Name: crispr-cas9 genome editing of rat embryos using adeno-associated virus (aav) and 2-cell embryo electroporation
Uploaded: 2024-03-15T13:20:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about CRISPR-Cas9 Genome Editing of Rat Embryos using Adeno-Associated Virus AAV and 2-Cell Embryo Electroporation at JoVE.com

Forfatterne vil gerne takke Nolan Davis for hjælp med videografi og videoredigering.

Alle eksperimentelle procedurer blev godkendt af University of Missouri's Institutional Animal Care and Use Committee (ACUC-protokol # 25580) og blev udført i henhold til retningslinjerne i vejledningen til brug og pleje af forsøgsdyr.
1. AAV-medieret levering af DNA-reparationsskabelon
<ol><li>Design DNA-konstruktionen til at indeholde den ønskede knock-in-sekvens mellem to homologiarme. Typiske homologiarmlængder er 300-500 bp lange. Sørg for, at hele DNA-reparationss...

<ol>
	<li>Lau, C. H., Tin, C., Suh, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-based+strategies+for+targeted+transgene+knock-in+and+gene+correction.">CRISPR-based strategies for targeted transgene knock-in and gene correction.</a> Fac Rev. 9, 20 (2020).</li><li>Gutschner, T., Haemmerle, M., Genovese, G., Draetta, G. F., Chin, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Post-translational+Regulation+of+Cas9+during+G1+Enhances+Homology-Directed+Repair.">Post-translational Regulation of Cas9 during G1 Enhances Homology-Directed Repair.</a> Cell Rep. 14 (6), 1555-1566 (2016).</li><li>Zhang, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+precise+knockin+with+a+double+cut+HDR+donor+after+CRISPR/Cas9-mediated+double-stranded+DNA+cleavage.">Efficient precise knockin with a double cut HDR donor after CRISPR/Cas9-mediated double-stranded DNA cleavage.</a> Genome Biol. 18 (1), 35 (2017).</li><li>Miura, H., Quadros, R. M., Gurumurthy, C. B., Ohtsuka, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Easi-CRISPR+for+creating+knock-in+and+conditional+knockout+mouse+models+using+long+ssDNA+donors.">Easi-CRISPR for creating knock-in and conditional knockout mouse models using long ssDNA donors.</a> Nat Protoc. 13 (1), 195-215 (2018).</li><li>Gu, B., Posfai, E., Gertsenstein, M., Rossant, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+generation+of+large-fragment+knock-in+mouse+models+using+2-cell+(2C)-homologous+recombination+(HR)-CRISPR.">Efficient generation of large-fragment knock-in mouse models using 2-cell (2C)-homologous recombination (HR)-CRISPR.</a> Curr Protoc Mouse Biol. 10 (1), e67 (2020).</li><li>Gu, B., Posfai, E., Rossant, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+generation+of+targeted+large+insertions+by+microinjection+into+two-cell-stage+mouse+embryos.">Efficient generation of targeted large insertions by microinjection into two-cell-stage mouse embryos.</a> Nat Biotechnol. 36 (7), 632-637 (2018).</li><li>Kurihara, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+repair+protein+RAD51+enhances+the+CRISPR/Cas9-mediated+knock-in+efficiency+in+brain+neurons.">DNA repair protein RAD51 enhances the CRISPR/Cas9-mediated knock-in efficiency in brain neurons.</a> Biochem Biophys Res Commun. 524 (3), 621-628 (2020).</li><li>Kaneko, T., Sakuma, T., Yamamoto, T., Mashimo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+knockout+by+electroporation+of+engineered+endonucleases+into+intact+rat+embryos.">Simple knockout by electroporation of engineered endonucleases into intact rat embryos.</a> Sci Rep. 4, 6382 (2014).</li><li>Chen, S., Lee, B., Lee, A. Y., Modzelewski, A. J., He, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+mouse+genome+editing+by+CRISPR+ribonucleoprotein+electroporation+of+zygotes.">Highly efficient mouse genome editing by CRISPR ribonucleoprotein electroporation of zygotes.</a> J Biol Chem. 291 (28), 14457-14467 (2016).</li><li>Hashimoto, M., Yamashita, Y., Takemoto, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electroporation+of+Cas9+protein/sgRNA+into+early+pronuclear+zygotes+generates+non-mosaic+mutants+in+the+mouse.">Electroporation of Cas9 protein/sgRNA into early pronuclear zygotes generates non-mosaic mutants in the mouse.</a> Dev Biol. 418 (1), 1-9 (2016).</li><li>Wang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delivery+of+Cas9+protein+into+mouse+zygotes+through+a+series+of+electroporation+dramatically+increases+the+efficiency+of+model+creation.">Delivery of Cas9 protein into mouse zygotes through a series of electroporation dramatically increases the efficiency of model creation.</a> J Genet Genomics. 43 (5), 319-327 (2016).</li><li>Troder, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optimized+electroporation+approach+for+efficient+CRISPR/Cas9+genome+editing+in+murine+zygotes.">An optimized electroporation approach for efficient CRISPR/Cas9 genome editing in murine zygotes.</a> PLoS One. 13 (5), e0196891 (2018).</li><li>Teixeira, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electroporation+of+mice+zygotes+with+dual+guide+RNA/Cas9+complexes+for+simple+and+efficient+cloning-free+genome+editing.">Electroporation of mice zygotes with dual guide RNA/Cas9 complexes for simple and efficient cloning-free genome editing.</a> Sci Rep. 8 (1), 474 (2018).</li><li>Tanihara, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+generation+of+GGTA1-deficient+pigs+by+electroporation+of+the+CRISPR/Cas9+system+into+in+vitro-fertilized+zygotes.">Efficient generation of GGTA1-deficient pigs by electroporation of the CRISPR/Cas9 system into in vitro-fertilized zygotes.