Name: लेखक स्पॉटलाइट: HAT1 अवरोधक स्क्रीनिंग के लिए एसिटाइल-क्लिक परख विकसित करना
Uploaded: 2024-01-26T14:20:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Author Spotlight: Developing Acetyl-Click Assay for HAT1 Inhibitor Screening at JoVE.com

हम H4K12CoA प्रदान करने के लिए जॉर्ज झेंग को धन्यवाद देते हैं। हम उपयोगी चर्चा और प्रतिक्रिया के लिए ग्रुबर लैब के सदस्यों को धन्यवाद देते हैं। हम एनआईएच/एनसीआई (1K08CA245024), CPRIT (RR200090), और V फाउंडेशन (V2022-022) के समर्थन का धन्यवाद करते हैं।

1. विधि 1: पुनः संयोजक HAT1/Rbap46 कॉम्प्लेक्स का उत्पादन और शुद्धिकरण
<ol><li>HEK293f कोशिकाओं को विगलन, पुनर्प्राप्त और विस्तारित करना<ol><li>पिघलना 1-10 मिलियन HEK293f स्तनधारी कोशिकाओं26 में 30 एमएल फ्रीस्टाइल 293 ?...

स्क्रीनिंग HAT1 एंजाइम गतिविधि के लिए एक क्लिक आधारित परख का विकास

<ol>
	<li>Kleff, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+gene+encoding+a+yeast+histone+H4+acetyltransferase.">Identification of a gene encoding a yeast histone H4 acetyltransferase.</a> J Biol Chem. 270 (42), 24674-24677 (1995).</li><li>Parthun, M. R., Widom, J., Gottschling, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+major+cytoplasmic+histone+acetyltransferase+in+yeast:+links+to+chromatin+replication+and+histone+metabolism.">The major cytoplasmic histone acetyltransferase in yeast: links to chromatin replication and histone metabolism.</a> Cell. 87 (1), 85-94 (1996).</li><li>Verreault, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleosomal+DNA+regulates+the+core-histone-binding+subunit+of+the+human+Hat1+acetyltransferase.">Nucleosomal DNA regulates the core-histone-binding subunit of the human Hat1 acetyltransferase.</a> Curr Biol. 8 (2), 96-108 (1998).</li><li>Parthun, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+acetyltransferase+1:+more+than+just+an+enzyme.">Histone acetyltransferase 1: more than just an enzyme.</a> Biochim Biophys Acta. 1819 (3-4), 256-263 (2013).</li><li>Gruber, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HAT1+coordinates+histone+production+and+acetylation+via+H4+promoter+binding.">HAT1 coordinates histone production and acetylation via H4 promoter binding.</a> Mol Cell. 75 (4), 711-724 e5 (2019).</li><li>Fan, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overexpressed+histone+acetyltransferase+1+regulates+cancer+immunity+by+increasing+programmed+death-ligand+1+expression+in+pancreatic+cancer.">Overexpressed histone acetyltransferase 1 regulates cancer immunity by increasing programmed death-ligand 1 expression in pancreatic cancer.</a> J Exp Clin Cancer Res. 38 (1), 47 (2019).</li><li>Xia, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA-377+exerts+a+potent+suppressive+role+in+osteosarcoma+through+the+involvement+of+the+histone+acetyltransferase+1-mediated+Wnt+axis.">MicroRNA-377 exerts a potent suppressive role in osteosarcoma through the involvement of the histone acetyltransferase 1-mediated Wnt axis.</a> J Cell Physiol. 234 (12), 22787-22798 (2019).</li><li>Yang, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+acetyltransferase+1+is+a+succinyltransferase+for+histones+and+non-histones+and+promotes+tumorigenesis.">Histone acetyltransferase 1 is a succinyltransferase for histones and non-histones and promotes tumorigenesis.</a> EMBO Rep. 22 (2), e50967 (2021).</li><li>Xue, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNAi+screening+identifies+HAT1+as+a+potential+drug+target+in+esophageal+squamous+cell+carcinoma.">RNAi screening identifies HAT1 as a potential drug target in esophageal squamous cell carcinoma.</a> Int J Clin Exp Pathol. 7 (7), 3898-3907 (2014).</li><li>Zhang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+plasticity+of+histones+H3-H4+facilitates+their+allosteric+exchange+between+RbAp48+and+ASF1.">Structural plasticity of histones H3-H4 facilitates their allosteric exchange between RbAp48 and ASF1.</a> Nat Struct Mol Biol. 20 (1), 29-35 (2013).</li><li>Campos, E. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+program+for+processing+newly+synthesized+histones+H3.1+and+H4.">The program for processing newly synthesized histones H3.1 and H4.</a> Nat Struct Mol Biol. 17 (11), 1343-1351 (2010).</li><li>Agudelo Garcia, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+multiple+roles+for+histone+acetyltransferase+1+in+replication-coupled+chromatin+assembly.">Identification of multiple roles for histone acetyltransferase 1 in replication-coupled chromatin assembly.</a> Nucleic Acids Res. 45 (16), 9319-9335 (2017).</li><li>Nagarajan, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+acetyl+transferase+1+is+essential+for+mammalian+development,+genome+stability,+and+the+processing+of+newly+synthesized+histones+H3+and+H4.">Histone acetyl transferase 1 is essential for mammalian development, genome stability, and the processing of newly synthesized histones H3 and H4.