Name: Autor destacado: Desarrollo del ensayo de acetil-clic para el cribado de inhibidores de HAT1
Uploaded: 2024-01-26T14:20:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Author Spotlight: Developing Acetyl-Click Assay for HAT1 Inhibitor Screening at JoVE.com

Agradecemos a George Zheng por proporcionar H4K12CoA. Agradecemos a los miembros de Gruber Lab por sus útiles discusiones y comentarios. Agradecemos el apoyo de los NIH/NCI (1K08CA245024), CPRIT (RR200090) y la Fundación V (V2022-022).

1. Método 1: Producción y purificación del complejo recombinante HAT1/Rbap46
<ol><li>Descongelación, recuperación y expansión de células HEK293f<ol><li>Descongele 1-10 millones de células de mamíferos HEK293f26 en 30 ml de medios de expresión freestyle 293 en un matraz de 100 ml. Incubar en 8% de CO2 a 37 °C mientras gira a 60 rpm.</li>
		<li>Al día siguiente, cuente y verifique la viabilidad de la celda, luego ajuste la velocidad de rotación a 120 rpm. E...

Desarrollo de un ensayo basado en clic para el cribado de la actividad de la enzima HAT1

<ol>
	<li>Kleff, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+gene+encoding+a+yeast+histone+H4+acetyltransferase.">Identification of a gene encoding a yeast histone H4 acetyltransferase.</a> J Biol Chem. 270 (42), 24674-24677 (1995).</li><li>Parthun, M. R., Widom, J., Gottschling, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+major+cytoplasmic+histone+acetyltransferase+in+yeast:+links+to+chromatin+replication+and+histone+metabolism.">The major cytoplasmic histone acetyltransferase in yeast: links to chromatin replication and histone metabolism.</a> Cell. 87 (1), 85-94 (1996).</li><li>Verreault, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleosomal+DNA+regulates+the+core-histone-binding+subunit+of+the+human+Hat1+acetyltransferase.">Nucleosomal DNA regulates the core-histone-binding subunit of the human Hat1 acetyltransferase.</a> Curr Biol. 8 (2), 96-108 (1998).</li><li>Parthun, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+acetyltransferase+1:+more+than+just+an+enzyme.">Histone acetyltransferase 1: more than just an enzyme.</a> Biochim Biophys Acta. 1819 (3-4), 256-263 (2013).</li><li>Gruber, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HAT1+coordinates+histone+production+and+acetylation+via+H4+promoter+binding.">HAT1 coordinates histone production and acetylation via H4 promoter binding.</a> Mol Cell. 75 (4), 711-724 e5 (2019).</li><li>Fan, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overexpressed+histone+acetyltransferase+1+regulates+cancer+immunity+by+increasing+programmed+death-ligand+1+expression+in+pancreatic+cancer.">Overexpressed histone acetyltransferase 1 regulates cancer immunity by increasing programmed death-ligand 1 expression in pancreatic cancer.</a> J Exp Clin Cancer Res. 38 (1), 47 (2019).</li><li>Xia, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA-377+exerts+a+potent+suppressive+role+in+osteosarcoma+through+the+involvement+of+the+histone+acetyltransferase+1-mediated+Wnt+axis.">MicroRNA-377 exerts a potent suppressive role in osteosarcoma through the involvement of the histone acetyltransferase 1-mediated Wnt axis.</a> J Cell Physiol. 234 (12), 22787-22798 (2019).</li><li>Yang, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+acetyltransferase+1+is+a+succinyltransferase+for+histones+and+non-histones+and+promotes+tumorigenesis.">Histone acetyltransferase 1 is a succinyltransferase for histones and non-histones and promotes tumorigenesis.</a> EMBO Rep. 22 (2), e50967 (2021).</li><li>Xue, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNAi+screening+identifies+HAT1+as+a+potential+drug+target+in+esophageal+squamous+cell+carcinoma.">RNAi screening identifies HAT1 as a potential drug target in esophageal squamous cell carcinoma.</a> Int J Clin Exp Pathol. 7 (7), 3898-3907 (2014).</li><li>Zhang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+plasticity+of+histones+H3-H4+facilitates+their+allosteric+exchange+between+RbAp48+and+ASF1.">Structural plasticity of histones H3-H4 facilitates their allosteric exchange between RbAp48 and ASF1.</a> Nat Struct Mol Biol. 20 (1), 29-35 (2013).</li><li>Campos, E. 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A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+multiple+roles+for+histone+acetyltransferase+1+in+replication-coupled+chromatin+assembly.">Identification of multiple roles for histone acetyltransferase 1 in replication-coupled chromatin assembly.