp Pathol. 7 (7), 3898-3907 (2014).</li><li>Zhang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+plasticity+of+histones+H3-H4+facilitates+their+allosteric+exchange+between+RbAp48+and+ASF1.">Structural plasticity of histones H3-H4 facilitates their allosteric exchange between RbAp48 and ASF1.</a> Nat Struct Mol Biol. 20 (1), 29-35 (2013).</li><li>Campos, E. 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L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assay+interference+and+off-target+liabilities+of+reported+histone+acetyltransferase+inhibitors.">Assay interference and off-target liabilities of reported histone acetyltransferase inhibitors.</a> Nat Commun. 8 (1), 1527 (2017).</li><li>Baell, J. B., Miao, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+acetyltransferase+inhibitors:+where+art+thou.">Histone acetyltransferase inhibitors: where art thou.</a> Future Med Chem. 8 (13), 1525-1528 (2016).</li><li>Lasko, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+of+a+selective+catalytic+p300/CBP+inhibitor+that+targets+lineage-specific+tumours.">Discovery of a selective catalytic p300/CBP inhibitor that targets lineage-specific tumours.</a> Nature. 550 (7674), 128-132 (2017).</li><li>Baell, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibitors+of+histone+acetyltransferases+KAT6A/B+induce+senescence+and+arrest+tumour+growth.">Inhibitors of histone acetyltransferases KAT6A/B induce senescence and arrest tumour growth.</a> Nature. 560 (7717), 253-257 (2018).</li><li>Falk, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+efficient+high-throughput+screening+method+for+MYST+family+acetyltransferases,+a+new+class+of+epigenetic+drug+targets.">An efficient high-throughput screening method for MYST family acetyltransferases, a new class of epigenetic drug targets.</a> J Biomol Screen. 16 (10), 1196-1205 (2011).</li><li>He, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+biology+approaches+for+investigating+the+functions+of+lysine+acetyltransferases.">Chemical biology approaches for investigating the functions of lysine acetyltransferases.</a> Angew Chem Int Ed Engl. 57 (5), 1162-1184 (2018).</li><li>Lipchik, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+peptide-based+biosensor+assay+to+detect+intracellular+Syk+kinase+activation+and+inhibition.">A peptide-based biosensor assay to detect intracellular Syk kinase activation and inhibition.</a> Biochemistry. 51 (38), 7515-7524 (2012).</li><li>Song, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemoproteomic+profiling+of+protein+substrates+of+a+major+lysine+acetyltransferase+in+the+native+cellular+context.">Chemoproteomic profiling of protein substrates of a major lysine acetyltransferase in the native cellular context.</a> ACS Chem Biol. 17 (5), 1092-1102 (2022).</li><li>Gaddameedi, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acetyl-click+screening+platform+identifies+small-molecule+inhibitors+of+histone+acetyltransferase+1+(HAT1).">Acetyl-click screening platform identifies small-molecule inhibitors of histone acetyltransferase 1 (HAT1).</a> J Med Chem. 66 (8), 5774-5801 (2023).</li><li>Ngo, L., Brown, T., Zheng, Y. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bisubstrate+inhibitors+to+target+histone+acetyltransferase+1+(HAT1).">Bisubstrate inhibitors to target histone acetyltransferase 1 (HAT1).</a> Chem Biol Drug Des. 93 (5), 865-873 (2019).</li><li>Parker, C. G., Pratt, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Click+chemistry+in+proteomic+investigations.">Click chemistry in proteomic investigations.</a> Cell. 180 (4), 605-632 (2020).</li><li>Islam, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+bump-and-hole+tactic:+Expanding+the+scope+of+chemical+genetics.">The bump-and-hole tactic: Expanding the scope of chemical genetics.</a> Cell Chem Biol. 25 (10), 1171-1184 (2018).</li><li>Radziwon, K., Weeks, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+engineering+for+selective+proteomics.">Protein engineering for selective proteomics.</a> Curr Opin Chem Biol. 60, 10-19 (2021).</li><li>Rich, R. L., Myszka, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Survey+of+the+year+2007+commercial+optical+biosensor+literature.">Survey of the year 2007 commercial optical biosensor literature.</a> J Mol Recognit. 21 (6), 355-400 (2008).</li></ol>

