Name: Författare i fokus: Utveckling av acetylklickanalys för screening av HAT1-hämmare
Uploaded: 2024-01-26T14:20:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Author Spotlight: Developing Acetyl-Click Assay for HAT1 Inhibitor Screening at JoVE.com

Vi tackar George Zheng för att han tillhandahöll H4K12CoA. Vi tackar medlemmarna i Gruber-labbet för hjälpsamma diskussioner och feedback. Vi tackar för stöd från NIH/NCI (1K08CA245024), CPRIT (RR200090) och V Foundation (V2022-022).

1. Metod 1: Producera och rena rekombinant HAT1/Rbap46-komplex
<ol><li>Upptining, återvinning och expansion av HEK293f-celler<ol><li>Tina 1-10 miljoner HEK293f däggdjursceller26 till 30 ml freestyle 293 expressionsmedia i en 100 mL kolv. Inkubera i 8 % CO2 vid 37 °C under rotation med 60 rpm.</li>
		<li>Nästa dag, räkna och kontrollera cellens viabilitet och justera sedan rotationshastigheten till 120 rpm. Expandera till 300 ml odling i en 1 L kolv, bibehåll så...

Utveckling av en klickbaserad analys för screening av HAT1-enzymaktivitet

<ol>
	<li>Kleff, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+gene+encoding+a+yeast+histone+H4+acetyltransferase.">Identification of a gene encoding a yeast histone H4 acetyltransferase.</a> J Biol Chem. 270 (42), 24674-24677 (1995).</li><li>Parthun, M. R., Widom, J., Gottschling, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+major+cytoplasmic+histone+acetyltransferase+in+yeast:+links+to+chromatin+replication+and+histone+metabolism.">The major cytoplasmic histone acetyltransferase in yeast: links to chromatin replication and histone metabolism.</a> Cell. 87 (1), 85-94 (1996).</li><li>Verreault, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleosomal+DNA+regulates+the+core-histone-binding+subunit+of+the+human+Hat1+acetyltransferase.">Nucleosomal DNA regulates the core-histone-binding subunit of the human Hat1 acetyltransferase.</a> Curr Biol. 8 (2), 96-108 (1998).</li><li>Parthun, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+acetyltransferase+1:+more+than+just+an+enzyme.">Histone acetyltransferase 1: more than just an enzyme.</a> Biochim Biophys Acta. 1819 (3-4), 256-263 (2013).</li><li>Gruber, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HAT1+coordinates+histone+production+and+acetylation+via+H4+promoter+binding.">HAT1 coordinates histone production and acetylation via H4 promoter binding.</a> Mol Cell. 75 (4), 711-724 e5 (2019).</li><li>Fan, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overexpressed+histone+acetyltransferase+1+regulates+cancer+immunity+by+increasing+programmed+death-ligand+1+expression+in+pancreatic+cancer.">Overexpressed histone acetyltransferase 1 regulates cancer immunity by increasing programmed death-ligand 1 expression in pancreatic cancer.</a> J Exp Clin Cancer Res. 38 (1), 47 (2019).</li><li>Xia, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA-377+exerts+a+potent+suppressive+role+in+osteosarcoma+through+the+involvement+of+the+histone+acetyltransferase+1-mediated+Wnt+axis.">MicroRNA-377 exerts a potent suppressive role in osteosarcoma through the involvement of the histone acetyltransferase 1-mediated Wnt axis.</a> J Cell Physiol. 234 (12), 22787-22798 (2019).</li><li>Yang, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+acetyltransferase+1+is+a+succinyltransferase+for+histones+and+non-histones+and+promotes+tumorigenesis.">Histone acetyltransferase 1 is a succinyltransferase for histones and non-histones and promotes tumorigenesis.</a> EMBO Rep. 22 (2), e50967 (2021).</li><li>Xue, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNAi+screening+identifies+HAT1+as+a+potential+drug+target+in+esophageal+squamous+cell+carcinoma.">RNAi screening identifies HAT1 as a potential drug target in esophageal squamous cell carcinoma.</a> Int J Clin Exp Pathol. 7 (7), 3898-3907 (2014).</li><li>Zhang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+plasticity+of+histones+H3-H4+facilitates+their+allosteric+exchange+between+RbAp48+and+ASF1.">Structural plasticity of histones H3-H4 facilitates their allosteric exchange between RbAp48 and ASF1.</a> Nat Struct Mol Biol. 20 (1), 29-35 (2013).</li><li>Campos, E. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+program+for+processing+newly+synthesized+histones+H3.1+and+H4.">The program for processing newly synthesized histones H3.1 and H4.</a> Nat Struct Mol Biol. 17 (11), 1343-1351 (2010).</li><li>Agudelo Garcia, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+multiple+roles+for+histone+acetyltransferase+1+in+replication-coupled+chromatin+assembly.">Identification of multiple roles for histone acetyltransferase 1 in replication-coupled chromatin assembly.</a> Nucleic Acids Res. 45 (16), 9319-9335 (2017).