Name: 著者スポットライト:HAT1阻害剤スクリーニングのためのアセチルクリックアッセイの開発
Uploaded: 2024-01-26T14:20:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Author Spotlight: Developing Acetyl-Click Assay for HAT1 Inhibitor Screening at JoVE.com

H4K12CoAを提供してくださったGeorge Zheng氏に感謝します。有益な議論とフィードバックを提供してくれたGruber Labのメンバーに感謝します。NIH/NCI(1K08CA245024)、CPRIT(RR200090)、V財団(V2022-022)からの支援に感謝します。

1.方法1:組換えHAT1 / Rbap46複合体の生成と精製
<ol><li>HEK293f細胞の融解、回収、増殖<ol><li>100 mLフラスコ中で、1〜1,000万個のHEK293f哺乳類細胞26 を30 mLのフリースタイル293発現培地に解凍します。8% CO2 を 37 °C で 60 rpm で回転させながらインキュベートします。</li>
		<li>翌日、細胞の生存率をカウントして確認し、回転速度を120rpmに調整します。1 L フラスコ?...

HAT1酵素活性スクリーニングのためのクリックベースアッセイの開発

<ol>
	<li>Kleff, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+gene+encoding+a+yeast+histone+H4+acetyltransferase.">Identification of a gene encoding a yeast histone H4 acetyltransferase.</a> J Biol Chem. 270 (42), 24674-24677 (1995).</li><li>Parthun, M. R., Widom, J., Gottschling, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+major+cytoplasmic+histone+acetyltransferase+in+yeast:+links+to+chromatin+replication+and+histone+metabolism.">The major cytoplasmic histone acetyltransferase in yeast: links to chromatin replication and histone metabolism.</a> Cell. 87 (1), 85-94 (1996).</li><li>Verreault, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleosomal+DNA+regulates+the+core-histone-binding+subunit+of+the+human+Hat1+acetyltransferase.">Nucleosomal DNA regulates the core-histone-binding subunit of the human Hat1 acetyltransferase.</a> Curr Biol. 8 (2), 96-108 (1998).</li><li>Parthun, M. 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J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HAT1+coordinates+histone+production+and+acetylation+via+H4+promoter+binding.">HAT1 coordinates histone production and acetylation via H4 promoter binding.</a> Mol Cell. 75 (4), 711-724 e5 (2019).</li><li>Fan, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overexpressed+histone+acetyltransferase+1+regulates+cancer+immunity+by+increasing+programmed+death-ligand+1+expression+in+pancreatic+cancer.">Overexpressed histone acetyltransferase 1 regulates cancer immunity by increasing programmed death-ligand 1 expression in pancreatic cancer.</a> J Exp Clin Cancer Res. 38 (1), 47 (2019).</li><li>Xia, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA-377+exerts+a+potent+suppressive+role+in+osteosarcoma+through+the+involvement+of+the+histone+acetyltransferase+1-mediated+Wnt+axis.">MicroRNA-377 exerts a potent suppressive role in osteosarcoma through the involvement of the histone acetyltransferase 1-mediated Wnt axis.</a> J Cell Physiol. 234 (12), 22787-22798 (2019).</li><li>Yang, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+acetyltransferase+1+is+a+succinyltransferase+for+histones+and+non-histones+and+promotes+tumorigenesis.">Histone acetyltransferase 1 is a succinyltransferase for histones and non-histones and promotes tumorigenesis.</a> EMBO Rep. 22 (2), e50967 (2021).</li><li>Xue, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNAi+screening+identifies+HAT1+as+a+potential+drug+target+in+esophageal+squamous+cell+carcinoma.">RNAi screening identifies HAT1 as a potential drug target in esophageal squamous cell carcinoma.</a> Int J Clin Exp Pathol. 7 (7), 3898-3907 (2014).</li><li>Zhang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+plasticity+of+histones+H3-H4+facilitates+their+allosteric+exchange+between+RbAp48+and+ASF1.">Structural plasticity of histones H3-H4 facilitates their allosteric exchange between RbAp48 and ASF1.</a> Nat Struct Mol Biol. 20 (1), 29-35 (2013).</li><li>Campos, E. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+program+for+processing+newly+synthesized+histones+H3.1+and+H4.">The program for processing newly synthesized histones H3.1 and H4.</a> Nat Struct Mol Biol. 17 (11), 1343-1351 (2010).</li><li>Agudelo Garcia, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+multiple+roles+for+histone+acetyltransferase+1+in+replication-coupled+chromatin+assembly.">Identification of multiple roles for histone acetyltransferase 1 in replication-coupled chromatin assembly.</a> Nucleic Acids Res. 45 (16), 9319-9335 (2017).</li><li>Nagarajan, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+acetyl+transferase+1+is+essential+for+mammalian+development,+genome+stability,+and+the+processing+of+newly+synthesized+histones+H3+and+H4.">Histone acetyl transferase 1 is essential for mammalian development, genome stability, and the processing of newly synthesized histones H3 and H4.