</a> PLoS Genet. 9 (6), e1003518 (2013).</li><li>Annunziato, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembling+chromatin:+the+long+and+winding+road.">Assembling chromatin: the long and winding road.</a> Biochim Biophys Acta. 1819 (3-4), 196-210 (2013).</li><li>Annunziato, A. T., Seale, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+deacetylation+is+required+for+the+maturation+of+newly+replicated+chromatin.">Histone deacetylation is required for the maturation of newly replicated chromatin.</a> J Biol Chem. 258 (20), 12675-12684 (1983).</li><li>Dahlin, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assay+interference+and+off-target+liabilities+of+reported+histone+acetyltransferase+inhibitors.">Assay interference and off-target liabilities of reported histone acetyltransferase inhibitors.</a> Nat Commun. 8 (1), 1527 (2017).</li><li>Baell, J. B., Miao, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+acetyltransferase+inhibitors:+where+art+thou.">Histone acetyltransferase inhibitors: where art thou.</a> Future Med Chem. 8 (13), 1525-1528 (2016).</li><li>Lasko, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+of+a+selective+catalytic+p300/CBP+inhibitor+that+targets+lineage-specific+tumours.">Discovery of a selective catalytic p300/CBP inhibitor that targets lineage-specific tumours.</a> Nature. 550 (7674), 128-132 (2017).</li><li>Baell, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibitors+of+histone+acetyltransferases+KAT6A/B+induce+senescence+and+arrest+tumour+growth.">Inhibitors of histone acetyltransferases KAT6A/B induce senescence and arrest tumour growth.</a> Nature. 560 (7717), 253-257 (2018).</li><li>Falk, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+efficient+high-throughput+screening+method+for+MYST+family+acetyltransferases,+a+new+class+of+epigenetic+drug+targets.">An efficient high-throughput screening method for MYST family acetyltransferases, a new class of epigenetic drug targets.</a> J Biomol Screen. 16 (10), 1196-1205 (2011).</li><li>He, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+biology+approaches+for+investigating+the+functions+of+lysine+acetyltransferases.">Chemical biology approaches for investigating the functions of lysine acetyltransferases.</a> Angew Chem Int Ed Engl. 57 (5), 1162-1184 (2018).</li><li>Lipchik, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+peptide-based+biosensor+assay+to+detect+intracellular+Syk+kinase+activation+and+inhibition.">A peptide-based biosensor assay to detect intracellular Syk kinase activation and inhibition.</a> Biochemistry. 51 (38), 7515-7524 (2012).</li><li>Song, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemoproteomic+profiling+of+protein+substrates+of+a+major+lysine+acetyltransferase+in+the+native+cellular+context.">Chemoproteomic profiling of protein substrates of a major lysine acetyltransferase in the native cellular context.</a> ACS Chem Biol. 17 (5), 1092-1102 (2022).</li><li>Gaddameedi, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acetyl-click+screening+platform+identifies+small-molecule+inhibitors+of+histone+acetyltransferase+1+(HAT1).">Acetyl-click screening platform identifies small-molecule inhibitors of histone acetyltransferase 1 (HAT1).</a> J Med Chem. 66 (8), 5774-5801 (2023).</li><li>Ngo, L., Brown, T., Zheng, Y. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bisubstrate+inhibitors+to+target+histone+acetyltransferase+1+(HAT1).">Bisubstrate inhibitors to target histone acetyltransferase 1 (HAT1).</a> Chem Biol Drug Des. 93 (5), 865-873 (2019).</li><li>Parker, C. G., Pratt, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Click+chemistry+in+proteomic+investigations.">Click chemistry in proteomic investigations.</a> Cell. 180 (4), 605-632 (2020).</li><li>Islam, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+bump-and-hole+tactic:+Expanding+the+scope+of+chemical+genetics.">The bump-and-hole tactic: Expanding the scope of chemical genetics.</a> Cell Chem Biol. 25 (10), 1171-1184 (2018).</li><li>Radziwon, K., Weeks, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+engineering+for+selective+proteomics.">Protein engineering for selective proteomics.</a> Curr Opin Chem Biol. 60, 10-19 (2021).</li><li>Rich, R. L., Myszka, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Survey+of+the+year+2007+commercial+optical+biosensor+literature.">Survey of the year 2007 commercial optical biosensor literature.</a> J Mol Recognit. 21 (6), 355-400 (2008).</li></ol>