</li><li>Nagarajan, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+acetyl+transferase+1+is+essential+for+mammalian+development,+genome+stability,+and+the+processing+of+newly+synthesized+histones+H3+and+H4.">Histone acetyl transferase 1 is essential for mammalian development, genome stability, and the processing of newly synthesized histones H3 and H4.</a> PLoS Genet. 9 (6), e1003518 (2013).</li><li>Annunziato, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembling+chromatin:+the+long+and+winding+road.">Assembling chromatin: the long and winding road.</a> Biochim Biophys Acta. 1819 (3-4), 196-210 (2013).</li><li>Annunziato, A. T., Seale, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+deacetylation+is+required+for+the+maturation+of+newly+replicated+chromatin.">Histone deacetylation is required for the maturation of newly replicated chromatin.</a> J Biol Chem. 258 (20), 12675-12684 (1983).</li><li>Dahlin, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assay+interference+and+off-target+liabilities+of+reported+histone+acetyltransferase+inhibitors.">Assay interference and off-target liabilities of reported histone acetyltransferase inhibitors.</a> Nat Commun. 8 (1), 1527 (2017).</li><li>Baell, J. B., Miao, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+acetyltransferase+inhibitors:+where+art+thou.">Histone acetyltransferase inhibitors: where art thou.</a> Future Med Chem. 8 (13), 1525-1528 (2016).</li><li>Lasko, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+of+a+selective+catalytic+p300/CBP+inhibitor+that+targets+lineage-specific+tumours.">Discovery of a selective catalytic p300/CBP inhibitor that targets lineage-specific tumours.</a> Nature. 550 (7674), 128-132 (2017).</li><li>Baell, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibitors+of+histone+acetyltransferases+KAT6A/B+induce+senescence+and+arrest+tumour+growth.">Inhibitors of histone acetyltransferases KAT6A/B induce senescence and arrest tumour growth.</a> Nature. 560 (7717), 253-257 (2018).</li><li>Falk, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+efficient+high-throughput+screening+method+for+MYST+family+acetyltransferases,+a+new+class+of+epigenetic+drug+targets.">An efficient high-throughput screening method for MYST family acetyltransferases, a new class of epigenetic drug targets.</a> J Biomol Screen. 16 (10), 1196-1205 (2011).</li><li>He, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+biology+approaches+for+investigating+the+functions+of+lysine+acetyltransferases.">Chemical biology approaches for investigating the functions of lysine acetyltransferases.</a> Angew Chem Int Ed Engl. 57 (5), 1162-1184 (2018).</li><li>Lipchik, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+peptide-based+biosensor+assay+to+detect+intracellular+Syk+kinase+activation+and+inhibition.">A peptide-based biosensor assay to detect intracellular Syk kinase activation and inhibition.</a> Biochemistry. 51 (38), 7515-7524 (2012).</li><li>Song, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemoproteomic+profiling+of+protein+substrates+of+a+major+lysine+acetyltransferase+in+the+native+cellular+context.">Chemoproteomic profiling of protein substrates of a major lysine acetyltransferase in the native cellular context.</a> ACS Chem Biol. 17 (5), 1092-1102 (2022).</li><li>Gaddameedi, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acetyl-click+screening+platform+identifies+small-molecule+inhibitors+of+histone+acetyltransferase+1+(HAT1).">Acetyl-click screening platform identifies small-molecule inhibitors of histone acetyltransferase 1 (HAT1).</a> J Med Chem. 66 (8), 5774-5801 (2023).</li><li>Ngo, L., Brown, T., Zheng, Y. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bisubstrate+inhibitors+to+target+histone+acetyltransferase+1+(HAT1).">Bisubstrate inhibitors to target histone acetyltransferase 1 (HAT1).</a> Chem Biol Drug Des. 93 (5), 865-873 (2019).</li><li>Parker, C. G., Pratt, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Click+chemistry+in+proteomic+investigations.">Click chemistry in proteomic investigations.</a> Cell. 180 (4), 605-632 (2020).</li><li>Islam, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+bump-and-hole+tactic:+Expanding+the+scope+of+chemical+genetics.">The bump-and-hole tactic: Expanding the scope of chemical genetics.</a> Cell Chem Biol. 25 (10), 1171-1184 (2018).</li><li>Radziwon, K., Weeks, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+engineering+for+selective+proteomics.">Protein engineering for selective proteomics.</a> Curr Opin Chem Biol. 60, 10-19 (2021).</li><li>Rich, R. L., Myszka, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Survey+of+the+year+2007+commercial+optical+biosensor+literature.">Survey of the year 2007 commercial optical biosensor literature.</a> J Mol Recognit. 21 (6), 355-400 (2008).</li></ol>

