Name: crispr-cas9 genome editing of rat embryos using adeno-associated virus (aav) and 2-cell embryo electroporation
Uploaded: 2024-03-15T13:20:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about CRISPR-Cas9 Genome Editing of Rat Embryos using Adeno-Associated Virus AAV and 2-Cell Embryo Electroporation at JoVE.com

Les auteurs tiennent à remercier Nolan Davis pour son aide dans la vidéographie et le montage vidéo.

Toutes les procédures expérimentales ont été approuvées par le Comité institutionnel de protection et d’utilisation des animaux de l’Université du Missouri (protocole ACUC #25580) et ont été effectuées conformément aux directives énoncées dans le Guide pour l’utilisation et le soin des animaux de laboratoire.
1. Livraison d’un modèle de réparation de l’ADN médié par l’AAV
<ol><li>Concevez la construction de l’ADN pour qu’elle contienne la sé...

<ol>
	<li>Lau, C. H., Tin, C., Suh, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-based+strategies+for+targeted+transgene+knock-in+and+gene+correction.">CRISPR-based strategies for targeted transgene knock-in and gene correction.</a> Fac Rev. 9, 20 (2020).</li><li>Gutschner, T., Haemmerle, M., Genovese, G., Draetta, G. F., Chin, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Post-translational+Regulation+of+Cas9+during+G1+Enhances+Homology-Directed+Repair.">Post-translational Regulation of Cas9 during G1 Enhances Homology-Directed Repair.</a> Cell Rep. 14 (6), 1555-1566 (2016).</li><li>Zhang, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+precise+knockin+with+a+double+cut+HDR+donor+after+CRISPR/Cas9-mediated+double-stranded+DNA+cleavage.">Efficient precise knockin with a double cut HDR donor after CRISPR/Cas9-mediated double-stranded DNA cleavage.</a> Genome Biol. 18 (1), 35 (2017).</li><li>Miura, H., Quadros, R. M., Gurumurthy, C. 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Y., Modzelewski, A. J., He, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+mouse+genome+editing+by+CRISPR+ribonucleoprotein+electroporation+of+zygotes.">Highly efficient mouse genome editing by CRISPR ribonucleoprotein electroporation of zygotes.</a> J Biol Chem. 291 (28), 14457-14467 (2016).</li><li>Hashimoto, M., Yamashita, Y., Takemoto, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electroporation+of+Cas9+protein/sgRNA+into+early+pronuclear+zygotes+generates+non-mosaic+mutants+in+the+mouse.">Electroporation of Cas9 protein/sgRNA into early pronuclear zygotes generates non-mosaic mutants in the mouse.</a> Dev Biol. 418 (1), 1-9 (2016).</li><li>Wang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delivery+of+Cas9+protein+into+mouse+zygotes+through+a+series+of+electroporation+dramatically+increases+the+efficiency+of+model+creation.">Delivery of Cas9 protein into mouse zygotes through a series of electroporation dramatically increases the efficiency of model creation.</a> J Genet Genomics. 43 (5), 319-327 (2016).</li><li>Troder, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optimized+electroporation+approach+for+efficient+CRISPR/Cas9+genome+editing+in+murine+zygotes.">An optimized electroporation approach for efficient CRISPR/Cas9 genome editing in murine zygotes.</a> PLoS One. 13 (5), e0196891 (2018).</li><li>Teixeira, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electroporation+of+mice+zygotes+with+dual+guide+RNA/Cas9+complexes+for+simple+and+efficient+cloning-free+genome+editing.">Electroporation of mice zygotes with dual guide RNA/Cas9 complexes for simple and efficient cloning-free genome editing.</a> Sci Rep. 8 (1), 474 (2018).</li><li>Tanihara, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+generation+of+GGTA1-deficient+pigs+by+electroporation+of+the+CRISPR/Cas9+system+into+in+vitro-fertilized+zygotes.">Efficient generation of GGTA1-deficient pigs by electroporation of the CRISPR/Cas9 system into in vitro-fertilized zygotes.</a> BMC Biotechnol. 20 (1), 40 (2020).