In den letzten zehn Jahren wurde die Klickchemie prominent20 und ermöglichte das präzise Design wechselwirkender chemischer Strukturen. In diesem Zusammenhang haben sich verschiedene bioorthogonale kovalente Verbindungen21 als vielversprechende Optionen für die Bildung von Komplexen in ihrer natürlichen Umgebung herausgestellt. Die Click-Chemie verwendet Paare funktioneller Gruppen, die schnelle und selektive Reaktionen zeigen, die allgemein als "Click-Reaktionen" bekan...

Unter den zahlreichen eukaryotischen Acetyltransferasen war HAT1 die erste Histonacetyltransferase, die isoliert wurde 1,2,3. Nachfolgende Untersuchungen haben seine zentrale Rolle bei der Chromatinreplikation, insbesondere bei der Synthese neuer Nukleosomen während der S-Phase4, fest etabliert. Unsere Forschungsbemühungen führten zu der Erkenntnis, dass HAT1 durch die Behandlung mit dem epidermalen Wachstumsfaktor (EGF) in Brustzellen stark stimuliert wird5. Darüber hinaus hat sich herausgestellt, dass HAT1 für die schnelle Zellproliferation und Tumorbildung in vivo benötigt wird 6,7,8,9. Die Daten deuten darauf hin, dass HAT1 entscheidend für die Koordination anaboler und epigenetischer Prozesse für die Zellteilung ist und das Tumorwachstum vorantreibt.
HAT1 diacetyliert den aminoterminalen Schwanz des Histons H4 an den Lysinen 5 und 12 im Komplex mit dem Chaperonprotein Rbap46, das das Histon bindet und den Aminoterminus an HAT1 präsentiert. Histontetramere oder Disome10 werden dann zusammen mit HAT1/Rbap46 und anderen Histon-Chaperonen11 in den Zellkern importiert. Histone werden dann freigesetzt, um an der Replikationsgabel oder an anderen Stellen abgelagert zu werden, um die Genaktivierung oder -unterdrückung zu unterstützen. Die Funktion der HAT1-Diacetylierungsmarkierung auf Histon H4 ist nicht vollständig verstanden. Es wird wahrscheinlich innerhalb einer Spanne von 15-30 Minuten durch die Wirkung der Histon-Deacetylasen 12,13,14,15 schnell entfernt, nachdem H4 in das Chromatin eingefügt wurde. Daher wird die HAT1-Diacetylierungsmarkierung im Chromatin nicht propagiert und spielt möglicherweise keine echte epigenetische Rolle, obwohl eine Rolle bei der Rekrutierung von Chromatin-modifizierenden Enzymen für naszierendes Chromatin postuliert wurde12. Außerdem acetyliert HAT1 Chromatin nicht direkt; seine Aktivität ist auf lösliche Histone beschränkt.
Die Entwicklung von niedermolekularen Histon-Acetyltransferase-Inhibitoren wurde durch unspezifische Assays und Assays mit niedrigem Durchsatz behindert, was häufig zur Erzeugung biologisch reaktiver Verbindungen führte16,17. Der Goldstandard-Assay zur Messung der Acetyltransferase-Aktivitäten erfordert die Verwendung von 3-H-Acetyl-coA, was den Durchsatz begrenzt und Strahlung erfordert. Nichtsdestotrotz wurden kürzlich spezifische und hochwirksame niedermolekulare Acetyltransferase-Inhibitoren beschrieben, die auf CBP/p30018 und KAT6A/B19,20 abzielen und durch die Verwendung von 3-H-Acetyl-CoA bestätigt wurden. In Zukunft werden verbesserte Assays entwickelt, um einen besseren Durchsatz zu erzielen und Laborgefahren zu vermeiden.
Jüngste Fortschritte in der Acetylierungsüberwachung21 haben die Click-Chemie verwendet, um die Überwachung enzymatischer Reaktionen zu ermöglichen. Es gibt eine Vielzahl von klickfähigen Vorläufern, die über einfache Synthesewege zugänglich oder käuflich zu erwerben sind und in Enzymreaktionen eingebaut werden können. Diese Reaktionen werden typischerweise in rekombinanten Systemen durchgeführt, obwohl auch zellbasierte Assays möglich sind22. Der Vorteil von klickfähigen Co-Faktoren und Substraten besteht darin, dass das Screening die Enzymaktivität direkt messen kann, ohne dass gekoppelte Auslesesysteme erforderlich sind, die oft durch das Screening von Verbindungen gestört werden und zusätzliche Handhabungsschritte erfordern. Dies ermöglicht Inhibitorbehandlungen nur während des enzymatischen Schritts, während alle nachgeschalteten Funktionalisierungs- und Detektionsschritte nach umfangreichem Waschen durchgeführt werden, um Verbindungen zu entfernen, wodurch das Potenzial für Assay-Interferenzen begrenzt wird. Diese Vorteile machen das Design von klickfähigen Assays gegenüber gekoppelten Assays vorzuziehen, die üblicherweise auf dem Nachweis von freiem Coenzym A beruhen.
Eine wichtige Überlegung ist die Akzeptanz von klickfähigen Co-Faktoren im aktiven Zentrum des Enzyms. Vorhandene Co-Faktoren mit aktivierten Klicks sind möglicherweise nicht vollständig mit der aktiven Website kompatibel, die für den nativen Co-Faktor optimiert ist. Strukturelle Informationen und Modellierung können verwendet werden, um Aminosäuresubstitutionen zu entwerfen, um das aktive Zentrum zu vergrößern und veränderte Substrate aufzunehmen23. Dies kann ein Screening mit verbesserter Enzymkinetik und niedrigeren Substrat- und Enzymspiegeln ermöglichen. Der Nachteil dieses Ansatzes besteht darin, dass veränderte katalytische Taschen möglicherweise keine Inhibitoren identifizieren, die stark mit dem nativen Enzym interagieren. Letztendlich ist eine Kombination von Ansätzen erforderlich, um potenzielle Enzyminhibitoren zu identifizieren und zu validieren.
