Name: Yazar Spotlight: HAT1 İnhibitörü Taraması için Asetil-Tıklama Testi Geliştirme
Uploaded: 2024-01-26T14:20:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Author Spotlight: Developing Acetyl-Click Assay for HAT1 Inhibitor Screening at JoVE.com

George Zheng'e H4K12CoA'yı sağladığı için teşekkür ederiz. Yararlı tartışmalar ve geri bildirimler için Gruber Lab üyelerine teşekkür ederiz. NIH/NCI (1K08CA245024), CPRIT (RR200090) ve V Vakfı'nın (V2022-022) desteğine teşekkür ederiz.

1. Yöntem 1: Rekombinant HAT1/Rbap46 kompleksinin üretilmesi ve saflaştırılması
<ol><li>HEK293f hücrelerinin çözülmesi, kurtarılması ve genişletilmesi<ol><li>100 mL'lik bir şişede 1-10 milyon HEK293f memeli hücresini26 30 mL serbest stil 293 ekspresyon ortamına çözün. 60 rpm'de dönerken 37 °C'de% 8 CO2 içinde inkübe edin.</li>
		<li>Ertesi gün, hücre canlılığını sayın ve kontrol edin, ardından dönüş hızını 120 rpm'ye ayarlayın. ...

HAT1 Enzim Aktivitesinin Taranması için Tıklama Tabanlı Bir Testin Geliştirilmesi

