Name: crispr-cas9 genome editing of rat embryos using adeno-associated virus (aav) and 2-cell embryo electroporation
Uploaded: 2024-03-15T13:20:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about CRISPR-Cas9 Genome Editing of Rat Embryos using Adeno-Associated Virus AAV and 2-Cell Embryo Electroporation at JoVE.com

המחברים רוצים להודות לנולאן דייוויס על הסיוע בצילום וידאו ובעריכת וידאו.

כל הליכי הניסוי אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים של אוניברסיטת מיזורי (פרוטוקול ACUC #25580) ובוצעו בהתאם להנחיות המפורטות במדריך לשימוש וטיפול בחיות מעבדה.
1. מסירת תבנית תיקון DNA בתיווך AAV
<ol><li>תכנן את מבנה הדנ"א כך שיכיל את רצף הדפיקה הרצוי בין שתי ?...

<ol>
	<li>Lau, C. H., Tin, C., Suh, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-based+strategies+for+targeted+transgene+knock-in+and+gene+correction.">CRISPR-based strategies for targeted transgene knock-in and gene correction.</a> Fac Rev. 9, 20 (2020).</li><li>Gutschner, T., Haemmerle, M., Genovese, G., Draetta, G. F., Chin, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Post-translational+Regulation+of+Cas9+during+G1+Enhances+Homology-Directed+Repair.">Post-translational Regulation of Cas9 during G1 Enhances Homology-Directed Repair.</a> Cell Rep. 14 (6), 1555-1566 (2016).</li><li>Zhang, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+precise+knockin+with+a+double+cut+HDR+donor+after+CRISPR/Cas9-mediated+double-stranded+DNA+cleavage.">Efficient precise knockin with a double cut HDR donor after CRISPR/Cas9-mediated double-stranded DNA cleavage.</a> Genome Biol. 18 (1), 35 (2017).</li><li>Miura, H., Quadros, R. M., Gurumurthy, C. B., Ohtsuka, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Easi-CRISPR+for+creating+knock-in+and+conditional+knockout+mouse+models+using+long+ssDNA+donors.">Easi-CRISPR for creating knock-in and conditional knockout mouse models using long ssDNA donors.</a> Nat Protoc. 13 (1), 195-215 (2018).</li><li>Gu, B., Posfai, E., Gertsenstein, M., Rossant, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+generation+of+large-fragment+knock-in+mouse+models+using+2-cell+(2C)-homologous+recombination+(HR)-CRISPR.">Efficient generation of large-fragment knock-in mouse models using 2-cell (2C)-homologous recombination (HR)-CRISPR.</a> Curr Protoc Mouse Biol. 10 (1), e67 (2020).</li><li>Gu, B., Posfai, E., Rossant, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+generation+of+targeted+large+insertions+by+microinjection+into+two-cell-stage+mouse+embryos.">Efficient generation of targeted large insertions by microinjection into two-cell-stage mouse embryos.</a> Nat Biotechnol. 36 (7), 632-637 (2018).</li><li>Kurihara, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+repair+protein+RAD51+enhances+the+CRISPR/Cas9-mediated+knock-in+efficiency+in+brain+neurons.">DNA repair protein RAD51 enhances the CRISPR/Cas9-mediated knock-in efficiency in brain neurons.</a> Biochem Biophys Res Commun. 524 (3), 621-628 (2020).</li><li>Kaneko, T., Sakuma, T., Yamamoto, T., Mashimo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+knockout+by+electroporation+of+engineered+endonucleases+into+intact+rat+embryos.">Simple knockout by electroporation of engineered endonucleases into intact rat embryos.</a> Sci Rep. 4, 6382 (2014).</li><li>Chen, S., Lee, B., Lee, A. Y., Modzelewski, A. J., He, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+mouse+genome+editing+by+CRISPR+ribonucleoprotein+electroporation+of+zygotes.">Highly efficient mouse genome editing by CRISPR ribonucleoprotein electroporation of zygotes.</a> J Biol Chem. 291 (28), 14457-14467 (2016).</li><li>Hashimoto, M., Yamashita, Y., Takemoto, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electroporation+of+Cas9+protein/sgRNA+into+early+pronuclear+zygotes+generates+non-mosaic+mutants+in+the+mouse.">Electroporation of Cas9 protein/sgRNA into early pronuclear zygotes generates non-mosaic mutants in the mouse.</a> Dev Biol. 418 (1), 1-9 (2016).</li><li>Wang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delivery+of+Cas9+protein+into+mouse+zygotes+through+a+series+of+electroporation+dramatically+increases+the+efficiency+of+model+creation.">Delivery of Cas9 protein into mouse zygotes through a series of electroporation dramatically increases the efficiency of model creation.</a> J Genet Genomics. 43 (5), 319-327 (2016).</li><li>Troder, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optimized+electroporation+approach+for+efficient+CRISPR/Cas9+genome+editing+in+murine+zygotes.">An optimized electroporation approach for efficient CRISPR/Cas9 genome editing in murine zygotes.</a> PLoS One. 13 (5), e0196891 (2018).</li><li>Teixeira, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electroporation+of+mice+zygotes+with+dual+guide+RNA/Cas9+complexes+for+simple+and+efficient+cloning-free+genome+editing.">Electroporation of mice zygotes with dual guide RNA/Cas9 complexes for simple and efficient cloning-free genome editing.</a> Sci Rep. 8 (1), 474 (2018).</li><li>Tanihara, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+generation+of+GGTA1-deficient+pigs+by+electroporation+of+the+CRISPR/Cas9+system+into+in+vitro-fertilized+zygotes.">Efficient generation of GGTA1-deficient pigs by electroporation of the CRISPR/Cas9 system into in vitro-fertilized zygotes.