पिछले दशक में, क्लिक रसायन विज्ञान प्रमुख20 बन गया, जिससे रासायनिक संरचनाओं के अंतःक्रियात्मक सटीक डिजाइन को सक्षम किया गया। इस संदर्भ में, विभिन्न बायोऑर्थोगोनल सहसंयोजक कनेक्शन21 अ...

कई यूकेरियोटिक एसिटाइलट्रांसफेरस के बीच, HAT1 1,2,3 को अलग करने वाला प्रारंभिक हिस्टोन एसिटाइलट्रांसफेरेज़ था। बाद की जांच ने क्रोमैटिन प्रतिकृति में अपनी महत्वपूर्ण भूमिका को मजबूती से स्थापित किया है, विशेष रूप से एस-चरण4 के दौरान नए न्यूक्लियोसोम के संश्लेषण में। हमारे शोध प्रयासों ने मान्यता दी कि एचएटी 1 स्तन कोशिकाओं में एपिडर्मल ग्रोथ फैक्टर (ईजीएफ) उपचार द्वारा अत्यधिक उत्तेजित है5. इसके अलावा, यह प्रकाश में आया है कि एचएटी 1 तेजी से सेल प्रसार और विवो 6,7,8,9 में ट्यूमर गठन के लिए आवश्यक है। डेटा से संकेत मिलता है कि HAT1 कोशिका विभाजन के लिए एनाबॉलिक और एपिजेनेटिक प्रक्रियाओं के समन्वय में महत्वपूर्ण है, जिससे ट्यूमर का विकास होता है।
HAT1 डाइ-एसिटिलेट लाइसिन 4 और 5 पर हिस्टोन H12 की एमिनो-टर्मिनल पूंछ को चैपरोन प्रोटीन Rbap46 के साथ जटिल बनाता है, जो हिस्टोन को बांधता है और HAT1 को एमिनो-टर्मिनस प्रस्तुत करता है। हिस्टोन टेट्रामर्स या डाइसोम10, HAT1/Rbap46 और अन्य हिस्टोन चैपरोन11 के साथ, फिर नाभिक में आयात किए जाते हैं। हिस्टोन को तब प्रतिकृति कांटा, या जीन सक्रियण या दमन का समर्थन करने के लिए अन्य साइटों पर जमा करने के लिए जारी किया जाता है। हिस्टोन H4 पर HAT1 डाइ-एसिटिलीकरण चिह्न का कार्य पूरी तरह से समझा नहीं गया है। एच 4 को क्रोमैटिन में डालने के बाद हिस्टोन डेसेटाइलस 12,13,14,15 की कार्रवाई से 15-30 मिनट की अवधि के भीतर इसे जल्दी से हटा दिया जाता है। इस प्रकार, HAT1 di-acetylation चिह्न क्रोमैटिन में प्रचारित नहीं है और नवजात क्रोमैटिन के लिए क्रोमैटिन संशोधित एंजाइमों की भर्ती में एक भूमिका12 पोस्ट किया गया है, हालांकि एक सच्चे epigenetic भूमिका की सेवा नहीं हो सकता है. इसके अलावा, HAT1 सीधे क्रोमैटिन को एसीटिलेट नहीं करता है; इसकी गतिविधि घुलनशील हिस्टोन तक ही सीमित है।
छोटे-अणु हिस्टोन एसिटाइलट्रांसफेरेज़ अवरोधकों के विकास को निरर्थक और कम-थ्रूपुट परख द्वारा बाधित किया गया है, जिसके परिणामस्वरूप अक्सर जैविक रूप से प्रतिक्रियाशील यौगिकों की पीढ़ी होती है 16,17. एसिटाइलट्रांसफेरेज़ गतिविधियों को मापने के लिए स्वर्ण-मानक परख को 3एच-एसिटाइल-सीओए के उपयोग की आवश्यकता होती है, जो थ्रूपुट को सीमित करता है और विकिरण की आवश्यकता होती है। बहरहाल, हाल ही में, सीबीपी / पी 30018 और केएटी 6 ए / बी19,20 को लक्षित करने वाले विशिष्ट और अत्यधिक शक्तिशाली छोटे अणु एसिटाइलट्रांसफेरेज़ अवरोधकों को 3एच-एसिटाइल-सीओए के उपयोग के माध्यम से वर्णित और पुष्टि की गई है। आगे बढ़ते हुए, बेहतर थ्रूपुट प्राप्त करने और प्रयोगशाला के खतरों से बचने के लिए बेहतर परख तैयार की जा रही है।