<ol>
	<li>Kleff, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+gene+encoding+a+yeast+histone+H4+acetyltransferase.">Identification of a gene encoding a yeast histone H4 acetyltransferase.</a> J Biol Chem. 270 (42), 24674-24677 (1995).</li><li>Parthun, M. R., Widom, J., Gottschling, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+major+cytoplasmic+histone+acetyltransferase+in+yeast:+links+to+chromatin+replication+and+histone+metabolism.">The major cytoplasmic histone acetyltransferase in yeast: links to chromatin replication and histone metabolism.</a> Cell. 87 (1), 85-94 (1996).</li><li>Verreault, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleosomal+DNA+regulates+the+core-histone-binding+subunit+of+the+human+Hat1+acetyltransferase.">Nucleosomal DNA regulates the core-histone-binding subunit of the human Hat1 acetyltransferase.</a> Curr Biol. 8 (2), 96-108 (1998).</li><li>Parthun, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+acetyltransferase+1:+more+than+just+an+enzyme.">Histone acetyltransferase 1: more than just an enzyme.</a> Biochim Biophys Acta. 1819 (3-4), 256-263 (2013).</li><li>Gruber, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HAT1+coordinates+histone+production+and+acetylation+via+H4+promoter+binding.">HAT1 coordinates histone production and acetylation via H4 promoter binding.</a> Mol Cell. 75 (4), 711-724 e5 (2019).</li><li>Fan, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overexpressed+histone+acetyltransferase+1+regulates+cancer+immunity+by+increasing+programmed+death-ligand+1+expression+in+pancreatic+cancer.">Overexpressed histone acetyltransferase 1 regulates cancer immunity by increasing programmed death-ligand 1 expression in pancreatic cancer.</a> J Exp Clin Cancer Res. 38 (1), 47 (2019).</li><li>Xia, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA-377+exerts+a+potent+suppressive+role+in+osteosarcoma+through+the+involvement+of+the+histone+acetyltransferase+1-mediated+Wnt+axis.">MicroRNA-377 exerts a potent suppressive role in osteosarcoma through the involvement of the histone acetyltransferase 1-mediated Wnt axis.</a> J Cell Physiol. 234 (12), 22787-22798 (2019).</li><li>Yang, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+acetyltransferase+1+is+a+succinyltransferase+for+histones+and+non-histones+and+promotes+tumorigenesis.">Histone acetyltransferase 1 is a succinyltransferase for histones and non-histones and promotes tumorigenesis.</a> EMBO Rep. 22 (2), e50967 (2021).</li><li>Xue, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNAi+screening+identifies+HAT1+as+a+potential+drug+target+in+esophageal+squamous+cell+carcinoma.">RNAi screening identifies HAT1 as a potential drug target in esophageal squamous cell carcinoma.</a> Int J Clin Exp Pathol. 7 (7), 3898-3907 (2014).</li><li>Zhang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+plasticity+of+histones+H3-H4+facilitates+their+allosteric+exchange+between+RbAp48+and+ASF1.">Structural plasticity of histones H3-H4 facilitates their allosteric exchange between RbAp48 and ASF1.</a> Nat Struct Mol Biol. 20 (1), 29-35 (2013).</li><li>Campos, E. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+program+for+processing+newly+synthesized+histones+H3.1+and+H4.">The program for processing newly synthesized histones H3.1 and H4.</a> Nat Struct Mol Biol. 17 (11), 1343-1351 (2010).</li><li>Agudelo Garcia, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+multiple+roles+for+histone+acetyltransferase+1+in+replication-coupled+chromatin+assembly.">Identification of multiple roles for histone acetyltransferase 1 in replication-coupled chromatin assembly.</a> Nucleic Acids Res. 45 (16), 9319-9335 (2017).</li><li>Nagarajan, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+acetyl+transferase+1+is+essential+for+mammalian+development,+genome+stability,+and+the+processing+of+newly+synthesized+histones+H3+and+H4.">Histone acetyl transferase 1 is essential for mammalian development, genome stability, and the processing of newly synthesized histones H3 and H4.</a> PLoS Genet. 9 (6), e1003518 (2013).</li><li>Annunziato, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembling+chromatin:+the+long+and+winding+road.">Assembling chromatin: the long and winding road.</a> Biochim Biophys Acta. 1819 (3-4), 196-210 (2013).</li><li>Annunziato, A. T., Seale, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+deacetylation+is+required+for+the+maturation+of+newly+replicated+chromatin.">Histone deacetylation is required for the maturation of newly replicated chromatin.</a> J Biol Chem. 258 (20), 12675-12684 (1983).</li><li>Dahlin, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assay+interference+and+off-target+liabilities+of+reported+histone+acetyltransferase+inhibitors.">Assay interference and off-target liabilities of reported histone acetyltransferase inhibitors.</a> Nat Commun. 8 (1), 1527 (2017).</li><li>Baell, J. B., Miao, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+acetyltransferase+inhibitors:+where+art+thou.">Histone acetyltransferase inhibitors: where art thou.</a> Future Med Chem. 8 (13), 1525-1528 (2016).</li><li>Lasko, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+of+a+selective+catalytic+p300/CBP+inhibitor+that+targets+lineage-specific+tumours.">Discovery of a selective catalytic p300/CBP inhibitor that targets lineage-specific tumours.</a> Nature. 550 (7674), 128-132 (2017).</li><li>Baell, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibitors+of+histone+acetyltransferases+KAT6A/B+induce+senescence+and+arrest+tumour+growth.">Inhibitors of histone acetyltransferases KAT6A/B induce senescence and arrest tumour growth.</a> Nature. 560 (7717), 253-257 (2018).</li><li>Falk, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+efficient+high-throughput+screening+method+for+MYST+family+acetyltransferases,+a+new+class+of+epigenetic+drug+targets.">An efficient high-throughput screening method for MYST family acetyltransferases, a new class of epigenetic drug targets.</a> J Biomol Screen. 16 (10), 1196-1205 (2011).</li><li>He, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+biology+approaches+for+investigating+the+functions+of+lysine+acetyltransferases.">Chemical biology approaches for investigating the functions of lysine acetyltransferases.</a> Angew Chem Int Ed Engl. 57 (5), 1162-1184 (2018).</li><li>Lipchik, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+peptide-based+biosensor+assay+to+detect+intracellular+Syk+kinase+activation+and+inhibition.">A peptide-based biosensor assay to detect intracellular Syk kinase activation and inhibition.</a> Biochemistry. 51 (38), 7515-7524 (2012).</li><li>Song, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemoproteomic+profiling+of+protein+substrates+of+a+major+lysine+acetyltransferase+in+the+native+cellular+context.">Chemoproteomic profiling of protein substrates of a major lysine acetyltransferase in the native cellular context.</a> ACS Chem Biol. 17 (5), 1092-1102 (2022).</li><li>Gaddameedi, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acetyl-click+screening+platform+identifies+small-molecule+inhibitors+of+histone+acetyltransferase+1+(HAT1).">Acetyl-click screening platform identifies small-molecule inhibitors of histone acetyltransferase 1 (HAT1).</a> J Med Chem. 66 (8), 5774-5801 (2023).</li><li>Ngo, L., Brown, T., Zheng, Y. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bisubstrate+inhibitors+to+target+histone+acetyltransferase+1+(HAT1).">Bisubstrate inhibitors to target histone acetyltransferase 1 (HAT1).</a> Chem Biol Drug Des. 93 (5), 865-873 (2019).</li><li>Parker, C. G., Pratt, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Click+chemistry+in+proteomic+investigations.">Click chemistry in proteomic investigations.</a> Cell. 180 (4), 605-632 (2020).</li><li>Islam, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+bump-and-hole+tactic:+Expanding+the+scope+of+chemical+genetics.">The bump-and-hole tactic: Expanding the scope of chemical genetics.</a> Cell Chem Biol. 25 (10), 1171-1184 (2018).</li><li>Radziwon, K., Weeks, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+engineering+for+selective+proteomics.">Protein engineering for selective proteomics.</a> Curr Opin Chem Biol. 60, 10-19 (2021).</li><li>Rich, R. L., Myszka, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Survey+of+the+year+2007+commercial+optical+biosensor+literature.">Survey of the year 2007 commercial optical biosensor literature.</a> J Mol Recognit. 21 (6), 355-400 (2008).</li></ol>