Hier beschreiben wir eine Methode, die entwickelt wurde, um die HAT1-Enzymaktivität mit dem Click-Co-Faktor 4-Pentynoyl-CoA24 zu reinigen und zu testen. Dieser Assay (Abbildung 1) verwendet die native Enzymsequenz im Komplex mit dem erforderlichen Partnerprotein Rbap46, das nachweislich die Enzymaktivität steigert. Die Reinigung des Enzyms aus menschlichen Zellen ermöglicht eine Enzymaktivierung in Cellulo, wodurch stimulierende posttranslationale Modifikationen erhalten bleiben können, die für die volle Enzymaktivität wichtig sind. Das Design und die Optimierung rekombinanter Enzymassays für chemische Hochdurchsatz-Screenings wurden erfolgreich zur Identifizierung und Charakterisierung von niedermolekularen HAT1-Inhibitoren eingesetzt.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>4P CoA</td>
			<td>Cayman Chemical</td>
			<td>10547</td>
			<td>Click chemistry co-factor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amplex Red</td>
			<td>Fisher Sci</td>
			<td>A12222</td>
			<td>Fluorescence substrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin-PEG-Azide</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>J64996MC</td>
			<td>Click chemistry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Copper Sulfate</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>&#160;7758-98-7</td>
			<td>Click chemistry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>&#160;67-68-5</td>
			<td>diluent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>03-12-3483</td>
			<td>reducting agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forskolin</td>
			<td>VWR</td>
			<td>102987-310</td>
			<td>Protein expression</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freestyle 293 Expression Medium</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>12338018</td>
			<td>Media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freestyle 293-F cells</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>R790-07</td>
			<td>Protein expression</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H4-peptide/1-23-GGK-biotin</td>
			<td>Anaspec</td>
			<td>AS65097</td>
			<td>peptide substrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>&#160;7365-45-9</td>
			<td>EB buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen peroxide 30% solution</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>&#160;Z00183-99-0</td>
			<td>initiator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M2 FLAG antibody slurry</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>A2220</td>
			<td>Protein purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Macrosep 10K Filter (Pall Lab)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89131-980</td>
			<td>Protein purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neutravidin Plate</td>
			<td>Thermo Sci</td>
			<td>15127</td>
			<td>BSA-pre-blocked</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NP40 (IGEPAL)</td>
			<td>MP Biomedical</td>
			<td>198596</td>
			<td>20x buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pHEK-293 plasmid</td>
			<td>Takara Bio</td>
			<td>3390</td>
			<td>Protein expression</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline 10x</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>&#160;Z00082-33-6</td>
			<td>wash buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pra peptide</td>
			<td>Genscript</td>
			<td>Custom synthesis</td>
			<td>biotinylated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Ascorbate</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>&#160;134-03-2</td>
			<td>Click chemistry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>&#160;7647-14-5</td>
			<td>EB buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>7558-80-7</td>
			<td>buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>189730</td>
			<td>competitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin-HRP</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>3999S</td>
			<td>enzyme</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>THPTA ligand</td>
			<td>Fisher Sci</td>
			<td>1010-500</td>
			<td>Click chemistry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris base</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>&#160;77-86-1</td>
			<td>20x buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton-X 100</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>&#160;9002-93-1</td>
			<td>EB buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>&#160;9005-64-5</td>
			<td>Wash buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>57-13-6</td>
			<td>quencher</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an acetyl-click chemistry assay to measure histone acetyltransferase 1 acetylation