</a> Nucleic Acids Res. 45 (16), 9319-9335 (2017).</li><li>Nagarajan, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+acetyl+transferase+1+is+essential+for+mammalian+development,+genome+stability,+and+the+processing+of+newly+synthesized+histones+H3+and+H4.">Histone acetyl transferase 1 is essential for mammalian development, genome stability, and the processing of newly synthesized histones H3 and H4.</a> PLoS Genet. 9 (6), e1003518 (2013).</li><li>Annunziato, A. 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L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assay+interference+and+off-target+liabilities+of+reported+histone+acetyltransferase+inhibitors.">Assay interference and off-target liabilities of reported histone acetyltransferase inhibitors.</a> Nat Commun. 8 (1), 1527 (2017).</li><li>Baell, J. B., Miao, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+acetyltransferase+inhibitors:+where+art+thou.">Histone acetyltransferase inhibitors: where art thou.</a> Future Med Chem. 8 (13), 1525-1528 (2016).</li><li>Lasko, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+of+a+selective+catalytic+p300/CBP+inhibitor+that+targets+lineage-specific+tumours.">Discovery of a selective catalytic p300/CBP inhibitor that targets lineage-specific tumours.</a> Nature. 550 (7674), 128-132 (2017).</li><li>Baell, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibitors+of+histone+acetyltransferases+KAT6A/B+induce+senescence+and+arrest+tumour+growth.">Inhibitors of histone acetyltransferases KAT6A/B induce senescence and arrest tumour growth.</a> Nature. 560 (7717), 253-257 (2018).</li><li>Falk, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+efficient+high-throughput+screening+method+for+MYST+family+acetyltransferases,+a+new+class+of+epigenetic+drug+targets.">An efficient high-throughput screening method for MYST family acetyltransferases, a new class of epigenetic drug targets.</a> J Biomol Screen. 16 (10), 1196-1205 (2011).</li><li>He, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+biology+approaches+for+investigating+the+functions+of+lysine+acetyltransferases.">Chemical biology approaches for investigating the functions of lysine acetyltransferases.</a> Angew Chem Int Ed Engl. 57 (5), 1162-1184 (2018).</li><li>Lipchik, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+peptide-based+biosensor+assay+to+detect+intracellular+Syk+kinase+activation+and+inhibition.">A peptide-based biosensor assay to detect intracellular Syk kinase activation and inhibition.</a> Biochemistry. 51 (38), 7515-7524 (2012).</li><li>Song, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemoproteomic+profiling+of+protein+substrates+of+a+major+lysine+acetyltransferase+in+the+native+cellular+context.">Chemoproteomic profiling of protein substrates of a major lysine acetyltransferase in the native cellular context.</a> ACS Chem Biol. 17 (5), 1092-1102 (2022).</li><li>Gaddameedi, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acetyl-click+screening+platform+identifies+small-molecule+inhibitors+of+histone+acetyltransferase+1+(HAT1).">Acetyl-click screening platform identifies small-molecule inhibitors of histone acetyltransferase 1 (HAT1).</a> J Med Chem. 66 (8), 5774-5801 (2023).</li><li>Ngo, L., Brown, T., Zheng, Y. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bisubstrate+inhibitors+to+target+histone+acetyltransferase+1+(HAT1).">Bisubstrate inhibitors to target histone acetyltransferase 1 (HAT1).</a> Chem Biol Drug Des. 93 (5), 865-873 (2019).</li><li>Parker, C. G., Pratt, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Click+chemistry+in+proteomic+investigations.">Click chemistry in proteomic investigations.</a> Cell. 180 (4), 605-632 (2020).</li><li>Islam, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+bump-and-hole+tactic:+Expanding+the+scope+of+chemical+genetics.">The bump-and-hole tactic: Expanding the scope of chemical genetics.</a> Cell Chem Biol. 25 (10), 1171-1184 (2018).</li><li>Radziwon, K., Weeks, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+engineering+for+selective+proteomics.">Protein engineering for selective proteomics.</a> Curr Opin Chem Biol. 60, 10-19 (2021).</li><li>Rich, R. L., Myszka, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Survey+of+the+year+2007+commercial+optical+biosensor+literature.">Survey of the year 2007 commercial optical biosensor literature.</a> J Mol Recognit. 21 (6), 355-400 (2008).</li></ol>