</a> BMC Biotechnol. 20 (1), 40 (2020).</li><li>Tanihara, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+CD163-edited+pig+via+electroporation+of+the+CRISPR/Cas9+system+into+porcine+in+vitro-fertilized+zygotes.">Generation of CD163-edited pig via electroporation of the CRISPR/Cas9 system into porcine in vitro-fertilized zygotes.</a> Anim Biotechnol. 32 (2), 147-154 (2021).</li><li>Camargo, L. S. A., Owen, J. R., Van Eenennaam, A. L., Ross, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+one-step+knockout+by+electroporation+of+ribonucleoproteins+into+zona-intact+bovine+embryos.">Efficient one-step knockout by electroporation of ribonucleoproteins into zona-intact bovine embryos.</a> Front Genet. 11, 570069 (2020).</li><li>Lin, J. C., Van Eenennaam, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electroporation-mediated+genome+editing+of+livestock+zygotes.">Electroporation-mediated genome editing of livestock zygotes.</a> Front Genet. 12, 648482 (2021).</li><li>Betters, E., Charney, R. M., Garcia-Castro, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electroporation+and+in+vitro+culture+of+early+rabbit+embryos.">Electroporation and in vitro culture of early rabbit embryos.</a> Data Brief. 21, 316-320 (2018).</li><li>Miyasaka, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CLICK:+one-step+generation+of+conditional+knockout+mice.">CLICK: one-step generation of conditional knockout mice.</a> BMC Genomics. 19 (1), 318 (2018).</li><li>Epstein, B. E., Schaffer, D. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combining+engineered+nucleases+with+adeno-associated+viral+vectors+for+therapeutic+gene+editing.">Combining engineered nucleases with adeno-associated viral vectors for therapeutic gene editing.</a> Adv Exp Med Biol. 1016, 29-42 (2017).</li><li>Gaj, T., Epstein, B. E., Schaffer, D. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+engineering+using+adeno-associated+virus:+basic+and+clinical+research+applications.">Genome engineering using adeno-associated virus: basic and clinical research applications.</a> Mol Ther. 24 (3), 458-464 (2016).</li><li>Chen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-READI:+Efficient+generation+of+knockin+mice+by+CRISPR+RNP+electroporation+and+AAV+donor+infection.">CRISPR-READI: Efficient generation of knockin mice by CRISPR RNP electroporation and AAV donor infection.</a> Cell Rep. 27 (13), 3780-3789 (2019).</li><li>Mizuno, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intra-embryo+gene+cassette+knockin+by+CRISPR/CAS9-mediated+genome+editing+with+adeno-associated+viral+vector.">Intra-embryo gene cassette knockin by CRISPR/CAS9-mediated genome editing with adeno-associated viral vector.</a> iScience. 9, 286-297 (2018).</li><li>Davis, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+DNA+knock-in+using+AAV-mediated+delivery+with+2-cell+embryo+CRISPR-Cas9+electroporation.">Efficient DNA knock-in using AAV-mediated delivery with 2-cell embryo CRISPR-Cas9 electroporation.</a> Front Genome Ed. 5, 1256451 (2023).</li><li>Smirnikhina, S. A., Zaynitdinova, M. I., Sergeeva, V. A., Lavrov, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+homology-directed+repair+in+genome+editing+experiments+by+influencing+the+cell+cycle.">Improving homology-directed repair in genome editing experiments by influencing the cell cycle.</a> Int J Mol Sci. 23 (11), (2022).</li><li>Takata, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homologous+recombination+and+non-homologous+end-joining+pathways+of+DNA+double-strand+break+repair+have+overlapping+roles+in+the+maintenance+of+chromosomal+integrity+in+vertebrate+cells.">Homologous recombination and non-homologous end-joining pathways of DNA double-strand break repair have overlapping roles in the maintenance of chromosomal integrity in vertebrate cells.</a> EMBO J. 17 (18), 5497-5508 (1998).</li><li>Men, H., Stone, B. J., Bryda, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Media+optimization+to+promote+rat+embryonic+development+to+the+blastocyst+stage+in+vitro.">Media optimization to promote rat embryonic development to the blastocyst stage in vitro.</a> Theriogenology. 151, 81-85 (2020).</li><li>Men, H., Amos-Landgraf, J. M., Bryda, E. C., Franklin, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=KSOM-R+supports+both+mouse+and+rat+preimplantation+embryo+development+in+vitro.">KSOM-R supports both mouse and rat preimplantation embryo development in vitro.</a> Theriogenology. 198, 69-74 (2023).</li><li>Romeo, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AAV+diffuses+across+zona+pellucida+for+effortless+gene+delivery+to+fertilized+eggs.">AAV diffuses across zona pellucida for effortless gene delivery to fertilized eggs.</a> Biochem Biophys Res Commun. 526 (1), 85-90 (2020).</li><li>Fulka, J., Moor, R. M., Fulka, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrofusion+of+mammalian+oocytes+and+embryonic+cells.">Electrofusion of mammalian oocytes and embryonic cells.</a> Methods Mol Biol. 48, 309-316 (1995).</li><li>Rems, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+electrofusion+using+nanosecond+electric+pulses.">Cell electrofusion using nanosecond electric pulses.</a> Sci Rep. 3, 3382 (2013).</li></ol>