</a> PLoS Genet. 9 (6), e1003518 (2013).</li><li>Annunziato, A. 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L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assay+interference+and+off-target+liabilities+of+reported+histone+acetyltransferase+inhibitors.">Assay interference and off-target liabilities of reported histone acetyltransferase inhibitors.</a> Nat Commun. 8 (1), 1527 (2017).</li><li>Baell, J. B., Miao, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+acetyltransferase+inhibitors:+where+art+thou.">Histone acetyltransferase inhibitors: where art thou.</a> Future Med Chem. 8 (13), 1525-1528 (2016).</li><li>Lasko, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+of+a+selective+catalytic+p300/CBP+inhibitor+that+targets+lineage-specific+tumours.">Discovery of a selective catalytic p300/CBP inhibitor that targets lineage-specific tumours.</a> Nature. 550 (7674), 128-132 (2017).</li><li>Baell, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibitors+of+histone+acetyltransferases+KAT6A/B+induce+senescence+and+arrest+tumour+growth.">Inhibitors of histone acetyltransferases KAT6A/B induce senescence and arrest tumour growth.</a> Nature. 560 (7717), 253-257 (2018).</li><li>Falk, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+efficient+high-throughput+screening+method+for+MYST+family+acetyltransferases,+a+new+class+of+epigenetic+drug+targets.">An efficient high-throughput screening method for MYST family acetyltransferases, a new class of epigenetic drug targets.</a> J Biomol Screen. 16 (10), 1196-1205 (2011).</li><li>He, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+biology+approaches+for+investigating+the+functions+of+lysine+acetyltransferases.">Chemical biology approaches for investigating the functions of lysine acetyltransferases.</a> Angew Chem Int Ed Engl. 57 (5), 1162-1184 (2018).</li><li>Lipchik, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+peptide-based+biosensor+assay+to+detect+intracellular+Syk+kinase+activation+and+inhibition.">A peptide-based biosensor assay to detect intracellular Syk kinase activation and inhibition.</a> Biochemistry. 51 (38), 7515-7524 (2012).</li><li>Song, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemoproteomic+profiling+of+protein+substrates+of+a+major+lysine+acetyltransferase+in+the+native+cellular+context.">Chemoproteomic profiling of protein substrates of a major lysine acetyltransferase in the native cellular context.</a> ACS Chem Biol. 17 (5), 1092-1102 (2022).</li><li>Gaddameedi, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acetyl-click+screening+platform+identifies+small-molecule+inhibitors+of+histone+acetyltransferase+1+(HAT1).">Acetyl-click screening platform identifies small-molecule inhibitors of histone acetyltransferase 1 (HAT1).</a> J Med Chem. 66 (8), 5774-5801 (2023).</li><li>Ngo, L., Brown, T., Zheng, Y. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bisubstrate+inhibitors+to+target+histone+acetyltransferase+1+(HAT1).">Bisubstrate inhibitors to target histone acetyltransferase 1 (HAT1).</a> Chem Biol Drug Des. 93 (5), 865-873 (2019).</li><li>Parker, C. G., Pratt, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Click+chemistry+in+proteomic+investigations.">Click chemistry in proteomic investigations.</a> Cell. 180 (4), 605-632 (2020).</li><li>Islam, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+bump-and-hole+tactic:+Expanding+the+scope+of+chemical+genetics.">The bump-and-hole tactic: Expanding the scope of chemical genetics.</a> Cell Chem Biol. 25 (10), 1171-1184 (2018).</li><li>Radziwon, K., Weeks, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+engineering+for+selective+proteomics.">Protein engineering for selective proteomics.</a> Curr Opin Chem Biol. 60, 10-19 (2021).</li><li>Rich, R. L., Myszka, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Survey+of+the+year+2007+commercial+optical+biosensor+literature.">Survey of the year 2007 commercial optical biosensor literature.</a> J Mol Recognit. 21 (6), 355-400 (2008).</li></ol>

過去10年間で、クリックケミストリーが顕著になり20、相互作用する化学構造の正確な設計が可能になりました。この文脈の中で、種々の生体直交共有結合21 が、それらの自然環境において複合体を形成するための有望な選択肢として浮上してきた。クリックケミストリーは、一般に「クリック反応」として知られる、迅速で選択的な反応を示す官能基のペ...