</a> BMC Biotechnol. 20 (1), 40 (2020).</li><li>Tanihara, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+CD163-edited+pig+via+electroporation+of+the+CRISPR/Cas9+system+into+porcine+in+vitro-fertilized+zygotes.">Generation of CD163-edited pig via electroporation of the CRISPR/Cas9 system into porcine in vitro-fertilized zygotes.</a> Anim Biotechnol. 32 (2), 147-154 (2021).</li><li>Camargo, L. S. A., Owen, J. R., Van Eenennaam, A. L., Ross, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+one-step+knockout+by+electroporation+of+ribonucleoproteins+into+zona-intact+bovine+embryos.">Efficient one-step knockout by electroporation of ribonucleoproteins into zona-intact bovine embryos.</a> Front Genet. 11, 570069 (2020).</li><li>Lin, J. C., Van Eenennaam, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electroporation-mediated+genome+editing+of+livestock+zygotes.">Electroporation-mediated genome editing of livestock zygotes.</a> Front Genet. 12, 648482 (2021).</li><li>Betters, E., Charney, R. M., Garcia-Castro, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electroporation+and+in+vitro+culture+of+early+rabbit+embryos.">Electroporation and in vitro culture of early rabbit embryos.</a> Data Brief. 21, 316-320 (2018).</li><li>Miyasaka, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CLICK:+one-step+generation+of+conditional+knockout+mice.">CLICK: one-step generation of conditional knockout mice.</a> BMC Genomics. 19 (1), 318 (2018).</li><li>Epstein, B. E., Schaffer, D. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combining+engineered+nucleases+with+adeno-associated+viral+vectors+for+therapeutic+gene+editing.">Combining engineered nucleases with adeno-associated viral vectors for therapeutic gene editing.</a> Adv Exp Med Biol. 1016, 29-42 (2017).</li><li>Gaj, T., Epstein, B. E., Schaffer, D. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+engineering+using+adeno-associated+virus:+basic+and+clinical+research+applications.">Genome engineering using adeno-associated virus: basic and clinical research applications.</a> Mol Ther. 24 (3), 458-464 (2016).</li><li>Chen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-READI:+Efficient+generation+of+knockin+mice+by+CRISPR+RNP+electroporation+and+AAV+donor+infection.">CRISPR-READI: Efficient generation of knockin mice by CRISPR RNP electroporation and AAV donor infection.</a> Cell Rep. 27 (13), 3780-3789 (2019).</li><li>Mizuno, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intra-embryo+gene+cassette+knockin+by+CRISPR/CAS9-mediated+genome+editing+with+adeno-associated+viral+vector.">Intra-embryo gene cassette knockin by CRISPR/CAS9-mediated genome editing with adeno-associated viral vector.</a> iScience. 9, 286-297 (2018).</li><li>Davis, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+DNA+knock-in+using+AAV-mediated+delivery+with+2-cell+embryo+CRISPR-Cas9+electroporation.">Efficient DNA knock-in using AAV-mediated delivery with 2-cell embryo CRISPR-Cas9 electroporation.</a> Front Genome Ed. 5, 1256451 (2023).</li><li>Smirnikhina, S. A., Zaynitdinova, M. I., Sergeeva, V. A., Lavrov, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+homology-directed+repair+in+genome+editing+experiments+by+influencing+the+cell+cycle.">Improving homology-directed repair in genome editing experiments by influencing the cell cycle.</a> Int J Mol Sci. 23 (11), (2022).</li><li>Takata, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homologous+recombination+and+non-homologous+end-joining+pathways+of+DNA+double-strand+break+repair+have+overlapping+roles+in+the+maintenance+of+chromosomal+integrity+in+vertebrate+cells.">Homologous recombination and non-homologous end-joining pathways of DNA double-strand break repair have overlapping roles in the maintenance of chromosomal integrity in vertebrate cells.</a> EMBO J. 17 (18), 5497-5508 (1998).</li><li>Men, H., Stone, B. J., Bryda, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Media+optimization+to+promote+rat+embryonic+development+to+the+blastocyst+stage+in+vitro.">Media optimization to promote rat embryonic development to the blastocyst stage in vitro.</a> Theriogenology. 151, 81-85 (2020).</li><li>Men, H., Amos-Landgraf, J. M., Bryda, E. C., Franklin, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=KSOM-R+supports+both+mouse+and+rat+preimplantation+embryo+development+in+vitro.">KSOM-R supports both mouse and rat preimplantation embryo development in vitro.</a> Theriogenology. 198, 69-74 (2023).</li><li>Romeo, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AAV+diffuses+across+zona+pellucida+for+effortless+gene+delivery+to+fertilized+eggs.">AAV diffuses across zona pellucida for effortless gene delivery to fertilized eggs.</a> Biochem Biophys Res Commun. 526 (1), 85-90 (2020).</li><li>Fulka, J., Moor, R. M., Fulka, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrofusion+of+mammalian+oocytes+and+embryonic+cells.">Electrofusion of mammalian oocytes and embryonic cells.</a> Methods Mol Biol. 48, 309-316 (1995).</li><li>Rems, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+electrofusion+using+nanosecond+electric+pulses.">Cell electrofusion using nanosecond electric pulses.</a> Sci Rep. 3, 3382 (2013).</li></ol>