Under det senaste decenniet har klickkemi blivit framträdande20, vilket möjliggör exakt design av interagerande kemiska strukturer. I detta sammanhang har olika bioortogonala kovalenta förbindelser21 dykt upp som lovande alternativ för att bilda komplex i deras naturliga miljö. Klickkemi använder par av funktionella grupper som uppvisar snabba och selektiva reaktioner, allmänt kända som "klickreaktioner". Dessa reaktioner sker effektivt under miljövänliga, skonsa...

Bland de många eukaryota acetyltransferaserna var HAT1 det första histonacetyltransferaset som isolerades 1,2,3. Efterföljande undersökningar har fastställt dess centrala roll i kromatinreplikation, särskilt i syntesen av nya nukleosomer under S-fas4. Vår forskning ledde till erkännandet att HAT1 stimuleras starkt av behandling med epidermal tillväxtfaktor (EGF) ibröstceller5. Vidare har det framkommit att HAT1 krävs för snabb cellproliferation och tumörbildning in vivo 6,7,8,9. Data indikerar att HAT1 är avgörande för att koordinera anabola och epigenetiska processer för celldelning, vilket driver tumörtillväxt.
HAT1 di-acetylerar den aminoterminala svansen av histon H4 på lysinerna 5 och 12 i komplex med chaperonproteinet Rbap46, som binder histonen och presenterar aminoterminalen för HAT1. Histontetramerer eller disomer10, tillsammans med HAT1/Rbap46 och andra histonchaperoner11, importeras sedan till kärnan. Histoner frigörs sedan för att deponeras vid replikationsgaffeln eller andra platser för att stödja genaktivering eller repression. Funktionen av HAT1-di-acetyleringsmärket på histon H4 är inte helt klarlagd. Det avlägsnas sannolikt snabbt inom ett spann av 15-30 minuter genom verkan av histondeacetylaser 12,13,14,15 efter att H4 sätts in i kromatin. Således är HAT1-di-acetyleringsmärket inte förökat i kromatin och kan inte tjäna en verklig epigenetisk roll, även om en roll i rekryteringen av kromatinmodifierande enzymer till begynnande kromatin har postulerats12. HAT1 innehåller inte heller direkt acetylatkromatin; Dess aktivitet är begränsad till lösliga histoner.
Utvecklingen av småmolekylära histonacetyltransferashämmare har hämmats av ospecifika analyser med låg genomströmning, vilket ofta resulterat i generering av biologiskt reaktiva föreningar16,17. Guldstandardanalysen för att mäta acetyltransferasaktiviteter kräver användning av 3H-acetyl-coA, vilket begränsar genomströmningen och kräver strålning. Icke desto mindre har nyligen specifika och mycket potenta småmolekylära acetyltransferashämmare riktade mot CBP/p30018 och KAT6A/B19,20 beskrivits och bekräftats genom användning av 3H-acetyl-CoA. Framöver håller man på att ta fram förbättrade analyser för att uppnå bättre genomströmning och undvika laboratorierisker.
De senaste framstegen inom acetyleringsövervakning21 har använt klickkemi för att möjliggöra enzymatisk reaktionsövervakning. Det finns en mängd klickaktiverade prekursorer som är tillgängliga via enkla syntetiska vägar eller finns att köpa som kan införlivas i enzymreaktioner. Dessa reaktioner utförs vanligtvis i rekombinanta system, även om cellbaserade analyser också är möjliga22. Fördelen med klickaktiverade co-faktorer och substrat är att screening direkt kan mäta enzymaktivitet utan behov av kopplade avläsningssystem som ofta störs av screeningföreningar och kräver ytterligare hanteringssteg. Detta möjliggör inhibitorbehandlingar endast under det enzymatiska steget, medan alla nedströms funktionaliserings- och detektionssteg utförs efter omfattande tvättning för att avlägsna föreningar, vilket begränsar risken för att analysinterferens uppstår. Dessa fördelar gör att utformningen av klickaktiverade analyser är att föredra framför kopplade analyser som vanligtvis förlitar sig på detektion av fritt koenzym A.
En viktig faktor är acceptansen av klickaktiverade co-faktorer i enzymets aktiva säte. Befintliga klickaktiverade kofaktorer kanske inte är helt kompatibla med den aktiva webbplatsen som är optimerad för den inbyggda kofaktorn. Strukturell information och modellering kan användas för att designa aminosyrasubstitutioner för att förstora det aktiva stället för att införliva förändrade substrat23. Detta kan möjliggöra screening med förbättrad enzymkinetik och lägre substrat- och enzymnivåer. Nackdelen med detta tillvägagångssätt är att förändrade katalytiska fickor kanske inte identifierar hämmare som interagerar starkt med det ursprungliga enzymet. I slutändan krävs en kombination av tillvägagångssätt för att identifiera och validera potentiella enzymhämmare.