数ある真核生物のアセチルトランスフェラーゼの中で、HAT1は最初に単離されたヒストンアセチルトランスフェラーゼであった1,2,3。その後の研究により、クロマチン複製、特にS期4期の新しいヌクレオソームの合成における極めて重要な役割が確固たるものとなりました。研究の結果、HAT1は乳腺細胞の上皮成長因子(EGF)処理によって高度に刺激されることが認識されました5。さらに、HAT1はin vivoでの急速な細胞増殖と腫瘍形成に必要であることが明らかになっています6,7,8,9。データによると、HAT1は細胞分裂の同化プロセスとエピジェネティックプロセスの調整に不可欠であり、腫瘍の増殖を促進します。
HAT1は、ヒストンH4のアミノ末端テールをリジン5および12上のジアセチル化し、シャペロンタンパク質Rbap46と複合体でヒストンに結合し、アミノ末端をHAT1に提示します。ヒストン四量体または二体10は、HAT1/Rbap46および他のヒストンシャペロン11とともに、核に取り込まれる。その後、ヒストンは放出され、複製フォークまたは他の部位に沈着し、遺伝子の活性化または抑制をサポートします。ヒストンH4に対するHAT1ジアセチル化マークの機能は完全には解明されていません。H4がクロマチンに挿入された後、ヒストン脱アセチル化酵素12,13,14,15の作用により、15〜30分のスパン内に迅速に除去される可能性があります。したがって、HAT1ジアセチル化マークはクロマチン中で伝播せず、真のエピジェネティックな役割を果たさない可能性があるが、新生クロマチンへのクロマチン修飾酵素の動員における役割は仮定されている12。また、HAT1はクロマチンを直接アセチル化しません。その活性は可溶性ヒストンに限定されています。
低分子ヒストンアセチルトランスフェラーゼ阻害剤の開発は、非特異的で低スループットのアッセイによって妨げられており、多くの場合、生物学的に反応性化合物の生成を引き起こしています16,17。アセチルトランスフェラーゼ活性を測定するためのゴールドスタンダードアッセイでは、3H-アセチル-coAを使用する必要があるため、スループットが制限され、放射線が必要です。それにもかかわらず、最近、CBP/p30018およびKAT6A/B19,20を標的とする特異的で非常に強力な低分子アセチルトランスフェラーゼ阻害剤が記載され、3つのH-アセチルCoAの使用によって確認されています。今後は、スループットを向上させ、実験室での危険を回避するための改良されたアッセイが考案されています。
アセチル化モニタリング21 の最近の進歩により、クリックケミストリーが利用され、酵素反応モニタリングが可能になった。クリック対応の前駆体には、単純な合成経路で入手できるものや、酵素反応に組み込むことができる購入可能なものがあります。これらの反応は通常、組換え系で行われるが、細胞ベースのアッセイも実行可能である22。クリック対応の補因子および基質の利点は、スクリーニング化合物によってしばしば摂動され、追加の取り扱いステップを必要とする結合読み出しシステムを必要とせずに、スクリーニングで酵素活性を直接測定できることです。これにより、酵素ステップ中にのみ阻害剤処理が可能になり、下流のすべての機能化および検出ステップは、化合物を除去するために広範な洗浄後に実行されるため、アッセイ干渉が発生する可能性が制限されます。これらの利点により、クリック対応アッセイの設計は、遊離コエンザイムAの検出に一般的に依存する結合アッセイよりも好ましいものになります。
重要な考慮事項の1つは、酵素活性部位へのクリック可能補因子の受け入れです。既存のクリック対応補因子は、ネイティブ補因子用に最適化されたアクティブサイトと完全に互換性がない場合があります。構造情報およびモデリングを使用して、改変された基質を取り込むために活性部位を拡大するためのアミノ酸置換を設計することができる23。これにより、酵素動態を改善し、基質と酵素のレベルを下げたスクリーニングが可能になる場合があります。このアプローチの欠点は、変化した触媒ポケットが天然酵素と強く相互作用する阻害剤を同定できない可能性があることです。最終的には、潜在的な酵素阻害剤を同定し、検証するために、複数のアプローチを組み合わせる必要があります。
ここでは、クリック補因子4-ペンチノイル-CoAを用いてHAT1酵素活性を精製およびアッセイするために開発された方法24について述べる。このアッセイ(図1)では、天然の酵素配列を、酵素活性を高めることが示されている必要なパートナータンパク質Rbap46と複合体で使用します。ヒト細胞から酵素を精製すると、 セルローの酵素活性化が可能になり、完全な酵素活性に重要な刺激的な翻訳後修飾が保存される可能性があります。ハイスループットケミカルスクリーニングのための組換え酵素アッセイの設計と最適化は、HAT1低分子阻害剤の同定と特性評価に使用されています。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>4P CoA</td>
			<td>Cayman Chemical</td>
			<td>10547</td>
			<td>Click chemistry co-factor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amplex Red</td>
			<td>Fisher Sci</td>
			<td>A12222</td>
			<td>Fluorescence substrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin-PEG-Azide</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>J64996MC</td>
			<td>Click chemistry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Copper Sulfate</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>&#160;7758-98-7</td>
			<td>Click chemistry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>&#160;67-68-5</td>
			<td>diluent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>03-12-3483</td>
			<td>reducting agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forskolin</td>
			<td>VWR</td>
			<td>102987-310</td>
			<td>Protein expression</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freestyle 293 Expression Medium</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>12338018</td>
			<td>Media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freestyle 293-F cells</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>R790-07</td>
			<td>Protein expression</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H4-peptide/1-23-GGK-biotin</td>
			<td>Anaspec</td>
			<td>AS65097</td>
			<td>peptide substrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>&#160;7365-45-9</td>
			<td>EB buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen peroxide 30% solution</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>&#160;Z00183-99-0</td>
			<td>initiator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M2 FLAG antibody slurry</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>A2220</td>
			<td>Protein purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Macrosep 10K Filter (Pall Lab)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89131-980</td>
			<td>Protein purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neutravidin Plate</td>
			<td>Thermo Sci</td>
			<td>15127</td>
			<td>BSA-pre-blocked</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NP40 (IGEPAL)</td>
			<td>MP Biomedical</td>
			<td>198596</td>
			<td>20x buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pHEK-293 plasmid</td>
			<td>Takara Bio</td>
			<td>3390</td>
			<td>Protein expression</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline 10x</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>&#160;Z00082-33-6</td>
			<td>wash buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pra peptide</td>
			<td>Genscript</td>
			<td>Custom synthesis</td>
			<td>biotinylated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Ascorbate</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>&#160;134-03-2</td>
			<td>Click chemistry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>&#160;7647-14-5</td>
			<td>EB buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>7558-80-7</td>
			<td>buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>189730</td>
			<td>competitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin-HRP</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>3999S</td>
			<td>enzyme</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>THPTA ligand</td>
			<td>Fisher Sci</td>
			<td>1010-500</td>
			<td>Click chemistry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris base</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>&#160;77-86-1</td>
			<td>20x buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton-X 100</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>&#160;9002-93-1</td>
			<td>EB buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>&#160;9005-64-5</td>
			<td>Wash buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>57-13-6</td>
			<td>quencher</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an acetyl-click chemistry assay to measure histone acetyltransferase 1 acetylation