מערכת עריכת הגנום CRISPR-Cas חוללה מהפכה בתחום ההנדסה הגנטית בכך שאפשרה ייצור יעיל של שינויים גנטיים פשוטים ומורכבים בהתאמה אישית במגוון מיני בעלי חיים. שכלולים תכופים ושיפורים בטכניקות הקשורות לעריכת גנום מגבירים את הרבגוניות שלו. כאן תיארנו גישה חדשה המשתמשת בהעברת DNA בתיווך ssAAV יחד עם אלקט...

הפיתוח של כלי עריכת גנום מבוססי קריספר האיץ את יכולתנו ליצור ביעילות מודלים חדשים ומתוחכמים יותר של חולדות מהונדסות-גנטית. רנ"א חד-מנחי, יחד עם נוקלאז Cas9, משולב ליצירת קומפלקסים של ריבונוקלאו פרוטאין (RNP) המכוונים לרצפי דנ"א בעלי עניין בתוך הגנום וגורמים לשבירת DNA דו-גדילי. מכיוון שמנגנוני תיקון דנ"א תאי מועדים לשגיאות, החדרות ומחיקות (INDELs) מוכנסות במהלך תהליך התיקון שיכולות לשבש את תפקוד גן המטרה. כאשר יש העברה משותפת של רצף דנ"א מהונדס רצוי (תבנית תיקון) יחד עם ריאגנטים לעריכת גנום, החדרת תבנית התיקון באזור המכיל את שבירת הדנ"א הדו-גדילי מתרחשת בתהליך שנקרא תיקון מכוון הומולוגיה (HDR). זוהי אסטרטגיה יעילה ליצירת מודלים של בעלי חיים עם החדרות/החלפות ממוקדות של DNA (נוק-אין). מגבלה אחת היא שרצפי דפיקה הם לעתים קרובות גדולים בגודלם, מה שהוכח כמפחית את יעילות עריכת הגנים, ובכך מקשה על יצירת המודל הרצוי1. אסטרטגיות להגברת היעילות כללו ליניאריזציה של תבניות תיקון DNA דו-גדילי (dsDNA) ו-DNA חד-גדילי (ssDNA) ושינוי כימי של תבניות תיקון DNA 2,3,4. בנוסף, מיקרו-הזרקה פרו-גרעינית יחד עם תרכובות מעוררות HDR, יישום פולסים חשמליים בשילוב עם מיקרו-הזרקה, ומיקרו-הזרקה מתוזמנת לעוברים דו-תאיים נוסו כולם 5,6,7. למרות ההצלחה של כמה מגישות אלה, השילוב של רצפי DNA גדולים מ -1.0 קילובייט נותר מאתגר מבחינה טכנית.
אלקטרופורציה, שהיא שיטה נפוצה להחדרת ריאגנטים לקווי תאים בתרבית, מציעה חלופה למיקרו-הזרקה להעברת רכיבי CRISPR-Cas9 לעוברים. אלקטרופורציה עוברית, שהודגמה לראשונה בעוברי חולדות8, שימשה מאז בהצלחה כשיטת לידה בעכברים 9,10,11,12,13, חזירים 14,15 ואורגניזמים אחרים מודל של בעלי חיים 16,17,18. עוברים, המרחפים בתווך המכיל ריאגנטים מסוג CRISPR-Cas9, מוכנסים לקובט או למגלשת זכוכית בין שתי אלקטרודות ונתונים לפולסים ישירים של זרמים חשמליים. זה יוצר פתחים חולפים בזונה פלוצ'ידה ובקרום הפלזמה העוברית שדרכם רכיבי CRISPR-Cas9 נכנסים לעוברים. בדרך כלל, פולסי "נקבוביות" חשמליים ברמה בינונית משמשים ליצירת הפתחים הזמניים ולאחריהם "פולסי העברה" חשמליים ברמה נמוכה יותר המאפשרים תנועה של רכיבי עריכת הגנום הטעונים שלילית. אלקטרופורציה של עוברים היא יעילה, בעלת תפוקה גבוהה וקלה לביצוע. עם זאת, בעוד אלקטרופורציה של עוברים הוכחה כמוצלחת מאוד עבור הצגת תבניות תיקון ssDNA קטנות (<200 bp), ישנם דיווחים מעטים על אלקטרופורציה מוצלחת של תבניות תיקון גדולות יותר (>1.0 kb)13,19. מגבלת גודל זו מייצגת מגבלה גדולה של אלקטרופורציה של עוברים ליצירת מודלים של בעלי חיים הדורשים החדרות גדולות.