Här beskriver vi en metod som utvecklats för att rena och analysera HAT1-enzymaktivitet med hjälp av klickkofaktorn 4-pentynoyl-CoA24. Denna analys (figur 1) använder den nativa enzymsekvensen i komplex med dess nödvändiga partnerprotein Rbap46, vilket har visat sig öka enzymaktiviteten. Rening av enzymet från mänskliga celler möjliggör enzymaktivering i cellulo, vilket kan bevara stimulerande posttranslationella modifieringar som är viktiga för full enzymaktivitet. Design och optimering av rekombinanta enzymanalyser för kemiska screeningar med hög genomströmning har framgångsrikt använts för att identifiera och karakterisera HAT1 småmolekylära hämmare.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>4P CoA</td>
			<td>Cayman Chemical</td>
			<td>10547</td>
			<td>Click chemistry co-factor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amplex Red</td>
			<td>Fisher Sci</td>
			<td>A12222</td>
			<td>Fluorescence substrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin-PEG-Azide</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>J64996MC</td>
			<td>Click chemistry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Copper Sulfate</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>&#160;7758-98-7</td>
			<td>Click chemistry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>&#160;67-68-5</td>
			<td>diluent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>03-12-3483</td>
			<td>reducting agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forskolin</td>
			<td>VWR</td>
			<td>102987-310</td>
			<td>Protein expression</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freestyle 293 Expression Medium</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>12338018</td>
			<td>Media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freestyle 293-F cells</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>R790-07</td>
			<td>Protein expression</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H4-peptide/1-23-GGK-biotin</td>
			<td>Anaspec</td>
			<td>AS65097</td>
			<td>peptide substrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>&#160;7365-45-9</td>
			<td>EB buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen peroxide 30% solution</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>&#160;Z00183-99-0</td>
			<td>initiator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M2 FLAG antibody slurry</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>A2220</td>
			<td>Protein purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Macrosep 10K Filter (Pall Lab)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89131-980</td>
			<td>Protein purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neutravidin Plate</td>
			<td>Thermo Sci</td>
			<td>15127</td>
			<td>BSA-pre-blocked</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NP40 (IGEPAL)</td>
			<td>MP Biomedical</td>
			<td>198596</td>
			<td>20x buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pHEK-293 plasmid</td>
			<td>Takara Bio</td>
			<td>3390</td>
			<td>Protein expression</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline 10x</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>&#160;Z00082-33-6</td>
			<td>wash buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pra peptide</td>
			<td>Genscript</td>
			<td>Custom synthesis</td>
			<td>biotinylated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Ascorbate</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>&#160;134-03-2</td>
			<td>Click chemistry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>&#160;7647-14-5</td>
			<td>EB buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>7558-80-7</td>
			<td>buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>189730</td>
			<td>competitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin-HRP</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>3999S</td>
			<td>enzyme</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>THPTA ligand</td>
			<td>Fisher Sci</td>
			<td>1010-500</td>
			<td>Click chemistry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris base</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>&#160;77-86-1</td>
			<td>20x buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton-X 100</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>&#160;9002-93-1</td>
			<td>EB buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>&#160;9005-64-5</td>
			<td>Wash buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>57-13-6</td>
			<td>quencher</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an acetyl-click chemistry assay to measure histone acetyltransferase 1 acetylation