HAT1, auch bekannt als Histon-Acetyltransferase 1, spielt eine entscheidende Rolle bei der Chromatinsynthese, indem es naszierendes H4 vor dem Nukleosomenaufbau stabilisiert und acetyliert. Es wird für das Tumorwachstum in verschiedenen Systemen benötigt, was es zu einem potenziellen Ziel für die Krebsbehandlung macht. Um die Identifizierung von Verbindungen zu erleichtern, die die enzymatische Aktivität von HAT1 hemmen können, haben wir einen Acetyl-Click-Assay für ein schnelles Screening entwickelt. In diesem einfachen Assay verwenden wir rekombinantes HAT1/Rbap46, das aus aktivierten menschlichen Zellen aufgereinigt wird. Das Verfahren nutzt das Acetyl-CoA-Analogon 4-Pentynoyl-CoA (4P) in einem Click-Chemie-Ansatz. Dabei handelt es sich um den enzymatischen Transfer eines Alkingriffs durch eine HAT1-abhängige Acylierungsreaktion auf ein biotinyliertes H4 N-terminales Peptid. Das eingefangene Peptid wird dann auf Neutravidinplatten immobilisiert, gefolgt von einer Click-Chemie-Funktionalisierung mit Biotin-Azid. Anschließend wird Amplexrot durch Streptavidin-Peroxidase-Rekrutierung oxidiert, was zu einer quantitativen Fluoreszenzleistung führt. Durch das Einbringen chemischer Inhibitoren während der Acylierungsreaktion können wir die enzymatische Hemmung basierend auf einer Verringerung des Fluoreszenzsignals quantifizieren. Wichtig ist, dass diese Reaktion skalierbar ist und ein Hochdurchsatz-Screening potenzieller Inhibitoren auf enzymatische Aktivität von HAT1 ermöglicht.

