Name: Autore in primo piano: Sviluppo del test dell'acetil-clic per lo screening degli inibitori di HAT1
Uploaded: 2024-01-26T14:20:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Author Spotlight: Developing Acetyl-Click Assay for HAT1 Inhibitor Screening at JoVE.com

Ringraziamo George Zheng per aver fornito H4K12CoA. Ringraziamo i membri del Gruber Lab per le utili discussioni e feedback. Ringraziamo il supporto di NIH/NCI (1K08CA245024), CPRIT (RR200090) e V Foundation (V2022-022).

1. Metodo 1: produzione e purificazione del complesso ricombinante HAT1/Rbap46
<ol><li>Scongelamento, recupero ed espansione delle cellule HEK293f<ol><li>Scongelare 1-10 milioni di cellule di mammifero HEK293f26 in terreni di espressione freestyle 293 da 30 mL in un pallone da 100 mL. Incubare in CO2 all'8% a 37 °C ruotando a 60 giri/min.</li>
		<li>Il giorno successivo, contare e controllare la vitalità delle celle, quindi regolare la velocità di rotazione a 120 g...

Sviluppo di un test click-based per lo screening dell'attività dell'enzima HAT1

<ol>
	<li>Kleff, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+gene+encoding+a+yeast+histone+H4+acetyltransferase.">Identification of a gene encoding a yeast histone H4 acetyltransferase.</a> J Biol Chem. 270 (42), 24674-24677 (1995).</li><li>Parthun, M. R., Widom, J., Gottschling, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+major+cytoplasmic+histone+acetyltransferase+in+yeast:+links+to+chromatin+replication+and+histone+metabolism.">The major cytoplasmic histone acetyltransferase in yeast: links to chromatin replication and histone metabolism.</a> Cell. 87 (1), 85-94 (1996).</li><li>Verreault, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleosomal+DNA+regulates+the+core-histone-binding+subunit+of+the+human+Hat1+acetyltransferase.">Nucleosomal DNA regulates the core-histone-binding subunit of the human Hat1 acetyltransferase.</a> Curr Biol. 8 (2), 96-108 (1998).</li><li>Parthun, M. 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J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HAT1+coordinates+histone+production+and+acetylation+via+H4+promoter+binding.">HAT1 coordinates histone production and acetylation via H4 promoter binding.</a> Mol Cell. 75 (4), 711-724 e5 (2019).</li><li>Fan, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overexpressed+histone+acetyltransferase+1+regulates+cancer+immunity+by+increasing+programmed+death-ligand+1+expression+in+pancreatic+cancer.">Overexpressed histone acetyltransferase 1 regulates cancer immunity by increasing programmed death-ligand 1 expression in pancreatic cancer.</a> J Exp Clin Cancer Res. 38 (1), 47 (2019).</li><li>Xia, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA-377+exerts+a+potent+suppressive+role+in+osteosarcoma+through+the+involvement+of+the+histone+acetyltransferase+1-mediated+Wnt+axis.">MicroRNA-377 exerts a potent suppressive role in osteosarcoma through the involvement of the histone acetyltransferase 1-mediated Wnt axis.</a> J Cell Physiol. 234 (12), 22787-22798 (2019).</li><li>Yang, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+acetyltransferase+1+is+a+succinyltransferase+for+histones+and+non-histones+and+promotes+tumorigenesis.">Histone acetyltransferase 1 is a succinyltransferase for histones and non-histones and promotes tumorigenesis.</a> EMBO Rep. 22 (2), e50967 (2021).</li><li>Xue, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNAi+screening+identifies+HAT1+as+a+potential+drug+target+in+esophageal+squamous+cell+carcinoma.">RNAi screening identifies HAT1 as a potential drug target in esophageal squamous cell carcinoma.</a> Int J Clin Exp Pathol. 7 (7), 3898-3907 (2014).</li><li>Zhang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+plasticity+of+histones+H3-H4+facilitates+their+allosteric+exchange+between+RbAp48+and+ASF1.">Structural plasticity of histones H3-H4 facilitates their allosteric exchange between RbAp48 and ASF1.</a> Nat Struct Mol Biol. 20 (1), 29-35 (2013).</li><li>Campos, E. 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M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+of+a+selective+catalytic+p300/CBP+inhibitor+that+targets+lineage-specific+tumours.">Discovery of a selective catalytic p300/CBP inhibitor that targets lineage-specific tumours.</a> Nature. 550 (7674), 128-132 (2017).</li><li>Baell, J. 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D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acetyl-click+screening+platform+identifies+small-molecule+inhibitors+of+histone+acetyltransferase+1+(HAT1).">Acetyl-click screening platform identifies small-molecule inhibitors of histone acetyltransferase 1 (HAT1).</a> J Med Chem. 66 (8), 5774-5801 (2023).</li><li>Ngo, L., Brown, T., Zheng, Y. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bisubstrate+inhibitors+to+target+histone+acetyltransferase+1+(HAT1).">Bisubstrate inhibitors to target histone acetyltransferase 1 (HAT1).</a> Chem Biol Drug Des. 93 (5), 865-873 (2019).</li><li>Parker, C. G., Pratt, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Click+chemistry+in+proteomic+investigations.">Click chemistry in proteomic investigations.</a> Cell. 180 (4), 605-632 (2020).</li><li>Islam, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+bump-and-hole+tactic:+Expanding+the+scope+of+chemical+genetics.">The bump-and-hole tactic: Expanding the scope of chemical genetics.</a> Cell Chem Biol. 25 (10), 1171-1184 (2018).</li><li>Radziwon, K., Weeks, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+engineering+for+selective+proteomics.">Protein engineering for selective proteomics.</a> Curr Opin Chem Biol. 60, 10-19 (2021).</li><li>Rich, R. L., Myszka, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Survey+of+the+year+2007+commercial+optical+biosensor+literature.">Survey of the year 2007 commercial optical biosensor literature.</a> J Mol Recognit. 21 (6), 355-400 (2008).</li></ol>