CRISPR-Cas genomredigeringssystemet har revolutioneret området for genteknologi ved at muliggøre effektiv produktion af både enkle og komplekse, tilpassede genetiske modifikationer i en række dyrearter. Hyppige forbedringer og forbedringer i teknikker forbundet med genomredigering fremmer dens alsidighed. Her har vi beskrevet en ny tilgang ved hjælp af ssAAV-medieret DNA-levering sammen med 2-celle embryoelektroporation af CRISPR-Cas9-reagenser i 2-cellede gnaverembryoner. Vi har vist, at dette er en effektiv måde ...

Udviklingen af CRISPR-baserede genomredigeringsværktøjer har accelereret vores evne til effektivt at generere nye og mere sofistikerede gensplejsede rottemodeller. Single-guide RNA, sammen med Cas9-nuklease, kombineres til dannelse af ribonukleoprotein (RNP) komplekser, der målretter DNA-sekvenser af interesse inden for genomet og resulterer i dobbeltstrengede DNA-brud. Fordi cellulære DNA-reparationsmekanismer er udsat for fejl, introduceres indsættelser og deletioner (INDEL'er) under reparationsprocessen, der kan forstyrre et målgens funktion. Når der er samtidig levering af en ønsket konstrueret DNA-sekvens (reparationsskabelon) sammen med genomredigeringsreagenser, sker indsættelse af reparationsskabelonen i regionen, der indeholder det dobbeltstrengede DNA-brud, gennem en proces kaldet homologi-rettet reparation (HDR). Dette er en effektiv strategi til generering af dyremodeller med målrettede DNA-indsættelser/substitutioner (knock-ins). En begrænsning er, at knock-in-sekvenser ofte er store i størrelse, hvilket har vist sig at reducere genredigeringseffektiviteten, hvilket gør det vanskeligere at generere den ønskede model1. Strategier til at øge knock-in-effektiviteten har inkluderet linearisering af både dobbeltstrenget DNA (dsDNA) og enkeltstrenget DNA (ssDNA) reparationsskabeloner og kemisk modifikation af DNA-reparationsskabeloner 2,3,4. Derudover er pronukleær mikroinjektion sammen med HDR-stimulerende forbindelser, anvendelse af elektriske impulser i forbindelse med mikroinjektion og tidsbestemt mikroinjektion i 2-celleembryoner alle forsøgt 5,6,7. På trods af succesen med nogle af disse tilgange er inkorporeringen af DNA-sekvenser større end 1,0 kb stadig teknisk udfordrende.
Elektroporation, som er en almindelig metode til at indføre reagenser i dyrkede cellelinjer, tilbyder et alternativ til mikroinjektion til levering af CRISPR-Cas9-komponenter i embryoner. Embryoelektroporation, der først blev påvist i rotteembryoner8, er siden blevet anvendt med succes som leveringsmetode i mus 9,10,11,12,13, svin14,15 og andre dyremodelorganismer 16,17,18. Embryoner, suspenderet i mediet indeholdende CRISPR-Cas9-reagenser, anbringes i en kuvette eller på et glasglas mellem to elektroder og udsættes for direkte impulser af elektriske strømme. Dette skaber forbigående åbninger i zona pellucida og embryoplasmamembranen, hvorigennem CRISPR-Cas9-komponenterne kommer ind i embryonerne. Typisk bruges elektriske "poring" impulser på mellemniveau til at skabe de midlertidige åbninger efterfulgt af elektriske "overførselsimpulser" på lavere niveau, der letter bevægelsen af de negativt ladede genomredigeringskomponenter. Embryoelektroporation er effektiv, har en høj gennemstrømning og er let at udføre. Mens embryoelektroporation har vist sig at være meget vellykket til introduktion af små (<200 bp) ssDNA-reparationsskabeloner, er der få rapporter om vellykket elektroporation af større (>1,0 kb) reparationsskabeloner13,19. Denne størrelsesbegrænsning udgør en væsentlig begrænsning af embryoelektroporation til generering af knock-in dyremodeller, der kræver store indsættelser.