בהקשר של ריפוי גנטי, וירוסים הקשורים באדנו (AAVs) שימשו זה מכבר ככלי להעברת חומר גנטי בשל יעילותם בהדבקה in vivo של תאים מתחלקים ולא מתחלקים, חוסר פתוגניות, ואינטגרציה גנומית נדירה20,21. לאחרונה, מחקרים נוספים שילבו AAVs עם טכנולוגיית CRISPR-Cas9 כדי להציג תבניות תיקון DNA וריאגנטים CRISPR 22,23,24. גישה זו מאפשרת משלוח של תבניות תיקון DNA גדולות יותר ללא צורך בטכניקות מיקרו-הזרקה.
מסלול HDR פעיל יותר בשלבים המאוחרים של S ו- G2 של מחזור התא25,26. במחקרים שבוצעו במבחנה, עליות משמעותיות ביעילות הדפיקה הושגו על ידי העברת CRISPR-Cas9 RNPs ותבניות תיקון DNA לתאים מסונכרנים G2 או על ידי הגבלת נוכחות חלבון Cas9 לשלבים מאוחרים של S ו- G2 באמצעות חלבון היתוך Cas9-Geminin2. יתר על כן, יש אירוע גדול של הפעלת גנום זיגוטי (ZGA) המתרחש במהלך שלב G2 המורחב של העובר בשלב 2 תאים, וזה קשור למצב כרומטין פתוח. משערים כי הדבר מספק ל-CRISPR-Cas9 RNPs ולתבניות תיקון נגישות רבה יותר לדנ"א הגנומי.
מטרתנו הייתה להתבסס על כל התצפיות הללו, על ידי שילוב גישת AAV עם אלקטרופורציה של עוברים כדי להציג CRISPR-Cas9 RNPs בשלב 2 התאים של התפתחות העובר. אסטרטגיה זו מנצלת את יכולת המסירה הגדולה יותר של תבנית תיקון DNA של AAV, את הקלות הטכנית של אלקטרופורציה ואת נקודת הזמן האופטימלית יותר של 2 תאים לנגישות גנומית במהלך התפתחות העובר כדי ליצור שיטה יעילה להנדסה גנטית ממוקדת של החדרות DNA. כפי שמודגש בפרוטוקול זה, השיטה האופטימלית שלנו מאפשרת ייצור של מודלים ממוקדים של חולדות הנושאות החדרות של רצפי DNA בגודל של 1.2 עד 3.0 קילובייט ללא צורך בטכניקות מיקרו-הזרקה.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Leads with alligator clips for electrodes</td>
			<td>NepaGene</td>
			<td>C117</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mineral oil</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>M5310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NepaGene21 Super Electroporator&#160;</td>
			<td>NepaGene</td>
			<td>NEPA21</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platinum plate electrodes on slide glass</td>
			<td>NepaGene</td>
			<td>CUY501P1-1.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PURedit Cas9 Protein</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>PECAS9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sgRNA (chemically-modified)</td>
			<td>Synthego</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ssAAV1 or ssAAV6 packaged DNA repair template</td>
			<td>Vectorbuilder</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