En la última década, la química de clic se volvió prominente20, permitiendo el diseño preciso de estructuras químicas que interactúan. En este contexto, diversas conexiones covalentes bioortogonales21 han surgido como opciones prometedoras para la formación de complejos en su entorno natural. La química de clic emplea pares de grupos funcionales que exhiben reacciones rápidas y selectivas, comúnmente conocidas como "reacciones de clic". Estas reacciones se produc...

Entre las numerosas acetiltransferasas eucariotas, HAT1 fue la histona acetiltransferasa inicial que se aisló 1,2,3. Investigaciones posteriores han establecido firmemente su papel fundamental en la replicación de la cromatina, particularmente en la síntesis de nuevos nucleosomas durante la faseS 4. Nuestros esfuerzos de investigación condujeron al reconocimiento de que HAT1 está altamente estimulado por el tratamiento con factor de crecimiento epidérmico (EGF) en células mamarias5. Además, ha salido a la luz que HAT1 es necesaria para la rápida proliferación celular y la formación de tumores in vivo 6,7,8,9. Los datos indican que HAT1 es fundamental en la coordinación de los procesos anabólicos y epigenéticos para la división celular, impulsando el crecimiento tumoral.
HAT1 diacetila la cola aminoterminal de la histona H4 en las lisinas 5 y 12 en complejo con la proteína chaperona Rbap46, que se une a la histona y presenta el aminoterminal a HAT1. Los tetrámeros de histonas o disomas10, junto con HAT1/Rbap46 y otras chaperonas de histonas11, se importan al núcleo. A continuación, se liberan histonas para depositarlas en la horquilla de replicación u otros sitios para apoyar la activación o represión de genes. La función de la marca de diacetilación HAT1 en la histona H4 no se comprende completamente. Es probable que se elimine rápidamente en un lapso de 15 a 30 minutos por la acción de las histonas desacetilasas 12,13,14,15 después de que H4 se inserta en la cromatina. Por lo tanto, la marca de diacetilación HAT1 no se propaga en la cromatina y puede no cumplir un verdadero papel epigenético, aunque se ha postulado un papel en el reclutamiento de enzimas modificadoras de la cromatina a la cromatinanaciente 12. Además, HAT1 no acetilla directamente la cromatina; Su actividad se restringe a las histonas solubles.
El desarrollo de inhibidores de la acetiltransferasa de histonas de moléculas pequeñas se ha visto obstaculizado por ensayos inespecíficos y de bajo rendimiento, lo que a menudo resulta en la generación de compuestos biológicamente reactivos16,17. El ensayo de referencia para medir las actividades de la acetiltransferasa requiere el uso de 3-H-acetil-coA, lo que limita el rendimiento y requiere radiación. No obstante, recientemente, se han descrito y confirmado inhibidores de la acetiltransferasa de moléculas pequeñas específicos y muy potentes dirigidos a CBP/p30018 y KAT6A/B19,20 mediante el uso de 3-H-acetil-CoA. De cara al futuro, se están diseñando ensayos mejorados para lograr un mejor rendimiento y evitar riesgos de laboratorio.
Los avances recientes en el monitoreo de la acetilación21 han utilizado la química de clic para permitir el monitoreo de reacciones enzimáticas. Hay una variedad de precursores habilitados para clics a los que se puede acceder por rutas sintéticas simples o disponibles para su compra que se pueden incorporar en reacciones enzimáticas. Estas reacciones se llevan a cabo típicamente en sistemas recombinantes, aunque los ensayos basados en células también son factibles22. La ventaja de los cofactores y sustratos habilitados para clic es que el cribado puede medir directamente la actividad enzimática sin necesidad de sistemas de lectura acoplados que a menudo se ven perturbados por los compuestos de cribado y requieren pasos de manipulación adicionales. Esto permite tratamientos con inhibidores solo durante la etapa enzimática, mientras que todas las etapas posteriores de funcionalización y detección se llevan a cabo después de un lavado extenso para eliminar los compuestos, lo que limita la posibilidad de que se produzcan interferencias en el ensayo. Estas ventajas hacen que el diseño de los ensayos habilitados para clic sea preferible a los ensayos acoplados que comúnmente se basan en la detección de coenzima A libre.
Una consideración importante es la aceptación de los cofactores habilitados para hacer clic en el sitio activo de la enzima. Es posible que los cofactores habilitados para clics existentes no sean totalmente compatibles con el sitio activo optimizado para el cofactor nativo. La información estructural y el modelado se pueden utilizar para diseñar sustituciones de aminoácidos para ampliar el sitio activo e incorporar sustratos alterados23. Esto puede permitir un cribado con una cinética enzimática mejorada y niveles más bajos de sustrato y enzimas. El inconveniente de este enfoque es que las bolsas catalíticas alteradas pueden no identificar los inhibidores que interactúan fuertemente con la enzima nativa. En última instancia, se requiere una combinación de enfoques para identificar y validar posibles inhibidores enzimáticos.