HAT1, även känt som histonacetyltransferas 1, spelar en avgörande roll i kromatinsyntesen genom att stabilisera och acetylera begynnande H4 före nukleosommontering. Det krävs för tumörtillväxt i olika system, vilket gör det till ett potentiellt mål för cancerbehandling. För att underlätta identifieringen av substanser som kan hämma HAT1 enzymatisk aktivitet har vi tagit fram en acetylklickanalys för snabb screening. I denna enkla analys använder vi rekombinant HAT1/Rbap46, som renas från aktiverade mänskliga celler. Metoden använder acetyl-CoA-analogen 4-pentynoyl-CoA (4P) i en klickkemisk metod. Detta involverar den enzymatiska överföringen av ett alkynhandtag genom en HAT1-beroende acyleringsreaktion till en biotinylerad H4 N-terminal peptid. Den infångade peptiden immobiliseras sedan på neutravidinplattor, följt av klickkemisk funktionalisering med biotinazid. Därefter används streptavidin-peroxidasrekrytering för att oxidera amplexrött, vilket resulterar i en kvantitativ fluorescerande produktion. Genom att introducera kemiska hämmare under acyleringsreaktionen kan vi kvantifiera enzymatisk hämning baserat på en reduktion av fluorescenssignalen. Det är viktigt att notera att denna reaktion är skalbar, vilket möjliggör screening av potentiella hämmare av HAT1-enzymatisk aktivitet med hög genomströmning.