crispr-cas9 genome editing of rat embryos using adeno-associated virus (aav) and 2-cell embryo electroporation

טכנולוגיית עריכת גנום נמצאת בשימוש נרחב לייצור בעלי חיים מהונדסים גנטית, כולל חולדות. הזרקה ציטופלזמית או פרו-גרעינית של תבניות תיקון DNA וריאגנטים CRISPR-Cas היא שיטת המסירה הנפוצה ביותר לעוברים. עם זאת, סוג זה של micromanipulation מחייב גישה לציוד מיוחד, הוא מייגע, ודורש רמה מסוימת של מיומנות טכנית. יתר על כן, טכניקות מיקרו-הזרקה לעיתים קרובות גורמות להישרדות נמוכה יותר של העובר בשל הלחץ המכני על העובר. בפרוטוקול זה, פיתחנו שיטה אופטימלית לספק תבניות גדולות לתיקון DNA שיעבדו בשילוב עם עריכת גנום CRISPR-Cas9 ללא צורך במיקרו-הזרקה. פרוטוקול זה משלב מסירת DNA בתיווך AAV של תבניות תורם DNA חד-גדילי יחד עם אספקת CRISPR-Cas9 ribonucleoprotein (RNP) על ידי אלקטרופורציה לשינוי עוברים דו-תאיים. באמצעות אסטרטגיה חדשנית זו, ייצרנו בהצלחה מודלים ממוקדים של חולדות נוקבות הנושאות החדרה של רצפי DNA בגודל של 1.2 עד 3.0 קילובייט עם יעילות של בין 42% ל -90%.