Nell'ultimo decennio, la click chemistry è diventata importante20, consentendo la progettazione precisa di strutture chimiche interagenti. In questo contesto, varie connessioni covalenti bioortogonali21 sono emerse come opzioni promettenti per la formazione di complessi nel loro ambiente naturale. La chimica dei clic impiega coppie di gruppi funzionali che mostrano reazioni rapide e selettive, comunemente note come "reazioni di clic". Queste reazioni si verificano in modo ...

Tra le numerose acetiltransferasi eucariotiche, HAT1 è stata la prima istone acetiltransferasi ad essere isolata 1,2,3. Indagini successive hanno stabilito il suo ruolo fondamentale nella replicazione della cromatina, in particolare nella sintesi di nuovi nucleosomi durante la faseS 4. I nostri sforzi di ricerca hanno portato al riconoscimento che HAT1 è altamente stimolato dal trattamento con fattore di crescita epidermico (EGF) nelle cellule mammarie5. Inoltre, è venuto alla luce che HAT1 è necessario per una rapida proliferazione cellulare e formazione tumorale in vivo 6,7,8,9. I dati indicano che HAT1 è fondamentale nel coordinare i processi anabolici ed epigenetici per la divisione cellulare, guidando la crescita del tumore.
HAT1 di-acetila la coda amino-terminale dell'istone H4 sulle lisine 5 e 12 in complesso con la proteina chaperone Rbap46, che lega l'istone e presenta l'amino-terminale a HAT1. I tetrameri istonici o disomi10, insieme a HAT1/Rbap46 e altri chaperoni istonici11, vengono quindi importati nel nucleo. Gli istoni vengono quindi rilasciati per essere depositati sulla forcella di replicazione o in altri siti per supportare l'attivazione o la repressione genica. La funzione del segno di diacetilazione HAT1 sull'istone H4 non è completamente compresa. È probabile che venga rapidamente rimosso entro un intervallo di 15-30 minuti dall'azione delle deacetilasi istoniche 12,13,14,15 dopo che H4 è stato inserito nella cromatina. Pertanto, il marchio di diacetilazione HAT1 non si propaga nella cromatina e potrebbe non svolgere un vero ruolo epigenetico, sebbene sia stato ipotizzato un ruolo nel reclutamento di enzimi modificanti la cromatina nella cromatina nascente12. Inoltre, HAT1 non acetila direttamente la cromatina; La sua attività è limitata agli istoni solubili.
Lo sviluppo di inibitori dell'acetiltransferasi istonica a piccole molecole è stato ostacolato da saggi aspecifici e a basso rendimento, che spesso hanno portato alla generazione di composti biologicamente reattivi 16,17. Il test gold standard per misurare le attività dell'acetiltransferasi richiede l'uso di 3H-acetil-coA, che limita la produttività e richiede radiazioni. Ciononostante, recentemente sono stati descritti e confermati inibitori specifici e altamente potenti dell'acetiltransferasi a piccole molecole che hanno come bersaglio CBP/p30018 e KAT6A/B19,20 attraverso l'uso di 3H-acetil-CoA. In futuro, si stanno studiando saggi migliorati per ottenere una migliore produttività ed evitare i rischi di laboratorio.
I recenti progressi nel monitoraggio dell'acetilazione21 hanno utilizzato la click chemistry per consentire il monitoraggio delle reazioni enzimatiche. Esiste una varietà di precursori click-enabled che sono accessibili tramite semplici vie sintetiche o disponibili per l'acquisto che possono essere incorporati nelle reazioni enzimatiche. Queste reazioni sono tipicamente condotte in sistemi ricombinanti, sebbene siano possibili anche saggi basati su cellule22. Il vantaggio dei cofattori e dei substrati abilitati al clic è che lo screening può misurare direttamente l'attività enzimatica senza la necessità di sistemi di lettura accoppiati che sono spesso perturbati dai composti di screening e richiedono ulteriori passaggi di manipolazione. Ciò consente trattamenti con inibitori solo durante la fase enzimatica, mentre tutte le fasi di funzionalizzazione e rilevamento a valle vengono eseguite dopo un lavaggio approfondito per rimuovere i composti, limitando così il potenziale di interferenza del saggio. Questi vantaggi rendono la progettazione di saggi click-enabled preferibile ai saggi accoppiati che comunemente si basano sulla rilevazione del coenzima A libero.
Una considerazione importante è l'accettazione di cofattori abilitati al clic nel sito attivo dell'enzima. I cofattori abilitati per i clic esistenti potrebbero non essere completamente compatibili con il sito attivo ottimizzato per il cofattore nativo. Le informazioni strutturali e la modellazione possono essere utilizzate per progettare sostituzioni di amminoacidi per allargare il sito attivo per incorporare substrati alterati23. Ciò può consentire lo screening con una migliore cinetica enzimatica e livelli più bassi di substrato ed enzimi. Lo svantaggio di questo approccio è che le tasche catalitiche alterate potrebbero non identificare gli inibitori che interagiscono fortemente con l'enzima nativo. In definitiva, è necessaria una combinazione di approcci per identificare e convalidare potenziali inibitori enzimatici.