I forbindelse med genterapi har adenoassocierede vira (AAV'er) længe været brugt som køretøjer til at levere genetisk materiale på grund af deres effektive in vivo-infektivitet af både delende og ikke-delende celler, mangel på patogenicitet og sjælden genomisk integration20,21. For nylig har flere undersøgelser kombineret AAV'er med CRISPR-Cas9-teknologi for at introducere DNA-reparationsskabeloner og CRISPR-reagenser 22,23,24. Denne tilgang tillader levering af større DNA-reparationsskabeloner uden behov for mikroinjektionsteknikker.
HDR-vejen er mere aktiv i de sene S- og G2-faser af cellecyklussen25,26. I studier udført in vitro blev signifikante stigninger i knock-in-effektivitet opnået ved levering af CRISPR-Cas9 RNP'er og DNA-reparationsskabeloner til G2-synkroniserede celler eller ved begrænsning af tilstedeværelsen af Cas9-protein til sene S- og G2-faser under anvendelse af et Cas9-Geminin-fusionsprotein2. Desuden er der en større zygotisk genomaktivering (ZGA) begivenhed, der forekommer under den udvidede G2-fase af 2-cellestadiet embryo, og dette er forbundet med en åben kromatintilstand. Det spekuleres i, at dette giver CRISPR-Cas9 RNP'erne og reparationsskabelonerne større tilgængelighed til det genomiske DNA.
Vores mål var at bygge videre på alle disse observationer ved at kombinere AAV-tilgangen med embryoelektroporation for at introducere CRISPR-Cas9 RNP'er på 2-cellestadiet af embryoudvikling. Denne strategi udnytter AAV's større DNA-reparationsskabelonleveringskapacitet, den tekniske lethed ved elektroporation og det mere optimale 2-celles tidspunkt for genomisk tilgængelighed under embryoudvikling for at skabe en effektiv metode til målrettet gensplejsning af DNA-indsættelser. Som fremhævet i denne protokol giver vores optimerede metode mulighed for produktion af målrettede knock-in rottemodeller, der bærer indsættelser af DNA-sekvenser fra 1,2 til 3,0 kb i størrelse uden behov for mikroinjektionsteknikker.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Leads with alligator clips for electrodes</td>
			<td>NepaGene</td>
			<td>C117</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mineral oil</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>M5310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NepaGene21 Super Electroporator&#160;</td>
			<td>NepaGene</td>
			<td>NEPA21</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platinum plate electrodes on slide glass</td>
			<td>NepaGene</td>
			<td>CUY501P1-1.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PURedit Cas9 Protein</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>PECAS9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sgRNA (chemically-modified)</td>
			<td>Synthego</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ssAAV1 or ssAAV6 packaged DNA repair template</td>
			<td>Vectorbuilder</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

crispr-cas9 genome editing of rat embryos using adeno-associated virus (aav) and 2-cell embryo electroporation