एसिटिलीकरण निगरानी21 में हाल के अग्रिमों एंजाइमी प्रतिक्रिया निगरानी सक्षम करने के लिए क्लिक रसायन विज्ञान का इस्तेमाल किया है. क्लिक-सक्षम अग्रदूतों की एक किस्म है जो सरल सिंथेटिक मार्गों द्वारा सुलभ हैं या खरीद के लिए उपलब्ध हैं जिन्हें एंजाइम प्रतिक्रियाओं में शामिल किया जा सकता है। इन प्रतिक्रियाओं आम तौर पर पुनः संयोजक प्रणालियों में किया जाता है, हालांकि सेल आधारित assays भीसंभव 22 कर रहे हैं. क्लिक-सक्षम सह-कारकों और सब्सट्रेट का लाभ यह है कि स्क्रीनिंग सीधे युग्मित रीड-आउट सिस्टम की आवश्यकता के बिना एंजाइम गतिविधि को माप सकती है जो अक्सर स्क्रीनिंग यौगिकों से परेशान होती है और अतिरिक्त हैंडलिंग चरणों की आवश्यकता होती है। यह केवल एंजाइमी कदम के दौरान अवरोधक उपचार के लिए अनुमति देता है, जबकि सभी डाउनस्ट्रीम फंक्शनलाइजेशन और डिटेक्शन चरणों को यौगिकों को हटाने के लिए व्यापक धोने के बाद किया जाता है, इस प्रकार परख हस्तक्षेप होने की संभावना को सीमित करता है। ये फायदे क्लिक-सक्षम परख के डिजाइन को युग्मित परख के लिए बेहतर बनाते हैं जो आमतौर पर मुक्त कोएंजाइम ए का पता लगाने पर भरोसा करते हैं।
एक महत्वपूर्ण विचार एंजाइम सक्रिय साइट में क्लिक-सक्षम सह-कारकों की स्वीकृति है। मौजूदा क्लिक-सक्षम सह-कारक मूल सह-कारक के लिए अनुकूलित सक्रिय साइट के साथ पूरी तरह से संगत नहीं हो सकते हैं। संरचनात्मक जानकारी और मॉडलिंग का उपयोग अमीनो एसिड प्रतिस्थापन डिजाइन करने के लिए किया जा सकता है ताकि परिवर्तित सब्सट्रेट23 को शामिल करने के लिए सक्रिय साइट को बढ़ाया जा सके। यह बेहतर एंजाइम कैनेटीक्स और कम सब्सट्रेट और एंजाइम के स्तर के साथ स्क्रीनिंग को सक्षम कर सकता है। इस दृष्टिकोण का दोष यह है कि परिवर्तित उत्प्रेरक जेब अवरोधकों की पहचान नहीं कर सकते हैं जो देशी एंजाइम के साथ दृढ़ता से बातचीत करते हैं। अंततः, संभावित एंजाइम अवरोधकों की पहचान करने और मान्य करने के लिए दृष्टिकोण के संयोजन की आवश्यकता होती है।
यहां, हम क्लिक सह-कारक 4-पेंटीनॉयल-सीओए24 का उपयोग करके HAT1 एंजाइम गतिविधि को शुद्ध और परख करने के लिए विकसित एक विधि का वर्णन करते हैं। यह परख (चित्रा 1) एंजाइम गतिविधि को बढ़ावा देने के लिए दिखाया गया है जो अपने आवश्यक साथी प्रोटीन Rbap46, के साथ जटिल में देशी एंजाइम अनुक्रम का उपयोग करता है. मानव कोशिकाओं से एंजाइम की शुद्धि सेलूलो में एंजाइम सक्रियण के लिए अनुमति देती है, जो पूर्ण एंजाइम गतिविधि के लिए महत्वपूर्ण पोस्ट-ट्रांसलेशनल संशोधनों को उत्तेजित कर सकती है। उच्च थ्रूपुट रासायनिक स्क्रीन के लिए पुनः संयोजक एंजाइम परख के डिजाइन और अनुकूलन का उपयोग HAT1 छोटे अणु अवरोधकों की पहचान करने और उन्हें चिह्नित करने के लिए सफलतापूर्वक किया गया है।