Aquí, describimos un método desarrollado para purificar y ensayar la actividad de la enzima HAT1 utilizando el cofactor clic 4-pentinoil-CoA24. Este ensayo (Figura 1) utiliza la secuencia de la enzima nativa en complejo con su proteína asociada requerida Rbap46, que se ha demostrado que aumenta la actividad enzimática. La purificación de la enzima a partir de células humanas permite la activación enzimática en el celulo, lo que puede preservar modificaciones postraduccionales estimulantes importantes para la actividad enzimática completa. El diseño y la optimización de ensayos enzimáticos recombinantes para cribados químicos de alto rendimiento se han utilizado con éxito para identificar y caracterizar inhibidores de moléculas pequeñas HAT1.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>4P CoA</td>
			<td>Cayman Chemical</td>
			<td>10547</td>
			<td>Click chemistry co-factor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amplex Red</td>
			<td>Fisher Sci</td>
			<td>A12222</td>
			<td>Fluorescence substrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin-PEG-Azide</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>J64996MC</td>
			<td>Click chemistry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Copper Sulfate</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>&#160;7758-98-7</td>
			<td>Click chemistry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>&#160;67-68-5</td>
			<td>diluent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>03-12-3483</td>
			<td>reducting agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forskolin</td>
			<td>VWR</td>
			<td>102987-310</td>
			<td>Protein expression</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freestyle 293 Expression Medium</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>12338018</td>
			<td>Media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freestyle 293-F cells</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>R790-07</td>
			<td>Protein expression</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H4-peptide/1-23-GGK-biotin</td>
			<td>Anaspec</td>
			<td>AS65097</td>
			<td>peptide substrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>&#160;7365-45-9</td>
			<td>EB buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen peroxide 30% solution</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>&#160;Z00183-99-0</td>
			<td>initiator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M2 FLAG antibody slurry</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>A2220</td>
			<td>Protein purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Macrosep 10K Filter (Pall Lab)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89131-980</td>
			<td>Protein purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neutravidin Plate</td>
			<td>Thermo Sci</td>
			<td>15127</td>
			<td>BSA-pre-blocked</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NP40 (IGEPAL)</td>
			<td>MP Biomedical</td>
			<td>198596</td>
			<td>20x buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pHEK-293 plasmid</td>
			<td>Takara Bio</td>
			<td>3390</td>
			<td>Protein expression</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline 10x</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>&#160;Z00082-33-6</td>
			<td>wash buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pra peptide</td>
			<td>Genscript</td>
			<td>Custom synthesis</td>
			<td>biotinylated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Ascorbate</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>&#160;134-03-2</td>
			<td>Click chemistry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>&#160;7647-14-5</td>
			<td>EB buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>7558-80-7</td>
			<td>buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>189730</td>
			<td>competitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin-HRP</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>3999S</td>
			<td>enzyme</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>THPTA ligand</td>
			<td>Fisher Sci</td>
			<td>1010-500</td>
			<td>Click chemistry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris base</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>&#160;77-86-1</td>
			<td>20x buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton-X 100</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>&#160;9002-93-1</td>
			<td>EB buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>&#160;9005-64-5</td>
			<td>Wash buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>57-13-6</td>
			<td>quencher</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an acetyl-click chemistry assay to measure histone acetyltransferase 1 acetylation