Genomredigeringsteknologi bruges i vid udstrækning til at producere genetisk modificerede dyr, herunder rotter. Cytoplasmatisk eller pronukleær injektion af DNA-reparationsskabeloner og CRISPR-Cas-reagenser er den mest almindelige leveringsmetode i embryoner. Denne type mikromanipulation kræver imidlertid adgang til specialudstyr, er besværlig og kræver et vist niveau af teknisk dygtighed. Desuden resulterer mikroinjektionsteknikker ofte i lavere embryooverlevelse på grund af den mekaniske belastning på embryoet. I denne protokol udviklede vi en optimeret metode til at levere store DNA-reparationsskabeloner til at arbejde sammen med CRISPR-Cas9-genomredigering uden behov for mikroinjektion. Denne protokol kombinerer AAV-medieret DNA-levering af enkeltstrengede DNA-donorskabeloner sammen med levering af CRISPR-Cas9 ribonukleoprotein (RNP) ved elektroporation for at modificere 2-cellede embryoner. Ved hjælp af denne nye strategi har vi med succes produceret målrettede knock-in rottemodeller, der bærer indsættelse af DNA-sekvenser fra 1,2 til 3,0 kb i størrelse med effektivitetsgevinster mellem 42% og 90%.

Efter protokollen er der effektiv AAV-medieret levering af DNA-reparationsskabelonen, der giver mulighed for meget effektiv HDR, efter at 2-cellede embryoner er elektroporeret med CRISPR-Cas9 RNP'er. Som vist i videoen resulterer en vellykket elektroporationsproces i, at der dannes bobler på hver elektrode (figur 2C), og impedansen forbliver inden for området 0,100 og 0,300 kΩ. Efter elektroporation er det ikke ualmindeligt, at embryoner svulmer op og fyld...

Watch this Scientific Journal Video about CRISPR-Cas9 Genome Editing of Rat Embryos using Adeno-Associated Virus AAV and 2-Cell Embryo Electroporation at JoVE.com

CRISPR-Cas9 Genome Editing of Rat Embryos using Adeno-Associated Virus AAV and 2-Cell Embryo Electroporation

Denne protokol præsenterer en optimeret tilgang til fremstilling af genetisk modificerede rottemodeller. Adeno-associeret virus (AAV) bruges til at levere en DNA-reparationsskabelon, og elektroporation bruges til at levere CRISPR-Cas9-reagenser for at fuldføre genomredigeringsprocessen i 2-celleembryo.

CRISPR-Cas9 genomredigering af rotteembryoner ved hjælp af adenoassocieret virus (AAV) og 2-celle embryoelektroporation

Genome editing technology is widely used to produce genetically modified animals, including rats. Cytoplasmic or pronuclear injection of DNA repair ...