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>4P CoA</td>
			<td>Cayman Chemical</td>
			<td>10547</td>
			<td>Click chemistry co-factor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amplex Red</td>
			<td>Fisher Sci</td>
			<td>A12222</td>
			<td>Fluorescence substrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin-PEG-Azide</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>J64996MC</td>
			<td>Click chemistry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Copper Sulfate</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>&#160;7758-98-7</td>
			<td>Click chemistry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>&#160;67-68-5</td>
			<td>diluent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>03-12-3483</td>
			<td>reducting agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forskolin</td>
			<td>VWR</td>
			<td>102987-310</td>
			<td>Protein expression</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freestyle 293 Expression Medium</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>12338018</td>
			<td>Media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freestyle 293-F cells</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>R790-07</td>
			<td>Protein expression</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H4-peptide/1-23-GGK-biotin</td>
			<td>Anaspec</td>
			<td>AS65097</td>
			<td>peptide substrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>&#160;7365-45-9</td>
			<td>EB buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen peroxide 30% solution</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>&#160;Z00183-99-0</td>
			<td>initiator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M2 FLAG antibody slurry</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>A2220</td>
			<td>Protein purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Macrosep 10K Filter (Pall Lab)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89131-980</td>
			<td>Protein purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neutravidin Plate</td>
			<td>Thermo Sci</td>
			<td>15127</td>
			<td>BSA-pre-blocked</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NP40 (IGEPAL)</td>
			<td>MP Biomedical</td>
			<td>198596</td>
			<td>20x buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pHEK-293 plasmid</td>
			<td>Takara Bio</td>
			<td>3390</td>
			<td>Protein expression</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline 10x</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>&#160;Z00082-33-6</td>
			<td>wash buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pra peptide</td>
			<td>Genscript</td>
			<td>Custom synthesis</td>
			<td>biotinylated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Ascorbate</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>&#160;134-03-2</td>
			<td>Click chemistry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>&#160;7647-14-5</td>
			<td>EB buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>7558-80-7</td>
			<td>buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>189730</td>
			<td>competitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin-HRP</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>3999S</td>
			<td>enzyme</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>THPTA ligand</td>
			<td>Fisher Sci</td>
			<td>1010-500</td>
			<td>Click chemistry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris base</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>&#160;77-86-1</td>
			<td>20x buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton-X 100</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>&#160;9002-93-1</td>
			<td>EB buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>&#160;9005-64-5</td>
			<td>Wash buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>57-13-6</td>
			<td>quencher</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an acetyl-click chemistry assay to measure histone acetyltransferase 1 acetylation