בעקבות הפרוטוקול, קיימת העברה יעילה בתיווך AAV של תבנית תיקון הדנ"א המאפשרת HDR יעיל ביותר לאחר שעוברים בעלי 2 תאים עוברים אלקטרופורציה עם CRISPR-Cas9 RNPs. כפי שניתן לראות בווידיאו, תהליך אלקטרופורציה מוצלח גורם להיווצרות בועות על כל אלקטרודה (איור 2C) והעכבה נשארת ?...

Watch this Scientific Journal Video about CRISPR-Cas9 Genome Editing of Rat Embryos using Adeno-Associated Virus AAV and 2-Cell Embryo Electroporation at JoVE.com

CRISPR-Cas9 Genome Editing of Rat Embryos using Adeno-Associated Virus AAV and 2-Cell Embryo Electroporation

פרוטוקול זה מציג גישה אופטימלית לייצור מודלים של חולדות מהונדסות-גנטית. וירוס הקשור לאדנו (AAV) משמש להעברת תבנית תיקון DNA, ואלקטרופורציה משמשת להעברת ריאגנטים CRISPR-Cas9 כדי להשלים את תהליך עריכת הגנום בעובר בן 2 תאים.

עריכת גנום CRISPR-Cas9 של עוברי חולדות באמצעות Adeno-Associated Virus (AAV) ואלקטרופורציה של עוברים דו-תאיים

Genome editing technology is widely used to produce genetically modified animals, including rats. Cytoplasmic or pronuclear injection of DNA repair ...