Among the numerous eukaryotic acetyltransferases, HAT1 was the initial histone acetyltransferase to be isolated1,2,3. Subsequent investigations have firmly established its pivotal role in chromatin replication, particularly in the synthesis of new nucleosomes during S-phase4. Our research endeavors led to the recognition that HAT1 is highly stimulated by epidermal growth factor (EGF) treatment in mammary cells5. Furthermore, it has come to light that HAT1 is required for rapid cell proliferation and tumor formation in vivo6,7,8,9. Data indicate that HAT1 is critical in coordinating anabolic and epigenetic processes for cell division, driving tumor growth.
HAT1 di-acetylates the amino-terminal tail of histone H4 on lysines 5 and 12 in complex with the chaperone protein Rbap46, which binds the histone and presents the amino-terminus to HAT1. Histone tetramers or disomes10, together with HAT1/Rbap46 and other histone chaperones11, are then imported to the nucleus. Histones are then released to be deposited at the replication fork, or other sites to support gene activation or repression. The function of the HAT1 di-acetylation mark on histone H4 is not fully understood. It is likely quickly removed within a span of 15-30 min by the action of histone deacetylases12,13,14,15 after H4 is inserted into chromatin. Thus, the HAT1 di-acetylation mark is not propagated in chromatin and may not serve a true epigenetic role, although a role in the recruitment of chromatin-modifying enzymes to nascent chromatin has been postulated12. Also, HAT1 does not directly acetylate chromatin; its activity is restricted to soluble histones.
The development of small-molecule histone acetyltransferase inhibitors has been hampered by nonspecific and low-throughput assays, often resulting in the generation of biologically reactive compounds16,17.&#160;The gold-standard assay to measure acetyltransferase activities requires the use of 3H-acetyl-coA, which limits throughput and requires radiation. Nonetheless, recently, specific and highly potent small molecule acetyltransferase inhibitors targeting CBP/p30018 and KAT6A/B19,20 have been described and confirmed through the use of 3H-acetyl-CoA. Moving forward, improved assays to achieve better throughput and avoid laboratory hazards are being devised.
Recent advances in acetylation monitoring21 have used click chemistry to enable enzymatic reaction monitoring. There are a variety of click-enabled precursors that are accessible by simple synthetic routes or available for purchase that can be incorporated into enzyme reactions. These reactions are typically carried out in recombinant systems, although cell-based assays are also feasible22. The advantage of click-enabled co-factors and substrates is that screening can directly measure enzyme activity without the need for coupled read-out systems that are often perturbed by screening compounds and require additional handling steps. This allows for inhibitor treatments only during the enzymatic step, whereas all downstream functionalization and detection steps are carried out after extensive washing to remove compounds, thus limiting the potential for assay interference to occur. These advantages make the design of click-enabled assays preferable to coupled assays that commonly rely on the detection of free coenzyme A.
One important consideration is the acceptance of click-enabled co-factors into the enzyme active site. Existing click-enabled co-factors may not be fully compatible with the active site optimized for the native co-factor. Structural information and modeling can be used to design amino acid substitutions to enlarge the active site to incorporate altered substrates23. This may enable screening with improved enzyme kinetics and lower substrate and enzyme levels. The drawback of this approach is that altered catalytic pockets may not identify inhibitors that interact strongly with the native enzyme. Ultimately, a combination of approaches is required to identify and validate potential enzyme inhibitors.
Here, we describe a method developed to purify and assay HAT1 enzyme activity using the click co-factor 4-pentynoyl-CoA24. This assay (Figure 1) uses the native enzyme sequence in complex with its required partner protein Rbap46, which has been shown to boost enzyme activity. Purification of the enzyme from human cells allows for enzyme activation in cellulo, which may preserve stimulating post-translational modifications important for full enzyme activity. Design and optimization of recombinant enzyme assays for high-throughput chemical screens have successfully been used to identify and characterize HAT1 small molecule inhibitors.

Autor im Rampenlicht: Entwicklung eines Acetyl-Click-Assays für das HAT1-Inhibitor-Screening

Ein Acetyl-Click-Chemie-Assay zur Messung der Histon-Acetyltransferase-1-Acetylierung

Our developed acetyl-click assay serves as a tool to assess HAT1 acetyl transferase activity, which is key in isolating H4 histones before nucleosome incorporation. We aim to use this method for high throughput screening of small molecule inhibitors against the HAT1 enzyme. This method measures enzymatic activity directly on the peptide substrate.This offers advantages compared to other enzymatic assays by avoiding biologic variability and antibody related costs. This is also high throughput and can be adapted to use with other acetyl transferases. We have recently published a small molecule HAT1 inhibitor based on this assay that has activity in cells and animals.We continue to use this assay to screen additional chemical libraries and perform structure activity relationships. We are advancing methods to track histone production, folding, chaperoning, and chromatin integration. This highlights the need for improved chemical tools to explore biological mechanisms and stimulate drug discovery.Our goal is to demonstrate that targeting histone production can have therapeutic benefit for diseases such as cancer.