HAT1, जिसे हिस्टोन एसिटाइलट्रांसफेरेज़ 1 के रूप में भी जाना जाता है, न्यूक्लियोसोम असेंबली से पहले नवजात H4 को स्थिर और एसिटाइलेट करके क्रोमैटिन संश्लेषण में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है। यह विभिन्न प्रणालियों में ट्यूमर के विकास के लिए आवश्यक है, जिससे यह कैंसर के उपचार के लिए एक संभावित लक्ष्य बन जाता है। यौगिकों की पहचान को सुविधाजनक बनाने के लिए जो HAT1 एंजाइमेटिक गतिविधि को रोक सकते हैं, हमने तेजी से स्क्रीनिंग के लिए एसिटाइल-क्लिक परख तैयार की है। इस सरल परख में, हम पुनः संयोजक HAT1/Rbap46 को नियोजित करते हैं, जो सक्रिय मानव कोशिकाओं से शुद्ध होता है। विधि क्लिक-रसायन विज्ञान दृष्टिकोण में एसिटाइल-सीओए एनालॉग 4-पेंटीनॉयल-सीओए (4 पी) का उपयोग करती है। इसमें बायोटिनिलेटेड एच 4 एन-टर्मिनल पेप्टाइड के लिए एचएटी 1-निर्भर एसीलेशन प्रतिक्रिया के माध्यम से एक एल्काइन हैंडल का एंजाइमेटिक हस्तांतरण शामिल है। कैप्चर किए गए पेप्टाइड को तब न्यूट्रैविडिन प्लेटों पर स्थिर किया जाता है, इसके बाद बायोटिन-एज़ाइड के साथ क्लिक-केमिस्ट्री फंक्शनलाइज़ेशन होता है। इसके बाद, स्ट्रेप्टाविडिन-पेरोक्सीडेज भर्ती को एम्पलेक्स लाल ऑक्सीकरण करने के लिए नियोजित किया जाता है, जिसके परिणामस्वरूप मात्रात्मक फ्लोरोसेंट आउटपुट होता है। एसाइलेशन प्रतिक्रिया के दौरान रासायनिक अवरोधकों को पेश करके, हम प्रतिदीप्ति संकेत की कमी के आधार पर एंजाइमी निषेध की मात्रा निर्धारित कर सकते हैं। महत्वपूर्ण रूप से, यह प्रतिक्रिया स्केलेबल है, जो HAT1 एंजाइमेटिक गतिविधि के लिए संभावित अवरोधकों की उच्च थ्रूपुट स्क्रीनिंग की अनुमति देती है।