Qui, descriviamo un metodo sviluppato per purificare e saggiare l'attività dell'enzima HAT1 utilizzando il cofattore click 4-penninoil-CoA24. Questo test (Figura 1) utilizza la sequenza enzimatica nativa in complesso con la sua proteina partner richiesta Rbap46, che ha dimostrato di aumentare l'attività enzimatica. La purificazione dell'enzima dalle cellule umane consente l'attivazione enzimatica nella cellulo, che può preservare le stimolanti modificazioni post-traduzionali importanti per la piena attività enzimatica. La progettazione e l'ottimizzazione di saggi enzimatici ricombinanti per schermi chimici ad alto rendimento sono state utilizzate con successo per identificare e caratterizzare gli inibitori delle piccole molecole HAT1.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>4P CoA</td>
			<td>Cayman Chemical</td>
			<td>10547</td>
			<td>Click chemistry co-factor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amplex Red</td>
			<td>Fisher Sci</td>
			<td>A12222</td>
			<td>Fluorescence substrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin-PEG-Azide</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>J64996MC</td>
			<td>Click chemistry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Copper Sulfate</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>&#160;7758-98-7</td>
			<td>Click chemistry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>&#160;67-68-5</td>
			<td>diluent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>03-12-3483</td>
			<td>reducting agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forskolin</td>
			<td>VWR</td>
			<td>102987-310</td>
			<td>Protein expression</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freestyle 293 Expression Medium</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>12338018</td>
			<td>Media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freestyle 293-F cells</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>R790-07</td>
			<td>Protein expression</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H4-peptide/1-23-GGK-biotin</td>
			<td>Anaspec</td>
			<td>AS65097</td>
			<td>peptide substrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>&#160;7365-45-9</td>
			<td>EB buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen peroxide 30% solution</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>&#160;Z00183-99-0</td>
			<td>initiator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M2 FLAG antibody slurry</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>A2220</td>
			<td>Protein purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Macrosep 10K Filter (Pall Lab)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89131-980</td>
			<td>Protein purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neutravidin Plate</td>
			<td>Thermo Sci</td>
			<td>15127</td>
			<td>BSA-pre-blocked</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NP40 (IGEPAL)</td>
			<td>MP Biomedical</td>
			<td>198596</td>
			<td>20x buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pHEK-293 plasmid</td>
			<td>Takara Bio</td>
			<td>3390</td>
			<td>Protein expression</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline 10x</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>&#160;Z00082-33-6</td>
			<td>wash buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pra peptide</td>
			<td>Genscript</td>
			<td>Custom synthesis</td>
			<td>biotinylated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Ascorbate</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>&#160;134-03-2</td>
			<td>Click chemistry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>&#160;7647-14-5</td>
			<td>EB buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>7558-80-7</td>
			<td>buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>189730</td>
			<td>competitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin-HRP</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>3999S</td>
			<td>enzyme</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>THPTA ligand</td>
			<td>Fisher Sci</td>
			<td>1010-500</td>
			<td>Click chemistry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris base</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>&#160;77-86-1</td>
			<td>20x buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton-X 100</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>&#160;9002-93-1</td>
			<td>EB buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>&#160;9005-64-5</td>
			<td>Wash buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>57-13-6</td>
			<td>quencher</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an acetyl-click chemistry assay to measure histone acetyltransferase 1 acetylation