Standardkurven in doppelter Ausführung (16 Wells) sollten auf jeder Platte enthalten sein, um eine ordnungsgemäße Testleistung zu gewährleisten. Die Standardkurvendaten sollten in Tabellenform mit einem Bereich von 100 % bis 0 % entsprechend dem Verhältnis von Pra-haltigem Peptid zu nativem H4-Peptid in Lösung erstellt werden (Tabelle 1). Das rote Signal von Amplex ist das höchste in 100 % pra/0 % nativen H4-Peptid-Wells und das niedrigste in 0 % pra/100 % nativen H4-Peptid-Wells. Nachdem die Fluo...

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Schnelle und genaue chemische Assays zum Screening auf bestimmte Inhibitoren sind ein wichtiges Instrument in der Arzneimittelentwicklung. Hier präsentieren wir einen skalierbaren Acetyl-Click-Chemie-Assay zur Messung der Hemmung der HAT1-Acetylierungsaktivität.

HAT1, also known as Histone acetyltransferase 1, plays a crucial role in chromatin synthesis by stabilizing and acetylating nascent H4 before nucleosome ...

Unser entwickelter Acetyl-Click-Assay dient als Werkzeug zur Beurteilung der HAT1-Acetyltransferase-Aktivität, die für die Isolierung von H4-Histonen vor dem Einbau von Nukleosomen entscheidend ist. Wir wollen diese Methode für das Hochdurchsatz-Screening von niedermolekularen Inhibitoren gegen das HAT1-Enzym nutzen. Diese Methode misst die enzymatische Aktivität direkt auf dem Peptidsubstrat.Dies bietet Vorteile gegenüber anderen enzymatischen Assays, da biologische Variabilität und antikörperbezogene Kosten vermieden werden. Dies ist auch ein hoher Durchsatz und kann für die Verwendung mit anderen Acetyltransferasen angepasst werden. Wir haben kürzlich einen niedermolekularen HAT1-Inhibitor veröffentlicht, der auf diesem Assay basiert und in Zellen und Tieren aktiv ist.Wir verwenden diesen Assay weiterhin, um zusätzliche chemische Bibliotheken zu screenen und Struktur-Aktivitäts-Beziehungen durchzuführen. Wir entwickeln Methoden zur Verfolgung der Histonproduktion, der Faltung, des Chaperonings und der Chromatinintegration weiter. Dies unterstreicht die Notwendigkeit verbesserter chemischer Werkzeuge, um biologische Mechanismen zu erforschen und die Arzneimittelforschung zu stimulieren.Unser Ziel ist es, zu zeigen, dass die gezielte Histonproduktion einen therapeutischen Nutzen für Krankheiten wie Krebs haben kann.

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Research

JoVE Journal

Biochemistry

An Acetyl-Click Chemistry Assay to Measure Histone Acetyltransferase 1 Acetylation

HAT1, also known as Histone acetyltransferase 1, plays a crucial role in chromatin synthesis by stabilizing and acetylating nascent H4 before nucleosome assembly. It is required for tumor growth in various systems, making it a potential target for cancer treatment. To facilitate the identification of compounds that can inhibit HAT1 enzymatic activity, we have devised an acetyl-click assay for rapid screening. In this simple assay, we employ recombinant HAT1/Rbap46, which is purified from activated human cells. The method utilizes the acetyl-CoA analog 4-pentynoyl-CoA (4P) in a click-chemistry approach. This involves the enzymatic transfer of an alkyne handle through a HAT1-dependent acylation reaction to a biotinylated H4 N-terminal peptide. The captured peptide is then immobilized on neutravidin plates, followed by click-chemistry functionalization with biotin-azide. Subsequently, streptavidin-peroxidase recruitment is employed to oxidize amplex red, resulting in a quantitative fluorescent output. By introducing chemical inhibitors during the acylation reaction, we can quantify enzymatic inhibition based on a reduction of the fluorescence signal. Importantly, this reaction is scalable, allowing for high throughput screening of potential inhibitors for HAT1 enzymatic activity.

Quick and accurate chemical assays to screen for specific inhibitors are an important tool in the drug development arsenal. Here, we present a scalable acetyl-click chemistry assay to measure the inhibition of HAT1 acetylation activity.