Among the numerous eukaryotic acetyltransferases, HAT1 was the initial histone acetyltransferase to be isolated1,2,3. Subsequent investigations have firmly established its pivotal role in chromatin replication, particularly in the synthesis of new nucleosomes during S-phase4. Our research endeavors led to the recognition that HAT1 is highly stimulated by epidermal growth factor (EGF) treatment in mammary cells5. Furthermore, it has come to light that HAT1 is required for rapid cell proliferation and tumor formation in vivo6,7,8,9. Data indicate that HAT1 is critical in coordinating anabolic and epigenetic processes for cell division, driving tumor growth.
HAT1 di-acetylates the amino-terminal tail of histone H4 on lysines 5 and 12 in complex with the chaperone protein Rbap46, which binds the histone and presents the amino-terminus to HAT1. Histone tetramers or disomes10, together with HAT1/Rbap46 and other histone chaperones11, are then imported to the nucleus. Histones are then released to be deposited at the replication fork, or other sites to support gene activation or repression. The function of the HAT1 di-acetylation mark on histone H4 is not fully understood. It is likely quickly removed within a span of 15-30 min by the action of histone deacetylases12,13,14,15 after H4 is inserted into chromatin. Thus, the HAT1 di-acetylation mark is not propagated in chromatin and may not serve a true epigenetic role, although a role in the recruitment of chromatin-modifying enzymes to nascent chromatin has been postulated12. Also, HAT1 does not directly acetylate chromatin; its activity is restricted to soluble histones.
The development of small-molecule histone acetyltransferase inhibitors has been hampered by nonspecific and low-throughput assays, often resulting in the generation of biologically reactive compounds16,17.&#160;The gold-standard assay to measure acetyltransferase activities requires the use of 3H-acetyl-coA, which limits throughput and requires radiation. Nonetheless, recently, specific and highly potent small molecule acetyltransferase inhibitors targeting CBP/p30018 and KAT6A/B19,20 have been described and confirmed through the use of 3H-acetyl-CoA. Moving forward, improved assays to achieve better throughput and avoid laboratory hazards are being devised.
Recent advances in acetylation monitoring21 have used click chemistry to enable enzymatic reaction monitoring. There are a variety of click-enabled precursors that are accessible by simple synthetic routes or available for purchase that can be incorporated into enzyme reactions. These reactions are typically carried out in recombinant systems, although cell-based assays are also feasible22. The advantage of click-enabled co-factors and substrates is that screening can directly measure enzyme activity without the need for coupled read-out systems that are often perturbed by screening compounds and require additional handling steps. This allows for inhibitor treatments only during the enzymatic step, whereas all downstream functionalization and detection steps are carried out after extensive washing to remove compounds, thus limiting the potential for assay interference to occur. These advantages make the design of click-enabled assays preferable to coupled assays that commonly rely on the detection of free coenzyme A.
One important consideration is the acceptance of click-enabled co-factors into the enzyme active site. Existing click-enabled co-factors may not be fully compatible with the active site optimized for the native co-factor. Structural information and modeling can be used to design amino acid substitutions to enlarge the active site to incorporate altered substrates23. This may enable screening with improved enzyme kinetics and lower substrate and enzyme levels. The drawback of this approach is that altered catalytic pockets may not identify inhibitors that interact strongly with the native enzyme. Ultimately, a combination of approaches is required to identify and validate potential enzyme inhibitors.
Here, we describe a method developed to purify and assay HAT1 enzyme activity using the click co-factor 4-pentynoyl-CoA24. This assay (Figure 1) uses the native enzyme sequence in complex with its required partner protein Rbap46, which has been shown to boost enzyme activity. Purification of the enzyme from human cells allows for enzyme activation in cellulo, which may preserve stimulating post-translational modifications important for full enzyme activity. Design and optimization of recombinant enzyme assays for high-throughput chemical screens have successfully been used to identify and characterize HAT1 small molecule inhibitors.

लेखक स्पॉटलाइट: HAT1 अवरोधक स्क्रीनिंग के लिए एसिटाइल-क्लिक परख विकसित करना

हिस्टोन एसिटाइलट्रांसफेरेज़ 1 एसिटिलेशन को मापने के लिए एक एसिटाइल-क्लिक रसायन विज्ञान परख

Our developed acetyl-click assay serves as a tool to assess HAT1 acetyl transferase activity, which is key in isolating H4 histones before nucleosome incorporation. We aim to use this method for high throughput screening of small molecule inhibitors against the HAT1 enzyme. This method measures enzymatic activity directly on the peptide substrate.This offers advantages compared to other enzymatic assays by avoiding biologic variability and antibody related costs. This is also high throughput and can be adapted to use with other acetyl transferases. We have recently published a small molecule HAT1 inhibitor based on this assay that has activity in cells and animals.We continue to use this assay to screen additional chemical libraries and perform structure activity relationships. We are advancing methods to track histone production, folding, chaperoning, and chromatin integration. This highlights the need for improved chemical tools to explore biological mechanisms and stimulate drug discovery.Our goal is to demonstrate that targeting histone production can have therapeutic benefit for diseases such as cancer.

डुप्लिकेट (16 कुओं) में मानक घटता उचित परख प्रदर्शन सुनिश्चित करने के लिए हर थाली पर शामिल किया जाना चाहिए. मानक वक्र डेटा को तालिका के रूप में स्थापित किया जाना चाहिए, जिसमें समाधान में देशी एच 4 पेप्टाइड ...

