Name: Pleins feux sur l’auteur : Dévoilement de la dynamique des signaux mécaniques et biochimiques dans la recherche sur la morphogenèse animale
Uploaded: 2024-01-19T13:55:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Unveiling the Dynamics of Mechanical and Biochemical Signals in Animal Morphogenesis Research at JoVE.com

Nous tenons à remercier la Dre Jennifer A. Zallen d’avoir fourni la lignée de drosophile Sqh-GFP et son soutien pour le développement initial de cette technique, ainsi que le Dr François Schweisguth d’avoir fourni la lignée de drosophile Notch-GFP. Ce travail a été soutenu par un financement de la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (32270809) à H.H.Yu, un généreux soutien financier et personnel de l’École des sciences de la vie, SUSTech, et un financement à Y. Yan de la Commission de l’innovation scientifique et technologique de Shenzhen/JCYJ20200109140201722.

Les expériences ont été menées conformément aux directives et à l’approbation de l’École des sciences de la vie de l’Université SUSTech. L’organisme utilisé est Drosophila melanogaster, et les génotypes sont Notch-Knockin-GFP (chromosome X) et Sqh-sqh-GFP (chromosome II), généreusement fournis par les laboratoires du Dr François Schweisguth (Institut Pasteur) et du Dr Jennifer Zallen (Institut Sloan Kettering), respectivement. Bien que ce protocole se concentre principalement sur les aspects...

Amélioration de la visualisation des protéines grâce à l’imagerie en direct médiée par des anticorps

<ol>
	<li>Coons, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+beginnings+of+immunofluorescence.">The beginnings of immunofluorescence.</a> Journal of Immunology (Baltimore, Md). 87, 499-503 (1961).</li><li>Arthur, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Harnessing+the+power+of+the+antibody.">Harnessing the power of the antibody.</a> The Lancet Respiratory Medicine. 4 (3), 181-182 (2016).</li><li>Im, K., Mareninov, S., Diaz, M. F. P., Yong, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biobanking,+methods+and+protocols.">Biobanking, methods and protocols.</a> Methods in Molecular Biology. 1897, 299-311 (2018).</li><li>Ragkousi, K., Gibson, M. 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R., Zokas, L., Kamps, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monoclonal+antibodies+to+phosphotyrosine.">Monoclonal antibodies to phosphotyrosine.</a> Journal of Immunological Methods. 109 (2), 277-285 (1988).</li><li>Hunter, T., Cooper, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidermal+growth+factor+induces+rapid+tyrosine+phosphorylation+of+proteins+in+A431+human+tumor+cells.">Epidermal growth factor induces rapid tyrosine phosphorylation of proteins in A431 human tumor cells.</a> Cell. 24 (3), 741-752 (1981).</li><li>Yu, H. H., Zallen, J. 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Cette procédure présente la méthode spécialisée de marquage par fluorescence avec des anticorps personnalisés et l’injection subséquente dans des embryons de drosophile à un stade précoce. Cette technique facilite la visualisation en temps réel des protéines ou des modifications post-traductionnelles qui existent en faibles quantités et qui sont généralement difficiles à observer par les méthodes conventionnelles de marquage GFP/mCherry.
Il faut faire preuve de prude...