Son on yılda, tıklama kimyası öne çıktı20 ve etkileşen kimyasal yapıların hassas tasarımını mümkün kıldı. Bu bağlamda, çeşitli biyoortogonal kovalent bağlantılar21 doğal ortamlarında kompleksler oluşturmak için umut verici seçenekler olarak ortaya çıkmıştır. Tıklama kimyası, genellikle "tıklama reaksiyonları" olarak bilinen hızlı ve seçici reaksiyonlar sergileyen fonksiyonel grup çiftlerini kullanır. Bu reaksiyonlar, çevre dostu, yu...

Çok sayıda ökaryotik asetiltransferaz arasında HAT1,izole edilecek ilk histon asetiltransferazdı 1,2,3. Daha sonraki araştırmalar, kromatin replikasyonunda, özellikle S-fazı4 sırasında yeni nükleozomların sentezinde önemli rolünü sağlam bir şekilde ortaya koymuştur. Araştırma çabalarımız, HAT1'in meme hücrelerindeepidermal büyüme faktörü (EGF) tedavisi ile yüksek oranda uyarıldığının kabul edilmesine yol açmıştır 5. Ayrıca, HAT1'in hızlı hücre proliferasyonu ve tümör oluşumu için gerekli olduğu ortaya çıkmıştır in vivo 6,7,8,9. Veriler, HAT1'in hücre bölünmesi için anabolik ve epigenetik süreçleri koordine etmede kritik olduğunu ve tümör büyümesini yönlendirdiğini göstermektedir.
HAT1, histon H4'ün amino terminal kuyruğunu, histonu bağlayan ve amino terminalini HAT1'e sunan şaperon proteini Rbap46 ile kompleks halinde lizin 5 ve 12 üzerinde di-asetillenir. Histon tetramerleri veya disomları10, HAT1/Rbap46 ve diğer histon şaperonları11 ile birlikte daha sonra çekirdeğe aktarılır. Histonlar daha sonra replikasyon çatalında veya gen aktivasyonunu veya baskılanmasını desteklemek için diğer bölgelerde biriktirilmek üzere serbest bırakılır. HAT1 di-asetilasyon işaretinin histon H4 üzerindeki işlevi tam olarak anlaşılmamıştır. H4 kromatine yerleştirildikten sonrahiston deasetilaz 12,13,14,15'in etkisiyle 15-30 dakikalık bir süre içinde muhtemelen hızlı bir şekilde çıkarılır. Bu nedenle, HAT1 di-asetilasyon işareti kromatin içinde yayılmaz ve kromatin modifiye edici enzimlerin yeni ortaya çıkan kromatine alınmasında bir rol olduğu öne sürülmesine rağmen, gerçek bir epigenetik role hizmet etmeyebilir12. Ayrıca, HAT1 kromatini doğrudan asetillemez; Aktivitesi çözünür histonlarla sınırlıdır.
Küçük moleküllü histon asetiltransferaz inhibitörlerinin geliştirilmesi, spesifik olmayan ve düşük verimli deneyler tarafından engellenmiştir ve bu da genellikle biyolojik olarak reaktif bileşiklerinüretilmesine neden olmuştur 16,17. Asetiltransferaz aktivitelerini ölçmek için altın standart tahlil, verimi sınırlayan ve radyasyon gerektiren 3H-asetil-coA kullanımını gerektirir. Bununla birlikte, son zamanlarda, CBP / p30018 ve KAT6A / B 19,20'yi hedefleyen spesifik ve oldukça güçlü küçük moleküllü asetiltransferaz inhibitörleri tanımlanmış ve 3H-asetil-CoA kullanımı ile doğrulanmıştır. İleriye dönük olarak, daha iyi verim elde etmek ve laboratuvar tehlikelerinden kaçınmak için geliştirilmiş tahliller tasarlanmaktadır.
Asetilasyon izleme21'deki son gelişmeler, enzimatik reaksiyon izlemeyi sağlamak için tıklama kimyasını kullanmıştır. Basit sentetik yollarla erişilebilen veya enzim reaksiyonlarına dahil edilebilen satın alınabilen çeşitli tıklama özellikli öncüler vardır. Bu reaksiyonlar tipik olarak rekombinant sistemlerde gerçekleştirilir, ancak hücre bazlı tahliller de mümkündür22. Tıklama özellikli kofaktörlerin ve substratların avantajı, taramanın, genellikle tarama bileşikleri tarafından bozulan ve ek işleme adımları gerektiren birleştirilmiş okuma sistemlerine ihtiyaç duymadan enzim aktivitesini doğrudan ölçebilmesidir. Bu, inhibitör tedavilerine yalnızca enzimatik adım sırasında izin verirken, tüm aşağı akış işlevselleştirme ve tespit adımları, bileşikleri uzaklaştırmak için kapsamlı yıkamadan sonra gerçekleştirilir, böylece tahlil girişiminin meydana gelme potansiyelini sınırlar. Bu avantajlar, tıklama özellikli testlerin tasarımını, genellikle serbest koenzim A'nın saptanmasına dayanan birleştirilmiş tahlillere tercih edilir hale getirir.
Önemli bir husus, tıklama özellikli kofaktörlerin enzim aktif bölgesine kabul edilmesidir. Mevcut tıklamanın etkin olduğu ortak faktörler, yerel ortak faktör için optimize edilmiş etkin siteyle tam olarak uyumlu olmayabilir. Yapısal bilgi ve modelleme, değiştirilmiş substratları dahil etmek için aktif bölgeyi genişletmek için amino asit ikamelerini tasarlamak için kullanılabilir23. Bu, gelişmiş enzim kinetiği ve daha düşük substrat ve enzim seviyeleri ile taramayı mümkün kılabilir. Bu yaklaşımın dezavantajı, değiştirilmiş katalitik ceplerin, doğal enzimle güçlü bir şekilde etkileşime giren inhibitörleri tanımlayamamasıdır. Sonuç olarak, potansiyel enzim inhibitörlerini tanımlamak ve doğrulamak için yaklaşımların bir kombinasyonu gereklidir.