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विशिष्ट अवरोधकों के लिए स्क्रीन पर त्वरित और सटीक रासायनिक परख दवा विकास शस्त्रागार में एक महत्वपूर्ण उपकरण हैं। यहां, हम HAT1 एसिटिलेशन गतिविधि के निषेध को मापने के लिए एक स्केलेबल एसिटाइल-क्लिक रसायन विज्ञान परख प्रस्तुत करते हैं।

HAT1, also known as Histone acetyltransferase 1, plays a crucial role in chromatin synthesis by stabilizing and acetylating nascent H4 before nucleosome ...

हमारे विकसित एसिटाइल-क्लिक परख HAT1 एसिटाइल ट्रांसफरेज़ गतिविधि का आकलन करने के लिए एक उपकरण के रूप में कार्य करता है, जो न्यूक्लियोसोम निगमन से पहले H4 हिस्टोन को अलग करने में महत्वपूर्ण है। हम HAT1 एंजाइम के खिलाफ छोटे अणु अवरोधकों की उच्च थ्रूपुट स्क्रीनिंग के लिए इस पद्धति का उपयोग करना चाहते हैं। यह विधि पेप्टाइड सब्सट्रेट पर सीधे एंजाइमेटिक गतिविधि को मापती है।यह जैविक परिवर्तनशीलता और एंटीबॉडी से संबंधित लागतों से बचकर अन्य एंजाइमी परख की तुलना में लाभ प्रदान करता है। यह उच्च थ्रूपुट भी है और इसे अन्य एसिटाइल ट्रांसफरेज़ के साथ उपयोग करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है। हमने हाल ही में इस परख के आधार पर एक छोटा अणु HAT1 अवरोधक प्रकाशित किया है जिसमें कोशिकाओं और जानवरों में गतिविधि है।हम अतिरिक्त रासायनिक पुस्तकालयों स्क्रीन और संरचना गतिविधि संबंधों प्रदर्शन करने के लिए इस परख का उपयोग करने के लिए जारी है. हम हिस्टोन उत्पादन, तह, चैपरोनिंग और क्रोमैटिन एकीकरण को ट्रैक करने के तरीकों को आगे बढ़ा रहे हैं। यह जैविक तंत्र का पता लगाने और दवा की खोज को प्रोत्साहित करने के लिए बेहतर रासायनिक उपकरणों की आवश्यकता पर प्रकाश डालता है।हमारा लक्ष्य यह प्रदर्शित करना है कि हिस्टोन उत्पादन को लक्षित करने से कैंसर जैसी बीमारियों के लिए चिकित्सीय लाभ हो सकता है।

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Research

JoVE Journal

Biochemistry

An Acetyl-Click Chemistry Assay to Measure Histone Acetyltransferase 1 Acetylation

HAT1, also known as Histone acetyltransferase 1, plays a crucial role in chromatin synthesis by stabilizing and acetylating nascent H4 before nucleosome assembly. It is required for tumor growth in various systems, making it a potential target for cancer treatment. To facilitate the identification of compounds that can inhibit HAT1 enzymatic activity, we have devised an acetyl-click assay for rapid screening. In this simple assay, we employ recombinant HAT1/Rbap46, which is purified from activated human cells. The method utilizes the acetyl-CoA analog 4-pentynoyl-CoA (4P) in a click-chemistry approach. This involves the enzymatic transfer of an alkyne handle through a HAT1-dependent acylation reaction to a biotinylated H4 N-terminal peptide. The captured peptide is then immobilized on neutravidin plates, followed by click-chemistry functionalization with biotin-azide. Subsequently, streptavidin-peroxidase recruitment is employed to oxidize amplex red, resulting in a quantitative fluorescent output. By introducing chemical inhibitors during the acylation reaction, we can quantify enzymatic inhibition based on a reduction of the fluorescence signal. Importantly, this reaction is scalable, allowing for high throughput screening of potential inhibitors for HAT1 enzymatic activity.

Quick and accurate chemical assays to screen for specific inhibitors are an important tool in the drug development arsenal. Here, we present a scalable acetyl-click chemistry assay to measure the inhibition of HAT1 acetylation activity.