HAT1は、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ1とも呼ばれ、ヌクレオソーム形成前に新生H4を安定化およびアセチル化することにより、クロマチン合成において重要な役割を果たします。さまざまなシステムでの腫瘍増殖に必要であり、がん治療の標的となる可能性があります。HAT1酵素活性を阻害する化合物の同定を容易にするために、迅速なスクリーニングのためのアセチルクリックアッセイを考案しました。この簡便なアッセイでは、活性化されたヒト細胞から精製された組換えHAT1/Rbap46を用います。この分析法では、アセチル-CoA 類似体である 4-ペンチノイル-CoA(4P)をクリックケミストリーアプローチで利用します。これには、HAT1依存性アシル化反応によるアルキンハンドルのビオチン化H4 N末端ペプチドへの酵素的転写が含まれます。捕捉したペプチドはニュートラアビジンプレート上に固定化され、続いてビオチン-アジドによるクリックケミストリー官能基化が行われます。続いて、ストレプトアビジン-ペルオキシダーゼリクルートメントを使用してアンプレックスレッドを酸化し、定量的な蛍光出力が得られます。アシル化反応中に化学的阻害剤を導入することで、蛍光シグナルの減少に基づいて酵素阻害を定量することができます。重要なことは、この反応はスケーラブルであり、HAT1酵素活性の潜在的な阻害剤のハイスループットスクリーニングを可能にすることです。