</li><li>Tanihara, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+CD163-edited+pig+via+electroporation+of+the+CRISPR/Cas9+system+into+porcine+in+vitro-fertilized+zygotes.">Generation of CD163-edited pig via electroporation of the CRISPR/Cas9 system into porcine in vitro-fertilized zygotes.</a> Anim Biotechnol. 32 (2), 147-154 (2021).</li><li>Camargo, L. 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V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combining+engineered+nucleases+with+adeno-associated+viral+vectors+for+therapeutic+gene+editing.">Combining engineered nucleases with adeno-associated viral vectors for therapeutic gene editing.</a> Adv Exp Med Biol. 1016, 29-42 (2017).</li><li>Gaj, T., Epstein, B. E., Schaffer, D. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+engineering+using+adeno-associated+virus:+basic+and+clinical+research+applications.">Genome engineering using adeno-associated virus: basic and clinical research applications.</a> Mol Ther. 24 (3), 458-464 (2016).</li><li>Chen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-READI:+Efficient+generation+of+knockin+mice+by+CRISPR+RNP+electroporation+and+AAV+donor+infection.">CRISPR-READI: Efficient generation of knockin mice by CRISPR RNP electroporation and AAV donor infection.</a> Cell Rep. 27 (13), 3780-3789 (2019).</li><li>Mizuno, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intra-embryo+gene+cassette+knockin+by+CRISPR/CAS9-mediated+genome+editing+with+adeno-associated+viral+vector.">Intra-embryo gene cassette knockin by CRISPR/CAS9-mediated genome editing with adeno-associated viral vector.</a> iScience. 9, 286-297 (2018).</li><li>Davis, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+DNA+knock-in+using+AAV-mediated+delivery+with+2-cell+embryo+CRISPR-Cas9+electroporation.">Efficient DNA knock-in using AAV-mediated delivery with 2-cell embryo CRISPR-Cas9 electroporation.</a> Front Genome Ed. 5, 1256451 (2023).</li><li>Smirnikhina, S. A., Zaynitdinova, M. I., Sergeeva, V. A., Lavrov, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+homology-directed+repair+in+genome+editing+experiments+by+influencing+the+cell+cycle.">Improving homology-directed repair in genome editing experiments by influencing the cell cycle.</a> Int J Mol Sci. 23 (11), (2022).</li><li>Takata, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homologous+recombination+and+non-homologous+end-joining+pathways+of+DNA+double-strand+break+repair+have+overlapping+roles+in+the+maintenance+of+chromosomal+integrity+in+vertebrate+cells.">Homologous recombination and non-homologous end-joining pathways of DNA double-strand break repair have overlapping roles in the maintenance of chromosomal integrity in vertebrate cells.</a> EMBO J. 17 (18), 5497-5508 (1998).</li><li>Men, H., Stone, B. J., Bryda, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Media+optimization+to+promote+rat+embryonic+development+to+the+blastocyst+stage+in+vitro.">Media optimization to promote rat embryonic development to the blastocyst stage in vitro.</a> Theriogenology. 151, 81-85 (2020).</li><li>Men, H., Amos-Landgraf, J. M., Bryda, E. C., Franklin, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=KSOM-R+supports+both+mouse+and+rat+preimplantation+embryo+development+in+vitro.">KSOM-R supports both mouse and rat preimplantation embryo development in vitro.</a> Theriogenology. 198, 69-74 (2023).</li><li>Romeo, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AAV+diffuses+across+zona+pellucida+for+effortless+gene+delivery+to+fertilized+eggs.">AAV diffuses across zona pellucida for effortless gene delivery to fertilized eggs.</a> Biochem Biophys Res Commun. 526 (1), 85-90 (2020).</li><li>Fulka, J., Moor, R. M., Fulka, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrofusion+of+mammalian+oocytes+and+embryonic+cells.">Electrofusion of mammalian oocytes and embryonic cells.</a> Methods Mol Biol. 48, 309-316 (1995).</li><li>Rems, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+electrofusion+using+nanosecond+electric+pulses.">Cell electrofusion using nanosecond electric pulses.</a> Sci Rep. 3, 3382 (2013).</li></ol>