HAT1, también conocida como histona acetiltransferasa 1, desempeña un papel crucial en la síntesis de cromatina al estabilizar y acetilar el H4 naciente antes del ensamblaje de nucleosomas. Es necesario para el crecimiento tumoral en varios sistemas, lo que lo convierte en un objetivo potencial para el tratamiento del cáncer. Para facilitar la identificación de compuestos que pueden inhibir la actividad enzimática de HAT1, hemos ideado un ensayo de clic acetil para un cribado rápido. En este sencillo ensayo, empleamos HAT1/Rbap46 recombinante, que se purifica a partir de células humanas activadas. El método utiliza el análogo de acetil-CoA 4-pentinoil-CoA (4P) en un enfoque de química de clic. Esto implica la transferencia enzimática de un mango alquino a través de una reacción de acilación dependiente de HAT1 a un péptido N-terminal H4 biotinilado. A continuación, el péptido capturado se inmoviliza en placas de neutravidina, seguido de una funcionalización química con biotina-azida. Posteriormente, se emplea el reclutamiento de estreptavidina-peroxidasa para oxidar el rojo amplex, lo que da como resultado una salida fluorescente cuantitativa. Mediante la introducción de inhibidores químicos durante la reacción de acilación, podemos cuantificar la inhibición enzimática en función de una reducción de la señal de fluorescencia. Es importante destacar que esta reacción es escalable, lo que permite un cribado de alto rendimiento de posibles inhibidores de la actividad enzimática de HAT1.