Burada, tıklama ko-faktörü 4-pentinoil-CoA24 kullanarak HAT1 enzim aktivitesini saflaştırmak ve test etmek için geliştirilmiş bir yöntemi açıklıyoruz. Bu test (Şekil 1), enzim aktivitesini arttırdığı gösterilen gerekli ortak proteini Rbap46 ile kompleks halinde doğal enzim dizisini kullanır. Enzimin insan hücrelerinden saflaştırılması, tam enzim aktivitesi için önemli olan uyarıcı translasyon sonrası modifikasyonları koruyabilen selülde enzim aktivasyonuna izin verir. Yüksek verimli kimyasal ekranlar için rekombinant enzim deneylerinin tasarımı ve optimizasyonu, HAT1 küçük molekül inhibitörlerini tanımlamak ve karakterize etmek için başarıyla kullanılmıştır.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>4P CoA</td>
			<td>Cayman Chemical</td>
			<td>10547</td>
			<td>Click chemistry co-factor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amplex Red</td>
			<td>Fisher Sci</td>
			<td>A12222</td>
			<td>Fluorescence substrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin-PEG-Azide</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>J64996MC</td>
			<td>Click chemistry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Copper Sulfate</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>&#160;7758-98-7</td>
			<td>Click chemistry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>&#160;67-68-5</td>
			<td>diluent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>03-12-3483</td>
			<td>reducting agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forskolin</td>
			<td>VWR</td>
			<td>102987-310</td>
			<td>Protein expression</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freestyle 293 Expression Medium</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>12338018</td>
			<td>Media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freestyle 293-F cells</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>R790-07</td>
			<td>Protein expression</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H4-peptide/1-23-GGK-biotin</td>
			<td>Anaspec</td>
			<td>AS65097</td>
			<td>peptide substrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>&#160;7365-45-9</td>
			<td>EB buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen peroxide 30% solution</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>&#160;Z00183-99-0</td>
			<td>initiator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M2 FLAG antibody slurry</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>A2220</td>
			<td>Protein purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Macrosep 10K Filter (Pall Lab)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89131-980</td>
			<td>Protein purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neutravidin Plate</td>
			<td>Thermo Sci</td>
			<td>15127</td>
			<td>BSA-pre-blocked</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NP40 (IGEPAL)</td>
			<td>MP Biomedical</td>
			<td>198596</td>
			<td>20x buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pHEK-293 plasmid</td>
			<td>Takara Bio</td>
			<td>3390</td>
			<td>Protein expression</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline 10x</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>&#160;Z00082-33-6</td>
			<td>wash buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pra peptide</td>
			<td>Genscript</td>
			<td>Custom synthesis</td>
			<td>biotinylated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Ascorbate</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>&#160;134-03-2</td>
			<td>Click chemistry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>&#160;7647-14-5</td>
			<td>EB buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>7558-80-7</td>
			<td>buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>189730</td>
			<td>competitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin-HRP</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>3999S</td>
			<td>enzyme</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>THPTA ligand</td>
			<td>Fisher Sci</td>
			<td>1010-500</td>
			<td>Click chemistry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris base</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>&#160;77-86-1</td>
			<td>20x buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton-X 100</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>&#160;9002-93-1</td>
			<td>EB buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>&#160;9005-64-5</td>
			<td>Wash buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>57-13-6</td>
			<td>quencher</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an acetyl-click chemistry assay to measure histone acetyltransferase 1 acetylation