Le système d’édition du génome CRISPR-Cas a révolutionné le domaine du génie génétique en permettant la production efficace de modifications génétiques personnalisées simples et complexes chez une variété d’espèces animales. Des raffinements et des améliorations fréquents dans les techniques associées à l’édition du génome renforcent sa polyvalence. Nous avons décrit ici une nouvelle approche utilisant l’administration d’ADN médiée par ssAAV ainsi que l’électroporation embryonnaire à ...

Le développement d’outils d’édition du génome basés sur CRISPR a accéléré notre capacité à générer efficacement de nouveaux modèles de rats génétiquement modifiés plus sophistiqués. L’ARN guide unique, ainsi que la nucléase Cas9, sont combinés pour former des complexes ribonucléoprotéiques (RNP) qui ciblent les séquences d’ADN d’intérêt dans le génome et entraînent des cassures d’ADN double brin. Étant donné que les mécanismes de réparation de l’ADN cellulaire sont sujets aux erreurs, des insertions et des délétions (INDEL) sont introduites au cours du processus de réparation, ce qui peut perturber la fonction d’un gène cible. Lorsqu’il y a co-livraison d’une séquence d’ADN modifiée souhaitée (matrice de réparation) avec des réactifs d’édition du génome, l’insertion de la matrice de réparation dans la région contenant la cassure de l’ADN double brin se produit par un processus appelé réparation dirigée par homologie (HDR). Il s’agit d’une stratégie efficace pour générer des modèles animaux avec des insertions/substitutions d’ADN ciblées (knock-ins). L’une des limites est que les séquences knock-in sont souvent de grande taille, ce qui réduit l’efficacité de l’édition de gènes, ce qui rend la génération du modèle souhaité plus difficile1. Les stratégies visant à accroître l’efficacité de la frappe ont inclus la linéarisation des modèles de réparation de l’ADN double brin (ADNdb) et de l’ADN simple brin (ADNss) et la modification chimique des modèles de réparation de l’ADN 2,3,4. De plus, la micro-injection pronucléaire avec des composés stimulant le HDR, l’application d’impulsions électriques en conjonction avec la micro-injection et la micro-injection chronométrée dans des embryons à 2 cellules ont toutes été tentées 5,6,7. Malgré le succès de certaines de ces approches, l’incorporation de séquences d’ADN de plus de 1,0 kb reste techniquement difficile.
L’électroporation, qui est une méthode courante d’introduction de réactifs dans les lignées cellulaires en culture, offre une alternative à la micro-injection pour délivrer des composants CRISPR-Cas9 dans les embryons. L’électroporation embryonnaire, démontrée pour la première fois chez des embryons de rat8, a depuis été utilisée avec succès comme méthode d’administration chez les souris 9,10,11,12,13, les porcs 14,15 et d’autres organismes modèles animaux 16,17,18. Les embryons, en suspension dans le milieu contenant les réactifs CRISPR-Cas9, sont placés dans une cuvette ou sur une lame de verre entre deux électrodes et soumis à des impulsions directes de courants électriques. Cela crée des ouvertures transitoires dans la zone pellucide et la membrane plasmique de l’embryon à travers lesquelles les composants CRISPR-Cas9 pénètrent dans les embryons. En règle générale, des impulsions électriques de niveau intermédiaire sont utilisées pour créer les ouvertures temporaires, suivies d’impulsions de transfert électriques de niveau inférieur qui facilitent le mouvement des composants d’édition du génome chargés négativement. L’électroporation des embryons est efficace, a un débit élevé et est facile à réaliser. Cependant, alors que l’électroporation embryonnaire s’est avérée très efficace pour l’introduction de modèles de réparation d’ADNss de petite taille (<200 pb), il existe peu de rapports d’électroporation réussie de modèles de réparation plus grands (>1,0 kb)13,19. Cette restriction de taille représente une limitation majeure de l’électroporation embryonnaire pour la génération de modèles animaux knock-in nécessitant de grandes insertions.