Among the numerous eukaryotic acetyltransferases, HAT1 was the initial histone acetyltransferase to be isolated1,2,3. Subsequent investigations have firmly established its pivotal role in chromatin replication, particularly in the synthesis of new nucleosomes during S-phase4. Our research endeavors led to the recognition that HAT1 is highly stimulated by epidermal growth factor (EGF) treatment in mammary cells5. Furthermore, it has come to light that HAT1 is required for rapid cell proliferation and tumor formation in vivo6,7,8,9. Data indicate that HAT1 is critical in coordinating anabolic and epigenetic processes for cell division, driving tumor growth.
HAT1 di-acetylates the amino-terminal tail of histone H4 on lysines 5 and 12 in complex with the chaperone protein Rbap46, which binds the histone and presents the amino-terminus to HAT1. Histone tetramers or disomes10, together with HAT1/Rbap46 and other histone chaperones11, are then imported to the nucleus. Histones are then released to be deposited at the replication fork, or other sites to support gene activation or repression. The function of the HAT1 di-acetylation mark on histone H4 is not fully understood. It is likely quickly removed within a span of 15-30 min by the action of histone deacetylases12,13,14,15 after H4 is inserted into chromatin. Thus, the HAT1 di-acetylation mark is not propagated in chromatin and may not serve a true epigenetic role, although a role in the recruitment of chromatin-modifying enzymes to nascent chromatin has been postulated12. Also, HAT1 does not directly acetylate chromatin; its activity is restricted to soluble histones.
The development of small-molecule histone acetyltransferase inhibitors has been hampered by nonspecific and low-throughput assays, often resulting in the generation of biologically reactive compounds16,17.&#160;The gold-standard assay to measure acetyltransferase activities requires the use of 3H-acetyl-coA, which limits throughput and requires radiation. Nonetheless, recently, specific and highly potent small molecule acetyltransferase inhibitors targeting CBP/p30018 and KAT6A/B19,20 have been described and confirmed through the use of 3H-acetyl-CoA. Moving forward, improved assays to achieve better throughput and avoid laboratory hazards are being devised.
Recent advances in acetylation monitoring21 have used click chemistry to enable enzymatic reaction monitoring. There are a variety of click-enabled precursors that are accessible by simple synthetic routes or available for purchase that can be incorporated into enzyme reactions. These reactions are typically carried out in recombinant systems, although cell-based assays are also feasible22. The advantage of click-enabled co-factors and substrates is that screening can directly measure enzyme activity without the need for coupled read-out systems that are often perturbed by screening compounds and require additional handling steps. This allows for inhibitor treatments only during the enzymatic step, whereas all downstream functionalization and detection steps are carried out after extensive washing to remove compounds, thus limiting the potential for assay interference to occur. These advantages make the design of click-enabled assays preferable to coupled assays that commonly rely on the detection of free coenzyme A.
One important consideration is the acceptance of click-enabled co-factors into the enzyme active site. Existing click-enabled co-factors may not be fully compatible with the active site optimized for the native co-factor. Structural information and modeling can be used to design amino acid substitutions to enlarge the active site to incorporate altered substrates23. This may enable screening with improved enzyme kinetics and lower substrate and enzyme levels. The drawback of this approach is that altered catalytic pockets may not identify inhibitors that interact strongly with the native enzyme. Ultimately, a combination of approaches is required to identify and validate potential enzyme inhibitors.
Here, we describe a method developed to purify and assay HAT1 enzyme activity using the click co-factor 4-pentynoyl-CoA24. This assay (Figure 1) uses the native enzyme sequence in complex with its required partner protein Rbap46, which has been shown to boost enzyme activity. Purification of the enzyme from human cells allows for enzyme activation in cellulo, which may preserve stimulating post-translational modifications important for full enzyme activity. Design and optimization of recombinant enzyme assays for high-throughput chemical screens have successfully been used to identify and characterize HAT1 small molecule inhibitors.

Autor destacado: Desarrollo del ensayo de acetil-clic para el cribado de inhibidores de HAT1

Un ensayo químico de acetil-clic para medir la acetilación de la acetil 1 de la histona acetiltransferasa 1

Our developed acetyl-click assay serves as a tool to assess HAT1 acetyl transferase activity, which is key in isolating H4 histones before nucleosome incorporation. We aim to use this method for high throughput screening of small molecule inhibitors against the HAT1 enzyme. This method measures enzymatic activity directly on the peptide substrate.This offers advantages compared to other enzymatic assays by avoiding biologic variability and antibody related costs. This is also high throughput and can be adapted to use with other acetyl transferases. We have recently published a small molecule HAT1 inhibitor based on this assay that has activity in cells and animals.We continue to use this assay to screen additional chemical libraries and perform structure activity relationships. We are advancing methods to track histone production, folding, chaperoning, and chromatin integration. This highlights the need for improved chemical tools to explore biological mechanisms and stimulate drug discovery.Our goal is to demonstrate that targeting histone production can have therapeutic benefit for diseases such as cancer.