כלי עריכת גנום מבוססי קריספר הקלו מאוד על הייצור של מודלים מהונדסים גנטית של חזרות. מערכת הקריספר מורכבת מקומפלקס רנ"א מנחה יחיד לנוקלאז Cas9 וניתן לתכנת אותה לכוון לרצף מעניין בתוך הגנום כדי ליצור שבר DNA דו-גדילי. באמצעות העברה משותפת של תבנית תיקון דנ"א, ניתן לשחזר במדויק את שבר הדנ"א הזה יחד עם הוספה של כל רצף דנ"א מהונדס רצוי באמצעות תהליך שנקרא תיקון מכוון הומולוגיה.באמצעות התהליך הזה אנו מסוגלים ליצור מודלים של חולדות עם החדרות או החלפות ממוקדות של דנ"א. באמצעות פרוטוקול זה, אנו מציגים גישה שונה באמצעות וירוס הקשור באדנו כדי לספק תבנית תיקון DNA לעוברי חולדות, יחד עם משלוח עוקב של קומפלקסים CRISPR Cas9 באמצעות אלקטרופורציה של שני עוברי תאים. סרוטיפים AAV 1 או 6 ארוזים עם תבנית תיקון DNA מהונדסת המיועדת להשתלב בגנום החולדה באמצעות תהליך תיקון מכוון הומולוגיה בתיווך CRISPR.ה-AAV מתווסף לטיפה של 30 מיקרוליטר של מדיה KSOM של חולדה בריכוז סופי של 3 X 10 לעותקי הגנום השביעי למיקרוליטר. לאחר מכן, עוברים טריים שנאספו בשלב התא עם גרעינים גלויים מועברים לאחר מכן למדיה המכילה AAV ומאפשרים התמרה ויראלית להתרחש. באמצעות הפרוטוקול שלנו, אין צורך לדלל את zona pellucida כמו סרוטיפים AAV 1 ו 6 מסוגלים לעבור בקלות עבור משלוח יעיל של תבנית תיקון DNA.עוברים מתורבתים עם AAV בן לילה ב 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני ולחות מקסימלית. למחרת מכינים תערובת אלקטרופורציה המכילה מאה ננוגרם למיקרוליטר רנ"א מנחה יחיד ומאה ננוגרם למיקרוליטר חלבון Cas9 המדולל במדיית OptiMIM. התערובת מודגרת בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות כדי לאפשר היווצרות קומפלקסים של CRISPR RNP.במהלך זמן הדגירה, האלקטרופורטור מופעל ומוליכים מחוברים לאלקטרודות שקופיות הזכוכית. לאחר היווצרות RNP הושלמה, חמישה מיקרוליטרים של תערובת אלקטרופורציה הוא pipeted בין האלקטרודות, נזהר לא להכניס בועות אוויר לתמיסה. עוברים, הנמצאים כעת בשלב שני התאים, מוסרים מהמדיה המכילה AAV ומועברים בזהירות לתערובת האלקטרופורציה בין האלקטרודות.העוברים מיושרים, מה שמבטיח שאף אחד מהם לא נוגע באף אחת מהאלקטרודות מכיוון שזה יגרום לליזה במהלך ההתחשמלות. הנה תצוגה של הליך זה דרך המיקרוסקופ. חשוב גם לציין כי העכבה תפחת ככל שהנפח בין האלקטרודות יגדל.מסיבה זו, וכדי לא לדלל את תערובת האלקטרופורציה, יש להעביר מדיה מינימלית יחד עם העוברים. לאחר מכן, העכבה נמדדת על ידי לחיצה על הכפתור עם סמל אוהם על זה. העכבה צריכה להיות בטווח של 0.18 עד 0.3 אוהם.אם בטווח, אלקטרופורציה מופעלת על ידי לחיצה על כפתור ההפעלה. תהליך זה לוקח רק כמה שניות, וכך זה נראה דרך המיקרוסקופ. תוכלו להבחין בבועות הנוצרות במהירות על כל אלקטרודה.מיד לאחר ההתחשמלות, העוברים נאספים משקופית הזכוכית ונשטפים שלוש פעמים במדיה KSOM של חולדה טרייה. לאחר מכן ניתן לגדל את העוברים בתרבית לצורך מחקרי מבחנה או להעביר אותם לנקבות פונדקאיות כדי להעמיד צאצאים חיים. חשוב לציין כי נפיחות בעובר שכיחה לאחר התחשמלות.נפיחות זו אמורה לשכך לאחר מספר שעות בתרבית. כמו כן, שכיח לראות אירועי איחוי תאי בעד 20% משני עוברי תאים לאחר אלקטרופורציה. איחוי תאי יכול בדרך כלל להימנע על ידי יישור ציר אופקי זהיר של העוברים בין האלקטרודות.בדיקת הפרוטוקול שלנו בעוברי חולדות וסינון פיצוצים בתרבית לצורך החדרת רצף אינטרון מלאכותי קצר ומהונדס המכיל שני אתרי loxP. שמנו לב שיותר מ-60% מהבלסטוציסטים מכילים את האלל הממוקד נכון בהתבסס על ניתוח רצף הדור הבא. לאחר מכן, לאחר בדיקה נוספת של הפרוטוקול שלנו לייצור חולדות חיות, אנו מתכננים פרויקט להנדס רצף ציפוי Cre recombinase המיועד לאתר ההתחלה ATG של הגן DRD2 של חולדה.מתוך 11 הצאצאים שנולדו, 10 היו חיוביים על ידי ניתוח PCR על פני חמש זרועות ההומולוגיה הראשונית, שלוש זרועות הומולוגיה ראשוניות, ובדיקת PCR פנימית לזיהוי Cre recombinase. לסיכום על פני שבעה פרויקטים שונים, השגנו שיעור הצלחה ממוצע של 76% בבעלי חיים מייסדים כפי שנקבע על ידי ניתוח PCR בצמתי זרועות הומולוגיה ואימות רצפי DNA. באמצעות מסירת DNA בתיווך AAV וצינור אלקטרופורציה של שני תאים, חווינו יעילות גבוהה משמעותית בהשוואה לגישות מסורתיות להחדרת DNA באורך של עד שלושה קילובייט.חשוב גם לציין כי בעוד הדגמנו את השימוש בהליך זה בעוברי חולדות, הוא עשוי להיות מיושם ביעילות על מינים אחרים ליצירת החדרות DNA ממוקדות גם כן.

Research

JoVE Journal

Genetics

CRISPR-Cas9 Genome Editing of Rat Embryos using Adeno-Associated Virus (AAV) and 2-Cell Embryo Electroporation

QTL Mapping and CRISPR/Cas9 Editing to Identify a Drug Resistance Gene in Toxoplasma gondii

QTL Mapping and CRISPR/Cas9 Editing to Identify a Drug Resistance Gene in Toxoplasma gondii

מיפוי QTL ו CRISPR / Cas9 עריכה לזהות ג &#39;ין ההתנגדות התרופה ב<em&gt; Toxoplasma gondii</em

Scientific knowledge is intrinsically linked to available technologies and methods. This article will present two methods that allowed for the ...