Histon asetiltransferaz 1 olarak da bilinen HAT1, nükleozom montajından önce ortaya çıkan H4'ü stabilize ederek ve asetilleyerek kromatin sentezinde çok önemli bir rol oynar. Çeşitli sistemlerde tümör büyümesi için gereklidir, bu da onu kanser tedavisi için potansiyel bir hedef haline getirir. HAT1 enzimatik aktivitesini inhibe edebilen bileşiklerin tanımlanmasını kolaylaştırmak için, hızlı tarama için bir asetil-tıklama testi tasarladık. Bu basit tahlilde, aktive edilmiş insan hücrelerinden saflaştırılan rekombinant HAT1 / Rbap46 kullanıyoruz. Yöntem, bir tıklama kimyası yaklaşımında asetil-CoA analoğu 4-pentinoil-CoA'yı (4P) kullanır. Bu, bir alkin sapının, HAT1'e bağlı bir asilasyon reaksiyonu yoluyla biyotinillenmiş bir H4 N-terminal peptidine enzimatik transferini içerir. Yakalanan peptit daha sonra nötravidin plakaları üzerinde hareketsiz hale getirilir, ardından biyotin-azid ile tıklama kimyası işlevselleştirilmesi yapılır. Daha sonra, amplex kırmızısını oksitlemek için streptavidin-peroksidaz alımı kullanılır ve bu da kantitatif bir floresan çıktısı ile sonuçlanır. Asilasyon reaksiyonu sırasında kimyasal inhibitörler ekleyerek, floresan sinyalinin azalmasına dayalı olarak enzimatik inhibisyonu ölçebiliriz. Daha da önemlisi, bu reaksiyon ölçeklenebilir ve HAT1 enzimatik aktivitesi için potansiyel inhibitörlerin yüksek verimli taranmasına izin verir.