HAT1, noto anche come istone acetiltransferasi 1, svolge un ruolo cruciale nella sintesi della cromatina stabilizzando e acetilando l'H4 nascente prima dell'assemblaggio del nucleosoma. È necessario per la crescita del tumore in vari sistemi, il che lo rende un potenziale bersaglio per il trattamento del cancro. Per facilitare l'identificazione di composti in grado di inibire l'attività enzimatica di HAT1, abbiamo ideato un saggio acetil-click per uno screening rapido. In questo semplice saggio, impieghiamo HAT1/Rbap46 ricombinante, che viene purificato da cellule umane attivate. Il metodo utilizza l'analogo dell'acetil-CoA 4-pentinoil-CoA (4P) in un approccio click-chemistry. Ciò comporta il trasferimento enzimatico di un manico alchino attraverso una reazione di acilazione HAT1-dipendente a un peptide N-terminale H4 biotinilato. Il peptide catturato viene quindi immobilizzato su piastre di neutravidina, seguita da una funzionalizzazione click-chemistry con biotina-azide. Successivamente, il reclutamento della streptavidina-perossidasi viene impiegato per ossidare il rosso amplex, con conseguente emissione fluorescente quantitativa. Introducendo inibitori chimici durante la reazione di acilazione, possiamo quantificare l'inibizione enzimatica in base ad una riduzione del segnale di fluorescenza. È importante sottolineare che questa reazione è scalabile, consentendo lo screening ad alto rendimento di potenziali inibitori per l'attività enzimatica di HAT1.