Dans le contexte de la thérapie génique, les virus adéno-associés (AAV) ont longtemps été utilisés comme véhicules pour délivrer du matériel génétique en raison de leur infectiosité in vivo efficace des cellules en division et non en division, de leur manque de pathogénicité et de leur intégration génomique rare20,21. Récemment, d’autres études ont combiné les AAV avec la technologie CRISPR-Cas9 pour introduire des modèles de réparation de l’ADN et des réactifs CRISPR 22,23,24. Cette approche permet de fournir des modèles de réparation de l’ADN plus grands sans avoir besoin de techniques de micro-injection.
La voie HDR est plus active dans les phases tardives S et G2 du cycle cellulaire25,26. Dans les études réalisées in vitro, des augmentations significatives de l’efficacité de knock-in ont été obtenues par l’administration de RNP CRISPR-Cas9 et de matrices de réparation de l’ADN dans des cellules synchronisées G2 ou par la restriction de la présence de la protéine Cas9 aux phases tardives S et G2 à l’aide d’une protéine de fusion Cas9-Géminine2. De plus, il y a un événement majeur d’activation du génome zygotique (ZGA) qui se produit pendant la phase G2 prolongée de l’embryon au stade 2 cellules, et cela est associé à un état de chromatine ouvert. On suppose que cela donne aux RNP CRISPR-Cas9 et aux modèles de réparation une plus grande accessibilité à l’ADN génomique.
Notre objectif était de nous appuyer sur toutes ces observations, en combinant l’approche AAV avec l’électroporation de l’embryon pour introduire les RNP CRISPR-Cas9 au stade 2 cellules du développement embryonnaire. Cette stratégie tire parti de la plus grande capacité d’administration de la matrice de réparation de l’ADN de l’AAV, de la facilité technique de l’électroporation et du point de temps plus optimal à 2 cellules pour l’accessibilité génomique pendant le développement de l’embryon afin de créer une méthode efficace pour le génie génétique ciblé des insertions d’ADN. Comme le souligne ce protocole, notre méthode optimisée permet de produire des modèles ciblés de rats knock-in portant des insertions de séquences d’ADN d’une taille de 1,2 à 3,0 kb sans avoir besoin de techniques de micro-injection.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Leads with alligator clips for electrodes</td>
			<td>NepaGene</td>
			<td>C117</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mineral oil</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>M5310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NepaGene21 Super Electroporator&#160;</td>
			<td>NepaGene</td>
			<td>NEPA21</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platinum plate electrodes on slide glass</td>
			<td>NepaGene</td>
			<td>CUY501P1-1.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PURedit Cas9 Protein</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>PECAS9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sgRNA (chemically-modified)</td>
			<td>Synthego</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ssAAV1 or ssAAV6 packaged DNA repair template</td>
			<td>Vectorbuilder</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

crispr-cas9 genome editing of rat embryos using adeno-associated virus (aav) and 2-cell embryo electroporation