Among the numerous eukaryotic acetyltransferases, HAT1 was the initial histone acetyltransferase to be isolated1,2,3. Subsequent investigations have firmly established its pivotal role in chromatin replication, particularly in the synthesis of new nucleosomes during S-phase4. Our research endeavors led to the recognition that HAT1 is highly stimulated by epidermal growth factor (EGF) treatment in mammary cells5. Furthermore, it has come to light that HAT1 is required for rapid cell proliferation and tumor formation in vivo6,7,8,9. Data indicate that HAT1 is critical in coordinating anabolic and epigenetic processes for cell division, driving tumor growth.
HAT1 di-acetylates the amino-terminal tail of histone H4 on lysines 5 and 12 in complex with the chaperone protein Rbap46, which binds the histone and presents the amino-terminus to HAT1. Histone tetramers or disomes10, together with HAT1/Rbap46 and other histone chaperones11, are then imported to the nucleus. Histones are then released to be deposited at the replication fork, or other sites to support gene activation or repression. The function of the HAT1 di-acetylation mark on histone H4 is not fully understood. It is likely quickly removed within a span of 15-30 min by the action of histone deacetylases12,13,14,15 after H4 is inserted into chromatin. Thus, the HAT1 di-acetylation mark is not propagated in chromatin and may not serve a true epigenetic role, although a role in the recruitment of chromatin-modifying enzymes to nascent chromatin has been postulated12. Also, HAT1 does not directly acetylate chromatin; its activity is restricted to soluble histones.
The development of small-molecule histone acetyltransferase inhibitors has been hampered by nonspecific and low-throughput assays, often resulting in the generation of biologically reactive compounds16,17.&#160;The gold-standard assay to measure acetyltransferase activities requires the use of 3H-acetyl-coA, which limits throughput and requires radiation. Nonetheless, recently, specific and highly potent small molecule acetyltransferase inhibitors targeting CBP/p30018 and KAT6A/B19,20 have been described and confirmed through the use of 3H-acetyl-CoA. Moving forward, improved assays to achieve better throughput and avoid laboratory hazards are being devised.
Recent advances in acetylation monitoring21 have used click chemistry to enable enzymatic reaction monitoring. There are a variety of click-enabled precursors that are accessible by simple synthetic routes or available for purchase that can be incorporated into enzyme reactions. These reactions are typically carried out in recombinant systems, although cell-based assays are also feasible22. The advantage of click-enabled co-factors and substrates is that screening can directly measure enzyme activity without the need for coupled read-out systems that are often perturbed by screening compounds and require additional handling steps. This allows for inhibitor treatments only during the enzymatic step, whereas all downstream functionalization and detection steps are carried out after extensive washing to remove compounds, thus limiting the potential for assay interference to occur. These advantages make the design of click-enabled assays preferable to coupled assays that commonly rely on the detection of free coenzyme A.
One important consideration is the acceptance of click-enabled co-factors into the enzyme active site. Existing click-enabled co-factors may not be fully compatible with the active site optimized for the native co-factor. Structural information and modeling can be used to design amino acid substitutions to enlarge the active site to incorporate altered substrates23. This may enable screening with improved enzyme kinetics and lower substrate and enzyme levels. The drawback of this approach is that altered catalytic pockets may not identify inhibitors that interact strongly with the native enzyme. Ultimately, a combination of approaches is required to identify and validate potential enzyme inhibitors.
Here, we describe a method developed to purify and assay HAT1 enzyme activity using the click co-factor 4-pentynoyl-CoA24. This assay (Figure 1) uses the native enzyme sequence in complex with its required partner protein Rbap46, which has been shown to boost enzyme activity. Purification of the enzyme from human cells allows for enzyme activation in cellulo, which may preserve stimulating post-translational modifications important for full enzyme activity. Design and optimization of recombinant enzyme assays for high-throughput chemical screens have successfully been used to identify and characterize HAT1 small molecule inhibitors.

Författare i fokus: Utveckling av acetylklickanalys för screening av HAT1-hämmare

En acetylklickkemianalys för att mäta histonacetyltransferas 1-acetylering

Our developed acetyl-click assay serves as a tool to assess HAT1 acetyl transferase activity, which is key in isolating H4 histones before nucleosome incorporation. We aim to use this method for high throughput screening of small molecule inhibitors against the HAT1 enzyme. This method measures enzymatic activity directly on the peptide substrate.This offers advantages compared to other enzymatic assays by avoiding biologic variability and antibody related costs. This is also high throughput and can be adapted to use with other acetyl transferases. We have recently published a small molecule HAT1 inhibitor based on this assay that has activity in cells and animals.We continue to use this assay to screen additional chemical libraries and perform structure activity relationships. We are advancing methods to track histone production, folding, chaperoning, and chromatin integration. This highlights the need for improved chemical tools to explore biological mechanisms and stimulate drug discovery.Our goal is to demonstrate that targeting histone production can have therapeutic benefit for diseases such as cancer.