Among the numerous eukaryotic acetyltransferases, HAT1 was the initial histone acetyltransferase to be isolated1,2,3. Subsequent investigations have firmly established its pivotal role in chromatin replication, particularly in the synthesis of new nucleosomes during S-phase4. Our research endeavors led to the recognition that HAT1 is highly stimulated by epidermal growth factor (EGF) treatment in mammary cells5. Furthermore, it has come to light that HAT1 is required for rapid cell proliferation and tumor formation in vivo6,7,8,9. Data indicate that HAT1 is critical in coordinating anabolic and epigenetic processes for cell division, driving tumor growth.
HAT1 di-acetylates the amino-terminal tail of histone H4 on lysines 5 and 12 in complex with the chaperone protein Rbap46, which binds the histone and presents the amino-terminus to HAT1. Histone tetramers or disomes10, together with HAT1/Rbap46 and other histone chaperones11, are then imported to the nucleus. Histones are then released to be deposited at the replication fork, or other sites to support gene activation or repression. The function of the HAT1 di-acetylation mark on histone H4 is not fully understood. It is likely quickly removed within a span of 15-30 min by the action of histone deacetylases12,13,14,15 after H4 is inserted into chromatin. Thus, the HAT1 di-acetylation mark is not propagated in chromatin and may not serve a true epigenetic role, although a role in the recruitment of chromatin-modifying enzymes to nascent chromatin has been postulated12. Also, HAT1 does not directly acetylate chromatin; its activity is restricted to soluble histones.
The development of small-molecule histone acetyltransferase inhibitors has been hampered by nonspecific and low-throughput assays, often resulting in the generation of biologically reactive compounds16,17.&#160;The gold-standard assay to measure acetyltransferase activities requires the use of 3H-acetyl-coA, which limits throughput and requires radiation. Nonetheless, recently, specific and highly potent small molecule acetyltransferase inhibitors targeting CBP/p30018 and KAT6A/B19,20 have been described and confirmed through the use of 3H-acetyl-CoA. Moving forward, improved assays to achieve better throughput and avoid laboratory hazards are being devised.
Recent advances in acetylation monitoring21 have used click chemistry to enable enzymatic reaction monitoring. There are a variety of click-enabled precursors that are accessible by simple synthetic routes or available for purchase that can be incorporated into enzyme reactions. These reactions are typically carried out in recombinant systems, although cell-based assays are also feasible22. The advantage of click-enabled co-factors and substrates is that screening can directly measure enzyme activity without the need for coupled read-out systems that are often perturbed by screening compounds and require additional handling steps. This allows for inhibitor treatments only during the enzymatic step, whereas all downstream functionalization and detection steps are carried out after extensive washing to remove compounds, thus limiting the potential for assay interference to occur. These advantages make the design of click-enabled assays preferable to coupled assays that commonly rely on the detection of free coenzyme A.
One important consideration is the acceptance of click-enabled co-factors into the enzyme active site. Existing click-enabled co-factors may not be fully compatible with the active site optimized for the native co-factor. Structural information and modeling can be used to design amino acid substitutions to enlarge the active site to incorporate altered substrates23. This may enable screening with improved enzyme kinetics and lower substrate and enzyme levels. The drawback of this approach is that altered catalytic pockets may not identify inhibitors that interact strongly with the native enzyme. Ultimately, a combination of approaches is required to identify and validate potential enzyme inhibitors.
Here, we describe a method developed to purify and assay HAT1 enzyme activity using the click co-factor 4-pentynoyl-CoA24. This assay (Figure 1) uses the native enzyme sequence in complex with its required partner protein Rbap46, which has been shown to boost enzyme activity. Purification of the enzyme from human cells allows for enzyme activation in cellulo, which may preserve stimulating post-translational modifications important for full enzyme activity. Design and optimization of recombinant enzyme assays for high-throughput chemical screens have successfully been used to identify and characterize HAT1 small molecule inhibitors.

Autore in primo piano: Sviluppo del test dell'acetil-clic per lo screening degli inibitori di HAT1

Un test chimico acetil-click per misurare l'acetiltransferasi istonica 1

Our developed acetyl-click assay serves as a tool to assess HAT1 acetyl transferase activity, which is key in isolating H4 histones before nucleosome incorporation. We aim to use this method for high throughput screening of small molecule inhibitors against the HAT1 enzyme. This method measures enzymatic activity directly on the peptide substrate.This offers advantages compared to other enzymatic assays by avoiding biologic variability and antibody related costs. This is also high throughput and can be adapted to use with other acetyl transferases. We have recently published a small molecule HAT1 inhibitor based on this assay that has activity in cells and animals.We continue to use this assay to screen additional chemical libraries and perform structure activity relationships. We are advancing methods to track histone production, folding, chaperoning, and chromatin integration. This highlights the need for improved chemical tools to explore biological mechanisms and stimulate drug discovery.Our goal is to demonstrate that targeting histone production can have therapeutic benefit for diseases such as cancer.