La technologie d’édition du génome est largement utilisée pour produire des animaux génétiquement modifiés, y compris des rats. L’injection cytoplasmique ou pronucléaire de matrices de réparation de l’ADN et de réactifs CRISPR-Cas est la méthode d’administration la plus courante dans les embryons. Cependant, ce type de micromanipulation nécessite l’accès à du matériel spécialisé, est laborieux et nécessite un certain niveau de compétence technique. De plus, les techniques de micro-injection entraînent souvent une survie embryonnaire plus faible en raison du stress mécanique subi par l’embryon. Dans ce protocole, nous avons développé une méthode optimisée pour fournir de grands modèles de réparation de l’ADN qui fonctionnent en conjonction avec l’édition du génome CRISPR-Cas9 sans avoir besoin de micro-injection. Ce protocole combine l’administration d’ADN médiée par AAV de modèles de donneurs d’ADN simple brin avec l’administration de la ribonucléoprotéine (RNP) CRISPR-Cas9 par électroporation pour modifier les embryons à 2 cellules. À l’aide de cette nouvelle stratégie, nous avons réussi à produire des modèles ciblés de rats knock-in portant l’insertion de séquences d’ADN d’une taille de 1,2 à 3,0 kb avec des efficacités comprises entre 42 % et 90 %.

En suivant le protocole, il y a une administration efficace médiée par AAV du modèle de réparation de l’ADN, ce qui permet un HDR très efficace après que les embryons à 2 cellules aient été électroporés avec des RNP CRISPR-Cas9. Comme le montre la vidéo, un processus d’électroporation réussi entraîne la formation de bulles sur chaque électrode (Figure 2C) et l’impédance reste dans la plage de 0,100 à 0,300 kΩ. Après l’électroporat...

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CRISPR-Cas9 Genome Editing of Rat Embryos using Adeno-Associated Virus AAV and 2-Cell Embryo Electroporation

Ce protocole présente une approche optimisée pour la production de modèles de rats génétiquement modifiés. Le virus adéno-associé (AAV) est utilisé pour fournir une matrice de réparation de l’ADN, et l’électroporation est utilisée pour délivrer des réactifs CRISPR-Cas9 afin de compléter le processus d’édition du génome dans un embryon à 2 cellules.

Édition du génome CRISPR-Cas9 d’embryons de rats à l’aide d’un virus adéno-associé (AAV) et d’une électroporation d’embryons à 2 cellules

Genome editing technology is widely used to produce genetically modified animals, including rats. Cytoplasmic or pronuclear injection of DNA repair ...