CRISPR-baserede genomredigeringsværktøjer har i høj grad lettet produktionen af genetisk manipulerede rep-modeller. CRISPR-systemet består af et enkelt guide-RNA-kompleks til en Cas9-nuklease og kan programmeres til at målrette mod en sekvens af interesse inden for genomet for at skabe et dobbeltstrenget DNA-brud. Gennem codelivery af en DNA-reparationsskabelon kan denne DNA-brud gendannes præcist sammen med tilføjelsen af enhver ønsket konstrueret DNA-sekvens gennem en proces kaldet Homology Directed Repair.Det er ved denne proces, at vi er i stand til at generere knock-in rottemodeller med målrettede DNA-indsættelser eller substitutioner. Ved hjælp af denne protokol præsenterer vi en modificeret tilgang ved hjælp af adeno-associeret virus til at levere en DNA-reparationsskabelon til rotteembryoner sammen med en efterfølgende levering af CRISPR Cas9-komplekser gennem to celleembryoelektroporation. AAV serotype 1 eller 6 er pakket med en konstrueret DNA-reparationsskabelon designet til at blive integreret i rottegenomet gennem den CRISPR-medierede Homology Directed Repair-proces.AAV tilsættes til en 30 mikroliter dråbe rotte KSOM-medier ved en endelig koncentration på 3 X 10 til de 7. genomkopier pr. Mikroliter. Derefter overføres nyligt indsamlede embryoner i et celletrin med synlige pronuclei til mediet indeholdende AAV, hvilket muliggør viral transduktion. Ved hjælp af vores protokol er der ingen grund til at tynde zona pellucida, da AAV-serotype 1 og 6 let kan passere igennem for effektiv levering af DNA-reparationsskabeloner.Embryoner dyrkes med AAV natten over ved 37 grader Celsius med 5% kuldioxid og maksimal luftfugtighed. Den følgende dag fremstilles en elektroporationsblanding indeholdende hundrede nanogram pr. mikroliter enkeltguide-RNA og hundrede nanogram pr. mikroliter Cas9-protein fortyndet i OptiMIM-medier. Blandingen inkuberes ved stuetemperatur i 10 minutter for at muliggøre dannelse af CRISPR RNP-komplekser.Under inkubationstiden tændes elektroporatoren, og ledninger fastgøres til glasglideelektroderne. Når RNP-dannelsen er afsluttet, pipetteres fem mikroliter elektroporationsblanding mellem elektroderne, idet man passer på ikke at indføre luftbobler til opløsningen. Embryoner, nu på tocellestadiet, fjernes fra mediet indeholdende AAV og flyttes omhyggeligt til elektroporationsblandingen mellem elektroderne.Embryoner er justeret, hvilket sikrer, at ingen rører ved nogen af elektroden, da dette vil forårsage lysis under elektroporationen. Her er et billede af denne procedure gennem mikroskopet. Det er også vigtigt at bemærke, at impedans vil falde, når volumenet mellem elektroderne øges.Af denne grund og for ikke at fortynde elektroporationsblandingen bør minimale medier overføres sammen med embryonerne. Derefter måles impedansen ved at trykke på knappen med et ohm-symbol på. Impedansen skal ligge inden for området fra 0,18 til 0,3 ohm.Hvis den er inden for rækkevidde, startes elektroporationen ved at trykke på startknappen. Denne proces tager kun et par sekunder, og sådan ser det ud gennem mikroskopet. Du vil bemærke, at der hurtigt dannes bobler på hver elektrode.Umiddelbart efter elektroporationen opsamles embryoner fra glasobjektglasset og vaskes tre gange i friske rotte KSOM-medier. Embryonerne kan derefter dyrkes til in vitro-undersøgelser eller overføres til surrogathunner for at producere levende afkom. Det er vigtigt at bemærke, at embryo hævelse er almindelig efter elektroporation.Denne hævelse skal aftage efter et par timer på kultur. Det er også almindeligt at se cellulære fusionshændelser i op til 20% af to celleembryoner efter elektroporation. Cellulær fusion kan typisk undgås ved omhyggelig vandret aksejustering af embryonerne mellem elektroderne.Test af vores protokol i rotteembryoner og screening af dyrkede blaster for indsættelse af en konstrueret kort kunstig intronsekvens indeholdende to loxP-steder. Vi bemærkede, at over 60% af blastocyster indeholder den korrekt målrettede knock-in allel baseret på næste generations sekvensanalyse. Dernæst tester vi vores protokol til produktion af levende knock-in rotter og designer et projekt til at konstruere en Cre-rekombinasebelægningssekvens målrettet ATG-startstedet for rottens DRD2-gen.Af de 11 fødte afkom var 10 positive ved PCR-analyse på tværs af de fem primære homologiarme, tre primære homologiarme og et internt PCR-assay til påvisning af Cre-rekombinase. Som et resumé over syv forskellige projekter har vi opnået en gennemsnitlig succesrate på 76% i knock-in hos grundlæggerdyr som bestemt af PCR-analyse på tværs af homologiarmkryds og DNA-sekvensverifikation. Ved hjælp af denne AAV-medierede DNA-levering og tocellede embryoelektroporationsrørledning har vi oplevet betydeligt højere knock-in-effektivitet end traditionelle tilgange til DNA-indsættelser op til tre KB i længden.Det er også vigtigt at bemærke, at mens vi demonstrerede brugen af denne procedure i rotteembryoner, kan den effektivt anvendes på andre arter til også at generere målrettede DNA-indsættelser.