Among the numerous eukaryotic acetyltransferases, HAT1 was the initial histone acetyltransferase to be isolated1,2,3. Subsequent investigations have firmly established its pivotal role in chromatin replication, particularly in the synthesis of new nucleosomes during S-phase4. Our research endeavors led to the recognition that HAT1 is highly stimulated by epidermal growth factor (EGF) treatment in mammary cells5. Furthermore, it has come to light that HAT1 is required for rapid cell proliferation and tumor formation in vivo6,7,8,9. Data indicate that HAT1 is critical in coordinating anabolic and epigenetic processes for cell division, driving tumor growth.
HAT1 di-acetylates the amino-terminal tail of histone H4 on lysines 5 and 12 in complex with the chaperone protein Rbap46, which binds the histone and presents the amino-terminus to HAT1. Histone tetramers or disomes10, together with HAT1/Rbap46 and other histone chaperones11, are then imported to the nucleus. Histones are then released to be deposited at the replication fork, or other sites to support gene activation or repression. The function of the HAT1 di-acetylation mark on histone H4 is not fully understood. It is likely quickly removed within a span of 15-30 min by the action of histone deacetylases12,13,14,15 after H4 is inserted into chromatin. Thus, the HAT1 di-acetylation mark is not propagated in chromatin and may not serve a true epigenetic role, although a role in the recruitment of chromatin-modifying enzymes to nascent chromatin has been postulated12. Also, HAT1 does not directly acetylate chromatin; its activity is restricted to soluble histones.
The development of small-molecule histone acetyltransferase inhibitors has been hampered by nonspecific and low-throughput assays, often resulting in the generation of biologically reactive compounds16,17.&#160;The gold-standard assay to measure acetyltransferase activities requires the use of 3H-acetyl-coA, which limits throughput and requires radiation. Nonetheless, recently, specific and highly potent small molecule acetyltransferase inhibitors targeting CBP/p30018 and KAT6A/B19,20 have been described and confirmed through the use of 3H-acetyl-CoA. Moving forward, improved assays to achieve better throughput and avoid laboratory hazards are being devised.
Recent advances in acetylation monitoring21 have used click chemistry to enable enzymatic reaction monitoring. There are a variety of click-enabled precursors that are accessible by simple synthetic routes or available for purchase that can be incorporated into enzyme reactions. These reactions are typically carried out in recombinant systems, although cell-based assays are also feasible22. The advantage of click-enabled co-factors and substrates is that screening can directly measure enzyme activity without the need for coupled read-out systems that are often perturbed by screening compounds and require additional handling steps. This allows for inhibitor treatments only during the enzymatic step, whereas all downstream functionalization and detection steps are carried out after extensive washing to remove compounds, thus limiting the potential for assay interference to occur. These advantages make the design of click-enabled assays preferable to coupled assays that commonly rely on the detection of free coenzyme A.
One important consideration is the acceptance of click-enabled co-factors into the enzyme active site. Existing click-enabled co-factors may not be fully compatible with the active site optimized for the native co-factor. Structural information and modeling can be used to design amino acid substitutions to enlarge the active site to incorporate altered substrates23. This may enable screening with improved enzyme kinetics and lower substrate and enzyme levels. The drawback of this approach is that altered catalytic pockets may not identify inhibitors that interact strongly with the native enzyme. Ultimately, a combination of approaches is required to identify and validate potential enzyme inhibitors.
Here, we describe a method developed to purify and assay HAT1 enzyme activity using the click co-factor 4-pentynoyl-CoA24. This assay (Figure 1) uses the native enzyme sequence in complex with its required partner protein Rbap46, which has been shown to boost enzyme activity. Purification of the enzyme from human cells allows for enzyme activation in cellulo, which may preserve stimulating post-translational modifications important for full enzyme activity. Design and optimization of recombinant enzyme assays for high-throughput chemical screens have successfully been used to identify and characterize HAT1 small molecule inhibitors.