Le curve standard in duplicato (16 pozzetti) devono essere incluse su ogni piastra per garantire una corretta esecuzione del saggio. I dati della curva standard devono essere impostati sotto forma di tabella, con un intervallo compreso tra il 100% e lo 0% in base al rapporto tra il peptide contenente Pra e il peptide H4 nativo in soluzione (Tabella 1). Il segnale rosso di Amplex sarà il più alto nei pozzetti peptidici H4 nativi al 100% pra/0% e il più basso nei pozzetti peptidici H4 nativi allo 0% pra...

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Saggi chimici rapidi e accurati per lo screening di inibitori specifici sono uno strumento importante nell'arsenale di sviluppo dei farmaci. Qui, presentiamo un saggio chimico scalabile acetil-click per misurare l'inibizione dell'attività di acetilazione di HAT1.

HAT1, also known as Histone acetyltransferase 1, plays a crucial role in chromatin synthesis by stabilizing and acetylating nascent H4 before nucleosome ...

Il nostro saggio acetil-click sviluppato serve come strumento per valutare l'attività dell'acetil transferasi HAT1, che è fondamentale per isolare gli istoni H4 prima dell'incorporazione del nucleosoma. Il nostro obiettivo è quello di utilizzare questo metodo per lo screening ad alto rendimento di inibitori di piccole molecole contro l'enzima HAT1. Questo metodo misura l'attività enzimatica direttamente sul substrato peptidico.Ciò offre vantaggi rispetto ad altri test enzimatici, evitando la variabilità biologica e i costi correlati agli anticorpi. Questo è anche ad alto rendimento e può essere adattato per l'uso con altre acetil transferasi. Recentemente abbiamo pubblicato una piccola molecola inibitrice di HAT1 basata su questo test che ha attività nelle cellule e negli animali.Continuiamo a utilizzare questo test per lo screening di ulteriori librerie chimiche e per eseguire relazioni struttura-attività. Stiamo sviluppando metodi per monitorare la produzione di istoni, il folding, il chaperoning e l'integrazione della cromatina. Ciò evidenzia la necessità di migliorare gli strumenti chimici per esplorare i meccanismi biologici e stimolare la scoperta di farmaci.Il nostro obiettivo è dimostrare che il targeting della produzione di istoni può avere benefici terapeutici per malattie come il cancro.

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Research

JoVE Journal

Biochemistry

An Acetyl-Click Chemistry Assay to Measure Histone Acetyltransferase 1 Acetylation

HAT1, also known as Histone acetyltransferase 1, plays a crucial role in chromatin synthesis by stabilizing and acetylating nascent H4 before nucleosome assembly. It is required for tumor growth in various systems, making it a potential target for cancer treatment. To facilitate the identification of compounds that can inhibit HAT1 enzymatic activity, we have devised an acetyl-click assay for rapid screening. In this simple assay, we employ recombinant HAT1/Rbap46, which is purified from activated human cells. The method utilizes the acetyl-CoA analog 4-pentynoyl-CoA (4P) in a click-chemistry approach. This involves the enzymatic transfer of an alkyne handle through a HAT1-dependent acylation reaction to a biotinylated H4 N-terminal peptide. The captured peptide is then immobilized on neutravidin plates, followed by click-chemistry functionalization with biotin-azide. Subsequently, streptavidin-peroxidase recruitment is employed to oxidize amplex red, resulting in a quantitative fluorescent output. By introducing chemical inhibitors during the acylation reaction, we can quantify enzymatic inhibition based on a reduction of the fluorescence signal. Importantly, this reaction is scalable, allowing for high throughput screening of potential inhibitors for HAT1 enzymatic activity.

Quick and accurate chemical assays to screen for specific inhibitors are an important tool in the drug development arsenal. Here, we present a scalable acetyl-click chemistry assay to measure the inhibition of HAT1 acetylation activity.