Research

JoVE Journal

Genetics

CRISPR-Cas9 Genome Editing of Rat Embryos using Adeno-Associated Virus (AAV) and 2-Cell Embryo Electroporation

QTL Mapping and CRISPR/Cas9 Editing to Identify a Drug Resistance Gene in Toxoplasma gondii

QTL Mapping and CRISPR/Cas9 Editing to Identify a Drug Resistance Gene in Toxoplasma gondii

QTL Mapping og CRISPR / Cas9 redigering for at identificere et lægemiddelresistensgen i<em&gt; Toxoplasma gondii</em

Scientific knowledge is intrinsically linked to available technologies and methods. This article will present two methods that allowed for the ...

Systemic Delivery of MicroRNA Using Recombinant Adeno-associated Virus Serotype 9 to Treat Neuromuscular Diseases in Rodents

Systemisk levering af mikroRNA ved hjælp af rekombinante Adeno-associeret Virus Serotype 9 til behandling af neuromuskulære sygdomme i gnavere

RNA interference via the endogenous miRNA pathway regulates gene expression by controlling protein synthesis through post-transcriptional gene silencing. ...

A Standard Methodology to Examine On-site Mutagenicity As a Function of Point Mutation Repair Catalyzed by CRISPR/Cas9 and SsODN in Human Cells

En standardmetode til at undersøge ejendommen mutagenicitet som en funktion af punkt Mutation reparation katalyseret af CRISPR/Cas9 og SsODN i humane celler

Combinatorial gene editing using CRISPR/Cas9 and single-stranded oligonucleotides is an effective strategy for the correction of single-base point ...

Microinjection of CRISPR/Cas9 Protein into Channel Catfish, Ictalurus punctatus, Embryos for Gene Editing

Microinjection of CRISPR/Cas9 Protein into Channel Catfish, Ictalurus punctatus, Embryos for Gene Editing

Mikroinjektion af CRISPR/Cas9 Protein i kanal havkat, Ictalurus punctatus, embryoner til Gene Editing

The complete genome of the channel catfish, Ictalurus punctatus, has been sequenced, leading to greater opportunities for studying channel catfish gene ...

CRISPR/Cas9 Gene Editing to Make Conditional Mutants of Human Malaria Parasite P. falciparum

CRISPR/Cas9 Gene Editing to Make Conditional Mutants of Human Malaria Parasite P. falciparum

CRISPR/Cas9 gen redigering at gøre betinget mutanter af menneskelige Malaria parasitten, P. falciparum

Malaria is a significant cause of morbidity and mortality worldwide. This disease, which primarily affects those living in tropical and subtropical ...

Genome Editing in Mammalian Cell Lines using CRISPR-Cas

Genom-redigering i pattedyr cellelinjer ved hjælp af CRISPR-Cas

The clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) system functions naturally in bacterial adaptive immunity, but has been ...

CRISPR/Cas9 Ribonucleoprotein-mediated Precise Gene Editing by Tube Electroporation

CRISPR/Cas9 ribonucleoprotein-medieret præcis Genredigering ved Rørelektroporation

Gene editing nucleases, represented by CRISPR-associated protein 9 (Cas9), are becoming mainstream tools in biomedical research. Successful delivery of ...

Generation of Defined Genomic Modifications Using CRISPR-CAS9 in Human Pluripotent Stem Cells

Generation af definerede genomiske modifikationer med CRISPR-CAS9 i humane pluripotente stamceller

Human pluripotent stem cells offer a powerful system to study gene function and model specific mutations relevant to disease. The generation of precise ...

Cell Surface Receptor Identification Using Genome-Scale CRISPR/Cas9 Genetic Screens

Identifikation af cellereceptorer ved hjælp af genome-skala CRISPR/Cas9 genetiske skærme

Intercellular communication mediated by direct interactions between membrane-embedded cell surface receptors is crucial for the normal development and ...

CRISPR-Cas9-Mediated Genome Editing in the Filamentous Ascomycete Huntiella omanensis

CRISPR-Cas9-Mediated Genome Editing in the Filamentous Ascomycete Huntiella omanensis

CRISPR-Cas9-medieret Genom Redigering i filamentøse Ascomycete Huntiella omanensis

The CRISPR-Cas9 genome editing system is a molecular tool that can be used to introduce precise changes into the genomes of model and non-model species ...