Systemic Delivery of MicroRNA Using Recombinant Adeno-associated Virus Serotype 9 to Treat Neuromuscular Diseases in Rodents

משלוח מערכתית של MicroRNA באמצעות וירוס רקומביננטי Adeno-הקשורים Serotype 9 לטיפול מחלות נוירומוסקולריות אצל מכרסמים

RNA interference via the endogenous miRNA pathway regulates gene expression by controlling protein synthesis through post-transcriptional gene silencing. ...

A Standard Methodology to Examine On-site Mutagenicity As a Function of Point Mutation Repair Catalyzed by CRISPR/Cas9 and SsODN in Human Cells

מתודולוגיה סטנדרטי כדי לבדוק באתר המוטגניות כפונקציה של תיקון נקודת מוטציה על ידי CRISPR/Cas9 ו- SsODN בתאי אדם

Combinatorial gene editing using CRISPR/Cas9 and single-stranded oligonucleotides is an effective strategy for the correction of single-base point ...

Microinjection of CRISPR/Cas9 Protein into Channel Catfish, Ictalurus punctatus, Embryos for Gene Editing

Microinjection of CRISPR/Cas9 Protein into Channel Catfish, Ictalurus punctatus, Embryos for Gene Editing

Microinjection CRISPR/Cas9 החלבון לתוך ערוץ שפמנון, Ictalurus punctatus, העוברים עבור ג'ין עריכה

The complete genome of the channel catfish, Ictalurus punctatus, has been sequenced, leading to greater opportunities for studying channel catfish gene ...

CRISPR/Cas9 Gene Editing to Make Conditional Mutants of Human Malaria Parasite P. falciparum

CRISPR/Cas9 Gene Editing to Make Conditional Mutants of Human Malaria Parasite P. falciparum

CRISPR/Cas9 ג'ין עריכה כדי להפוך מותנה מוטציות של בני אדם טפיל המלריה falciparum פ

Malaria is a significant cause of morbidity and mortality worldwide. This disease, which primarily affects those living in tropical and subtropical ...

Genome Editing in Mammalian Cell Lines using CRISPR-Cas

הגנום עריכה בשורות תאים בתרבית של שימוש CRISPR-Cas

The clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) system functions naturally in bacterial adaptive immunity, but has been ...

CRISPR/Cas9 Ribonucleoprotein-mediated Precise Gene Editing by Tube Electroporation

CRISPR/Cas9 ריבונואופפרוטאין-תיווך מדויק לעריכה גנטית על ידי אלקטרופורציה

Gene editing nucleases, represented by CRISPR-associated protein 9 (Cas9), are becoming mainstream tools in biomedical research. Successful delivery of ...

Generation of Defined Genomic Modifications Using CRISPR-CAS9 in Human Pluripotent Stem Cells

הדור של שינויים גנומית מוגדרים באמצעות CRISPR-CAS9 בתאי גזע האדם Pluripotent

Human pluripotent stem cells offer a powerful system to study gene function and model specific mutations relevant to disease. The generation of precise ...

Cell Surface Receptor Identification Using Genome-Scale CRISPR/Cas9 Genetic Screens

זיהוי של פני שטח התא באמצעות הגנום בקנה מידה CRISPR/Cas9 מסכים גנטיים

Intercellular communication mediated by direct interactions between membrane-embedded cell surface receptors is crucial for the normal development and ...

CRISPR-Cas9-Mediated Genome Editing in the Filamentous Ascomycete Huntiella omanensis

CRISPR-Cas9-Mediated Genome Editing in the Filamentous Ascomycete Huntiella omanensis

CRISPR-Cas9-מתווכת עריכת גנום ב- Ascomycete ההאנטילה אומנסיס נימה

The CRISPR-Cas9 genome editing system is a molecular tool that can be used to introduce precise changes into the genomes of model and non-model species ...