Se deben incluir curvas estándar duplicadas (16 pocillos) en cada placa para garantizar el rendimiento adecuado del ensayo. Los datos de la curva estándar deben configurarse en forma de tabla, con un rango de 100% a 0% de acuerdo con la proporción de péptido que contiene Pra y péptido H4 nativo en solución (Tabla 1). La señal roja Amplex será la más alta en los pocillos peptídicos H4 nativos al 100 % y la más baja en los pocillos peptídicos H4 nativos al 0 % pra/100 % H4 nativos. Una vez que ...

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Los ensayos químicos rápidos y precisos para detectar inhibidores específicos son una herramienta importante en el arsenal de desarrollo de fármacos. Aquí, presentamos un ensayo químico escalable de acetil-clic para medir la inhibición de la actividad de acetilación de HAT1.

HAT1, also known as Histone acetyltransferase 1, plays a crucial role in chromatin synthesis by stabilizing and acetylating nascent H4 before nucleosome ...

Nuestro ensayo de clic de acetil desarrollado sirve como herramienta para evaluar la actividad de la acetiltransferasa HAT1, que es clave para aislar las histonas H4 antes de la incorporación de nucleosomas. Nuestro objetivo es utilizar este método para el cribado de alto rendimiento de inhibidores de moléculas pequeñas contra la enzima HAT1. Este método mide la actividad enzimática directamente sobre el sustrato peptídico.Esto ofrece ventajas en comparación con otros ensayos enzimáticos, ya que evita la variabilidad biológica y los costes relacionados con los anticuerpos. Esto también es de alto rendimiento y se puede adaptar para su uso con otras acetiltransferasas. Recientemente hemos publicado un inhibidor de HAT1 de molécula pequeña basado en este ensayo que tiene actividad en células y animales.Continuamos usando este ensayo para examinar bibliotecas químicas adicionales y realizar relaciones de actividad estructural. Estamos avanzando en métodos para rastrear la producción de histonas, el plegamiento, el acompañamiento y la integración de la cromatina. Esto pone de relieve la necesidad de mejorar las herramientas químicas para explorar los mecanismos biológicos y estimular el descubrimiento de fármacos.Nuestro objetivo es demostrar que dirigirse a la producción de histonas puede tener un beneficio terapéutico para enfermedades como el cáncer.

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Research

JoVE Journal

Biochemistry

An Acetyl-Click Chemistry Assay to Measure Histone Acetyltransferase 1 Acetylation

HAT1, also known as Histone acetyltransferase 1, plays a crucial role in chromatin synthesis by stabilizing and acetylating nascent H4 before nucleosome assembly. It is required for tumor growth in various systems, making it a potential target for cancer treatment. To facilitate the identification of compounds that can inhibit HAT1 enzymatic activity, we have devised an acetyl-click assay for rapid screening. In this simple assay, we employ recombinant HAT1/Rbap46, which is purified from activated human cells. The method utilizes the acetyl-CoA analog 4-pentynoyl-CoA (4P) in a click-chemistry approach. This involves the enzymatic transfer of an alkyne handle through a HAT1-dependent acylation reaction to a biotinylated H4 N-terminal peptide. The captured peptide is then immobilized on neutravidin plates, followed by click-chemistry functionalization with biotin-azide. Subsequently, streptavidin-peroxidase recruitment is employed to oxidize amplex red, resulting in a quantitative fluorescent output. By introducing chemical inhibitors during the acylation reaction, we can quantify enzymatic inhibition based on a reduction of the fluorescence signal. Importantly, this reaction is scalable, allowing for high throughput screening of potential inhibitors for HAT1 enzymatic activity.

Quick and accurate chemical assays to screen for specific inhibitors are an important tool in the drug development arsenal. Here, we present a scalable acetyl-click chemistry assay to measure the inhibition of HAT1 acetylation activity.