著者スポットライト:HAT1阻害剤スクリーニングのためのアセチルクリックアッセイの開発

ヒストンアセチルトランスフェラーゼ1アセチル化を測定するためのアセチルクリックケミストリーアッセイ

Our developed acetyl-click assay serves as a tool to assess HAT1 acetyl transferase activity, which is key in isolating H4 histones before nucleosome incorporation. We aim to use this method for high throughput screening of small molecule inhibitors against the HAT1 enzyme. This method measures enzymatic activity directly on the peptide substrate.This offers advantages compared to other enzymatic assays by avoiding biologic variability and antibody related costs. This is also high throughput and can be adapted to use with other acetyl transferases. We have recently published a small molecule HAT1 inhibitor based on this assay that has activity in cells and animals.We continue to use this assay to screen additional chemical libraries and perform structure activity relationships. We are advancing methods to track histone production, folding, chaperoning, and chromatin integration. This highlights the need for improved chemical tools to explore biological mechanisms and stimulate drug discovery.Our goal is to demonstrate that targeting histone production can have therapeutic benefit for diseases such as cancer.

適切なアッセイ性能を確保するために、すべてのプレートに重複した標準曲線(16ウェル)を含める必要があります。検量線データは、溶液中の Pra 含有ペプチドと未変性 H4 ペプチドの比率に応じて、100% から 0% の範囲で表形式で設定する必要があります(表 1)。アンプレックスレッドシグナルは、100% pra/0% ネイティブ H4 ペプチドウェルで最も高く、0% pra/100% ネイティブ H4 ペプチド?...

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特定の阻害剤をスクリーニングするための迅速かつ正確な化学アッセイは、医薬品開発の武器庫における重要なツールです。ここでは、HAT1アセチル化活性の阻害を測定するためのスケーラブルなアセチルクリックケミストリーアッセイを紹介します。

HAT1, also known as Histone acetyltransferase 1, plays a crucial role in chromatin synthesis by stabilizing and acetylating nascent H4 before nucleosome ...

当社が開発したアセチルクリックアッセイは、ヌクレオソーム取り込み前にH4ヒストンを単離する上で重要なHAT1アセチルトランスフェラーゼ活性を評価するためのツールとして機能します。この分析法を、HAT1酵素に対する低分子阻害剤のハイスループットスクリーニングに用いることを目指しています。この方法では、ペプチド基質上の酵素活性を直接測定します。これは、生物学的なばらつきや抗体関連コストを回避することで、他の酵素アッセイと比較して利点があります。これはハイスループットでもあり、他のアセチルトランスフェラーゼとの使用にも適合させることができます。私たちは最近、このアッセイに基づいて、細胞や動物で活性を持つ低分子HAT1阻害剤を発表しました。このアッセイは、追加の化学ライブラリーをスクリーニングし、構造活性相関を実行するために引き続き使用されます。私たちは、ヒストンの産生、フォールディング、シャペロン、クロマチンの取り分を追跡する方法を進歩させています。このことは、生物学的メカニズムを探求し、創薬を刺激するための改良された化学ツールの必要性を浮き彫りにしています。私たちの目標は、ヒストン産生を標的とすることで、がんなどの疾患に治療効果があることを実証することです。

an-acetyl-click-chemistry-assay-to-measure-histone-acetyltransferase

Research

JoVE Journal

Biochemistry

An Acetyl-Click Chemistry Assay to Measure Histone Acetyltransferase 1 Acetylation

HAT1, also known as Histone acetyltransferase 1, plays a crucial role in chromatin synthesis by stabilizing and acetylating nascent H4 before nucleosome assembly. It is required for tumor growth in various systems, making it a potential target for cancer treatment. To facilitate the identification of compounds that can inhibit HAT1 enzymatic activity, we have devised an acetyl-click assay for rapid screening. In this simple assay, we employ recombinant HAT1/Rbap46, which is purified from activated human cells. The method utilizes the acetyl-CoA analog 4-pentynoyl-CoA (4P) in a click-chemistry approach. This involves the enzymatic transfer of an alkyne handle through a HAT1-dependent acylation reaction to a biotinylated H4 N-terminal peptide. The captured peptide is then immobilized on neutravidin plates, followed by click-chemistry functionalization with biotin-azide. Subsequently, streptavidin-peroxidase recruitment is employed to oxidize amplex red, resulting in a quantitative fluorescent output. By introducing chemical inhibitors during the acylation reaction, we can quantify enzymatic inhibition based on a reduction of the fluorescence signal. Importantly, this reaction is scalable, allowing for high throughput screening of potential inhibitors for HAT1 enzymatic activity.

Quick and accurate chemical assays to screen for specific inhibitors are an important tool in the drug development arsenal. Here, we present a scalable acetyl-click chemistry assay to measure the inhibition of HAT1 acetylation activity.