Among the numerous eukaryotic acetyltransferases, HAT1 was the initial histone acetyltransferase to be isolated1,2,3. Subsequent investigations have firmly established its pivotal role in chromatin replication, particularly in the synthesis of new nucleosomes during S-phase4. Our research endeavors led to the recognition that HAT1 is highly stimulated by epidermal growth factor (EGF) treatment in mammary cells5. Furthermore, it has come to light that HAT1 is required for rapid cell proliferation and tumor formation in vivo6,7,8,9. Data indicate that HAT1 is critical in coordinating anabolic and epigenetic processes for cell division, driving tumor growth.
HAT1 di-acetylates the amino-terminal tail of histone H4 on lysines 5 and 12 in complex with the chaperone protein Rbap46, which binds the histone and presents the amino-terminus to HAT1. Histone tetramers or disomes10, together with HAT1/Rbap46 and other histone chaperones11, are then imported to the nucleus. Histones are then released to be deposited at the replication fork, or other sites to support gene activation or repression. The function of the HAT1 di-acetylation mark on histone H4 is not fully understood. It is likely quickly removed within a span of 15-30 min by the action of histone deacetylases12,13,14,15 after H4 is inserted into chromatin. Thus, the HAT1 di-acetylation mark is not propagated in chromatin and may not serve a true epigenetic role, although a role in the recruitment of chromatin-modifying enzymes to nascent chromatin has been postulated12. Also, HAT1 does not directly acetylate chromatin; its activity is restricted to soluble histones.
The development of small-molecule histone acetyltransferase inhibitors has been hampered by nonspecific and low-throughput assays, often resulting in the generation of biologically reactive compounds16,17.&#160;The gold-standard assay to measure acetyltransferase activities requires the use of 3H-acetyl-coA, which limits throughput and requires radiation. Nonetheless, recently, specific and highly potent small molecule acetyltransferase inhibitors targeting CBP/p30018 and KAT6A/B19,20 have been described and confirmed through the use of 3H-acetyl-CoA. Moving forward, improved assays to achieve better throughput and avoid laboratory hazards are being devised.
Recent advances in acetylation monitoring21 have used click chemistry to enable enzymatic reaction monitoring. There are a variety of click-enabled precursors that are accessible by simple synthetic routes or available for purchase that can be incorporated into enzyme reactions. These reactions are typically carried out in recombinant systems, although cell-based assays are also feasible22. The advantage of click-enabled co-factors and substrates is that screening can directly measure enzyme activity without the need for coupled read-out systems that are often perturbed by screening compounds and require additional handling steps. This allows for inhibitor treatments only during the enzymatic step, whereas all downstream functionalization and detection steps are carried out after extensive washing to remove compounds, thus limiting the potential for assay interference to occur. These advantages make the design of click-enabled assays preferable to coupled assays that commonly rely on the detection of free coenzyme A.
One important consideration is the acceptance of click-enabled co-factors into the enzyme active site. Existing click-enabled co-factors may not be fully compatible with the active site optimized for the native co-factor. Structural information and modeling can be used to design amino acid substitutions to enlarge the active site to incorporate altered substrates23. This may enable screening with improved enzyme kinetics and lower substrate and enzyme levels. The drawback of this approach is that altered catalytic pockets may not identify inhibitors that interact strongly with the native enzyme. Ultimately, a combination of approaches is required to identify and validate potential enzyme inhibitors.
Here, we describe a method developed to purify and assay HAT1 enzyme activity using the click co-factor 4-pentynoyl-CoA24. This assay (Figure 1) uses the native enzyme sequence in complex with its required partner protein Rbap46, which has been shown to boost enzyme activity. Purification of the enzyme from human cells allows for enzyme activation in cellulo, which may preserve stimulating post-translational modifications important for full enzyme activity. Design and optimization of recombinant enzyme assays for high-throughput chemical screens have successfully been used to identify and characterize HAT1 small molecule inhibitors.

Yazar Spotlight: HAT1 İnhibitörü Taraması için Asetil-Tıklama Testi Geliştirme

Histon Asetiltransferaz 1 Asetilasyonunu Ölçmek için Bir Asetil-Tıklama Kimyası Testi

Our developed acetyl-click assay serves as a tool to assess HAT1 acetyl transferase activity, which is key in isolating H4 histones before nucleosome incorporation. We aim to use this method for high throughput screening of small molecule inhibitors against the HAT1 enzyme. This method measures enzymatic activity directly on the peptide substrate.This offers advantages compared to other enzymatic assays by avoiding biologic variability and antibody related costs. This is also high throughput and can be adapted to use with other acetyl transferases. We have recently published a small molecule HAT1 inhibitor based on this assay that has activity in cells and animals.We continue to use this assay to screen additional chemical libraries and perform structure activity relationships. We are advancing methods to track histone production, folding, chaperoning, and chromatin integration. This highlights the need for improved chemical tools to explore biological mechanisms and stimulate drug discovery.Our goal is to demonstrate that targeting histone production can have therapeutic benefit for diseases such as cancer.