Les outils d’édition du génome basés sur CRISPR ont grandement facilité la production de modèles de représentation génétiquement modifiés. Le système CRISPR est composé d’un seul complexe d’ARN guide vers une nucléase Cas9 et peut être programmé pour cibler une séquence d’intérêt dans le génome afin de créer une cassure de l’ADN double brin. Grâce à la colivraison d’un modèle de réparation de l’ADN, cette cassure de l’ADN peut être restaurée avec précision ainsi que l’ajout de n’importe quelle séquence d’ADN modifiée souhaitée grâce à un processus appelé réparation dirigée par homologie.C’est par ce processus que nous sommes en mesure de générer des modèles de rats knock-in avec des insertions ou des substitutions d’ADN ciblées. À l’aide de ce protocole, nous présentons une approche modifiée utilisant un virus adéno-associé pour fournir un modèle de réparation de l’ADN à des embryons de rat, ainsi qu’une livraison ultérieure de complexes CRISPR Cas9 par électroporation d’embryons à deux cellules. Les sérotypes AAV 1 ou 6 sont emballés avec un modèle de réparation de l’ADN conçu pour être intégré dans le génome du rat par le biais du processus de réparation dirigée par homologie médiée par CRISPR.L’AAV est ajouté à une goutte de 30 microlitres de milieu KSOM de rat à une concentration finale de 3 X 10 à 7 copies du génome par microlitre. Ensuite, des embryons d’une cellule fraîchement prélevés avec des pronoyaux visibles sont ensuite transférés dans le milieu contenant de l’AAV, ce qui permet la transduction virale. En utilisant notre protocole, il n’est pas nécessaire d’amincir la zone pellucide, car les sérotypes AAV 1 et 6 sont capables de passer facilement à travers pour une livraison efficace de la matrice de réparation de l’ADN.Les embryons sont cultivés avec l’AAV pendant la nuit à 37 degrés Celsius avec 5% de dioxyde de carbone et une humidité maximale. Le lendemain, on réalise un mélange d’électroporation contenant une centaine de nanogrammes par microlitre d’ARN guide unique et une centaine de nanogrammes par microlitre de protéine Cas9 diluée dans un milieu OptiMIM. Le mélange est incubé à température ambiante pendant 10 minutes pour permettre la formation de complexes CRISPR RNP.Pendant le temps d’incubation, l’électroporateur est allumé et des fils sont fixés aux électrodes à lame de verre. Une fois la formation de RNP terminée, cinq microlitres de mélange d’électroporation sont pipetés entre les électrodes, en prenant soin de ne pas introduire de bulles d’air dans la solution. Les embryons, maintenant au stade de deux cellules, sont retirés du milieu contenant de l’AAV et soigneusement déplacés vers le mélange d’électroporation entre les électrodes.Les embryons sont alignés, en veillant à ce qu’aucun ne touche l’une ou l’autre des électrodes, car cela provoquerait une lyse pendant l’électroporation. Voici une vue de cette procédure à travers le microscope. Il est également important de noter que l’impédance diminue à mesure que le volume entre les électrodes augmente.Pour cette raison, et afin de ne pas diluer le mélange d’électroporation, un minimum de milieux doit être transféré avec les embryons. Ensuite, l’impédance est mesurée en appuyant sur le bouton avec un symbole ohm dessus. L’impédance doit être comprise entre 0,18 et 0,3 ohms.S’il est à portée, l’électroporation est démarrée en appuyant sur le bouton de démarrage. Ce processus ne prend que quelques secondes, et voici à quoi il ressemble au microscope. Vous remarquerez que des bulles se forment rapidement sur chaque électrode.Immédiatement après l’électroporation, les embryons sont prélevés sur la lame de verre et lavés trois fois dans un milieu KSOM de rat frais. Les embryons peuvent ensuite être cultivés pour des études in vitro ou transférés à des femelles porteuses pour produire une progéniture vivante. Il est important de noter que le gonflement de l’embryon est fréquent après l’électroporation.Ce gonflement devrait s’atténuer après quelques heures de culture. Il est également fréquent de voir des événements de fusion cellulaire dans jusqu’à 20% des embryons de deux cellules après l’électroporation. La fusion cellulaire peut généralement être évitée par un alignement minutieux de l’axe horizontal des embryons entre les électrodes.Tester notre protocole sur des embryons de rat et cribler des blastes cultivés pour l’insertion d’une courte séquence d’intron artificiel contenant deux sites loxP. Nous avons noté que plus de 60 % des blastocystes contiennent l’allèle knock-in correctement ciblé sur la base d’une analyse de séquence de nouvelle génération. Ensuite, en testant davantage notre protocole pour produire des rats knock-in vivants, nous concevons un projet visant à concevoir une séquence d’enrobage de la recombinase Cre ciblant le site de départ ATG du gène DRD2 du rat.Sur les 11 enfants nés, 10 étaient positifs par analyse PCR dans le bras à cinq homologies principales, à trois bras d’homologie principale et à un test PCR interne pour détecter la recombinase de la Cre. En résumé, sur sept projets différents, nous avons atteint un taux de réussite moyen de 76 % chez les animaux fondateurs, tel que déterminé par l’analyse PCR des jonctions de bras d’homologie et la vérification de la séquence d’ADN. En utilisant cette livraison d’ADN médiée par AAV et ce pipeline d’électroporation d’embryons à deux cellules, nous avons constaté des efficacités de frappe significativement plus élevées que les approches traditionnelles pour les insertions d’ADN d’une longueur maximale de trois Ko.Il est également important de noter que, bien que nous ayons démontré l’utilisation de cette procédure chez les embryons de rats, elle peut également être appliquée efficacement à d’autres espèces pour générer des insertions d’ADN ciblées.

Research

JoVE Journal

Genetics

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Recherche

Génétique

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