Standardkurvor i duplikat (16 brunnar) bör inkluderas på varje platta för att säkerställa korrekt analysprestanda. Standardkurvdata bör ställas in i tabellform, med ett intervall på 100 % till 0 % beroende på förhållandet mellan Pra-innehållande peptid och naturlig H4-peptid i lösning (tabell 1). Amplex röda signal kommer att vara högst i 100 % pra/0 % nativt H4-peptidbrunnar och lägst i 0 % pra/100 % nativt H4-peptidbrunnar. Efter att fluorescens har detekterats och brunnarna har beräkn...

Watch this Scientific Journal Video about Author Spotlight: Developing Acetyl-Click Assay for HAT1 Inhibitor Screening at JoVE.com

Snabba och noggranna kemiska analyser för att screena för specifika hämmare är ett viktigt verktyg i läkemedelsutvecklingsarsenalen. Här presenterar vi en skalbar acetylklickkemianalys för att mäta hämningen av HAT1-acetyleringsaktiviteten.

HAT1, also known as Histone acetyltransferase 1, plays a crucial role in chromatin synthesis by stabilizing and acetylating nascent H4 before nucleosome ...

Vår utvecklade acetylklickanalys fungerar som ett verktyg för att bedöma HAT1-acetyltransferasaktivitet, vilket är nyckeln till att isolera H4-histoner före nukleosominkorporering. Vi strävar efter att använda denna metod för storskalig screening av småmolekylära hämmare mot HAT1-enzymet. Denna metod mäter enzymatisk aktivitet direkt på peptidsubstratet.Detta ger fördelar jämfört med andra enzymatiska analyser genom att undvika biologisk variabilitet och antikroppsrelaterade kostnader. Detta är också högt genomströmning och kan anpassas för användning med andra acetyltransferaser. Vi har nyligen publicerat en småmolekylär HAT1-hämmare baserad på denna analys som har aktivitet i celler och djur.Vi fortsätter att använda denna analys för att screena ytterligare kemiska bibliotek och utföra strukturaktivitetsrelationer. Vi utvecklar metoder för att spåra histonproduktion, veckning, chaperoning och kromatinintegration. Detta belyser behovet av förbättrade kemiska verktyg för att utforska biologiska mekanismer och stimulera läkemedelsupptäckt.Vårt mål är att visa att inriktning på histonproduktion kan ha terapeutiska fördelar för sjukdomar som cancer.

an-acetyl-click-chemistry-assay-to-measure-histone-acetyltransferase

Research

JoVE Journal

Biochemistry

An Acetyl-Click Chemistry Assay to Measure Histone Acetyltransferase 1 Acetylation

HAT1, also known as Histone acetyltransferase 1, plays a crucial role in chromatin synthesis by stabilizing and acetylating nascent H4 before nucleosome assembly. It is required for tumor growth in various systems, making it a potential target for cancer treatment. To facilitate the identification of compounds that can inhibit HAT1 enzymatic activity, we have devised an acetyl-click assay for rapid screening. In this simple assay, we employ recombinant HAT1/Rbap46, which is purified from activated human cells. The method utilizes the acetyl-CoA analog 4-pentynoyl-CoA (4P) in a click-chemistry approach. This involves the enzymatic transfer of an alkyne handle through a HAT1-dependent acylation reaction to a biotinylated H4 N-terminal peptide. The captured peptide is then immobilized on neutravidin plates, followed by click-chemistry functionalization with biotin-azide. Subsequently, streptavidin-peroxidase recruitment is employed to oxidize amplex red, resulting in a quantitative fluorescent output. By introducing chemical inhibitors during the acylation reaction, we can quantify enzymatic inhibition based on a reduction of the fluorescence signal. Importantly, this reaction is scalable, allowing for high throughput screening of potential inhibitors for HAT1 enzymatic activity.

Quick and accurate chemical assays to screen for specific inhibitors are an important tool in the drug development arsenal. Here, we present a scalable acetyl-click chemistry assay to measure the inhibition of HAT1 acetylation activity.