Uygun tahlil performansını sağlamak için her plakaya çift (16 kuyucuk) standart eğriler dahil edilmelidir. Standart eğri verileri, Pra içeren peptitin çözeltideki doğal H4 peptidine oranına göre %100 ila %0 aralığında tablo şeklinde ayarlanmalıdır (Tablo 1). Amplex kırmızı sinyal, %100 pra/%0 doğal H4 peptit kuyularında en yüksek ve %0 pra/%100 doğal H4 peptit kuyularında en düşük olacaktır. Floresan tespit edildikten ve kuyuların ortalaması alındıktan sonra, ortaya ç?...

Watch this Scientific Journal Video about Author Spotlight: Developing Acetyl-Click Assay for HAT1 Inhibitor Screening at JoVE.com

Spesifik inhibitörleri taramak için hızlı ve doğru kimyasal tahliller, ilaç geliştirme cephaneliğinde önemli bir araçtır. Burada, HAT1 asetilasyon aktivitesinin inhibisyonunu ölçmek için ölçeklenebilir bir asetil-tıklama kimyası testi sunuyoruz.

HAT1, also known as Histone acetyltransferase 1, plays a crucial role in chromatin synthesis by stabilizing and acetylating nascent H4 before nucleosome ...

Geliştirdiğimiz asetil-tıklama testimiz, nükleozom dahil edilmeden önce H4 histonlarının izole edilmesinde anahtar olan HAT1 asetil transferaz aktivitesini değerlendirmek için bir araç görevi görür. Bu yöntemi, HAT1 enzimine karşı küçük moleküllü inhibitörlerin yüksek verimli taraması için kullanmayı amaçlıyoruz. Bu yöntem, enzimatik aktiviteyi doğrudan peptit substratı üzerinde ölçer.Bu, biyolojik değişkenlik ve antikorla ilgili maliyetlerden kaçınarak diğer enzimatik tahlillere kıyasla avantajlar sunar. Bu aynı zamanda yüksek verimdir ve diğer asetil transferazlarla birlikte kullanılmak üzere uyarlanabilir. Yakın zamanda, hücrelerde ve hayvanlarda aktivitesi olan bu teste dayanan küçük moleküllü bir HAT1 inhibitörü yayınladık.Bu testi, ek kimyasal kütüphaneleri taramak ve yapı aktivitesi ilişkilerini gerçekleştirmek için kullanmaya devam ediyoruz. Histon üretimini, katlamayı, şaperonlamayı ve kromatin entegrasyonunu izlemek için yöntemler geliştiriyoruz. Bu, biyolojik mekanizmaları keşfetmek ve ilaç keşfini teşvik etmek için geliştirilmiş kimyasal araçlara duyulan ihtiyacı vurgulamaktadır.Amacımız, histon üretimini hedeflemenin kanser gibi hastalıklar için terapötik yararı olabileceğini göstermektir.

an-acetyl-click-chemistry-assay-to-measure-histone-acetyltransferase

Research

JoVE Journal

Biochemistry

An Acetyl-Click Chemistry Assay to Measure Histone Acetyltransferase 1 Acetylation

HAT1, also known as Histone acetyltransferase 1, plays a crucial role in chromatin synthesis by stabilizing and acetylating nascent H4 before nucleosome assembly. It is required for tumor growth in various systems, making it a potential target for cancer treatment. To facilitate the identification of compounds that can inhibit HAT1 enzymatic activity, we have devised an acetyl-click assay for rapid screening. In this simple assay, we employ recombinant HAT1/Rbap46, which is purified from activated human cells. The method utilizes the acetyl-CoA analog 4-pentynoyl-CoA (4P) in a click-chemistry approach. This involves the enzymatic transfer of an alkyne handle through a HAT1-dependent acylation reaction to a biotinylated H4 N-terminal peptide. The captured peptide is then immobilized on neutravidin plates, followed by click-chemistry functionalization with biotin-azide. Subsequently, streptavidin-peroxidase recruitment is employed to oxidize amplex red, resulting in a quantitative fluorescent output. By introducing chemical inhibitors during the acylation reaction, we can quantify enzymatic inhibition based on a reduction of the fluorescence signal. Importantly, this reaction is scalable, allowing for high throughput screening of potential inhibitors for HAT1 enzymatic activity.

Quick and accurate chemical assays to screen for specific inhibitors are an important tool in the drug development arsenal. Here, we present a scalable acetyl-click chemistry assay to measure the inhibition of HAT1 acetylation activity.