L’immunofluorescence est une technique fondamentale de la biologie cellulaire moderne développée à l’origine par Albert Coons, qui permet de détecter des molécules dans leurs compartiments cellulaires natifs et de caractériser les compositions moléculaires d’organites ou de machineries subcellulaires1. Couplée à des manipulations génétiques, l’immunofluorescence permet d’établir le concept désormais bien accepté selon lequel la localisation des protéines est essentielle à leur fonction2. Outre les anticorps primaires spécifiques et les colorants fluorescents brillants, le succès de cette technique repose sur un processus préliminaire appelé fixation et perméabilisation, qui préserve les morphologies cellulaires, immobilise les antigènes et augmente l’accessibilité des anticorps dans les compartiments intracellulaires. Inévitablement, le processus de fixation et de perméabilisation tuerait les cellules et mettrait fin à tous les processus biologiques3. Par conséquent, l’immunofluorescence ne fournit que des instantanés du parcours de vie des protéines. Cependant, de nombreux processus biologiques tels que la migration et les divisions cellulaires sont de nature dynamique, ce qui nécessite l’étude des comportements des protéines d’une manière spatio-temporellement résolue 4,5.
Pour étudier la dynamique des protéines dans les organismes vivants, des méthodes d’imagerie en direct basées sur des protéines fluorescentes génétiquement codées telles que la protéine fluorescente verte (GFP)6 et des microscopes confocaux à grande vitesse ont été développées. En bref, la protéine d’intérêt peut être manipulée génétiquement pour être fusionnée avec la GFP7, puis exprimée de manière ectopique à partir de promoteurs viraux ou de levure tels que le cytomégalovirus (CMV)8 ou la séquence d’activation en amont (UAS)9. Étant donné que la GFP est de nature autofluorescente, aucun anticorps couplé à des fluorophores n’est nécessaire pour révéler la localisation des protéines cibles, ce qui contourne la nécessité de processus préliminaires de fixation ou de perméabilisation. Au cours des deux dernières décennies, des marqueurs fluorescents couvrant l’ensemble du spectre des longueurs d’onde ont étédéveloppés10, permettant l’imagerie en direct multicolore de plusieurs protéines cibles en même temps. Cependant, par rapport aux colorants fluorescents chimiquement modifiés tels que AlexaFluor ou ATTO, l’autofluorescence de ces protéines fluorescentes génétiquement codées est relativement faible et instable lorsqu’elle est exprimée à partir de promoteurs endogènes, en particulier lors de l’imagerie en direct sur des échelles de temps plus longues10. Bien que ce déficit puisse être atténué par une surexpression des protéines cibles marquées par fluorescence, beaucoup d’entre elles ayant des activités enzymatiques telles que les kinases et les phosphatases perturbent gravement les processus biologiques normaux si elles ne sont pas exprimées à des niveaux physiologiques.
Ce protocole présente une méthode qui permet l’illumination de la cible photostable à base d’anticorps dans une configuration d’image en direct, permettant essentiellement l’immunofluorescence sans processus de fixation ou de perméabilisation (Figure 1). Grâce à une simple réaction d’amine primaire basée sur le NHS11, on peut conjuguer des colorants fluorescents tels que AlexaFluor 488 ou 594 avec essentiellement n’importe quel anticorps primaire ou GFP/HA/Myc nanobody12. En tirant parti d’une caractéristique de développement selon laquelle toutes les cellules embryonnaires de la drosophile partagent un cytoplasme commun au stade13 du syncytium, il est possible d’obtenir une liaison à l’antigène et une illumination sur des embryons entiers après l’injection d’anticorps conjugués à un colorant. Avec l’expansion des bibliothèques de protéines marquées de manière endogène disponibles chez la drosophile et d’autres systèmes modèles14, cette méthode peut potentiellement élargir les applications de ces bibliothèques en révélant la dynamique des protéines marquées par fluorescence de faible abondance et d’autres protéines non marquées par fluorescence (marquées HA/Myc) dans les tissus vivants.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>&#160;A620014&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 594 Antibody Labeling Kit</td>
			<td>Invitrogen&#160;</td>
			<td>A20185</td>
			<td>Purification column from step 1.6 is included in this kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biological Microscope</td>
			<td>SOPTOP</td>
			<td>EX20</td>
			<td>Eyepiece lens: PL 10X/20. Objective lens: 10x/0.25</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bleach</td>
			<td>Clorox&#174;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate Glass Capillaries</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>TW100F-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5245</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Strainer</td>
			<td>FALCON</td>
			<td>352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Desiccation chamber&#160;</td>
			<td>LOCK&#38;LOCK</td>
			<td>HSM8200</td>
			<td>320ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting Microscope</td>
			<td>Mshot</td>
			<td>MZ62</td>
			<td>Eyepiece lens: WF10X/22mm.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double-sided Tape</td>
			<td>Scotch</td>
			<td>665</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Super Tweezer</td>
			<td>VETUS</td>
			<td>ST-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand&#8482; Cover Glasses: Rectangles</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>12-545F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand&#8482; Superfrost&#8482; Plus Microscope Slides</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>12-550-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forcep</td>
			<td>VETUS</td>
			<td>33A-SA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Halocarbon oil 27</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H8773-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Halocarbon oil 700</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H8898-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heptane</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H2198-1L</td>
			<td>Heptane glue is made of double-sided tape immersed in heptane</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dehydration reagent&#160;</td>
			<td>TOKAI</td>
			<td>1-7315-01</td>
			<td>Fill to 90% volume of the dessication chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manual Micromanipulator</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>M3301R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette puller</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>PUL-1000</td>
			<td>Procedure: step 1, Heat: 290, Force:300, Distance:1.00, Delay:50. 
			Step 2, Heat: 290, Force:300, Distance:2.21, Delay:50&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pneumatic picopump</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>PV 830</td>
			<td>Eject: 20 psi;&#160; Range: 100ms; Duration: timed</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PY20</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>SC-508</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Square petri dishes</td>
			<td>Biosharp</td>
			<td>BS-100-SD</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFP nanobody</td>
			<td>Chromotek</td>
			<td>gt</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualizing low-abundance proteins and post-translational modifications in living drosophila embryos via fluorescent antibody injection

La visualisation des protéines dans les cellules vivantes à l’aide de la GFP (Green Fluorescent Protein) et d’autres marqueurs fluorescents a considérablement amélioré la compréhension de la localisation, de la dynamique et de la fonction des protéines. Par rapport à l’immunofluorescence, l’imagerie en direct reflète plus précisément la localisation des protéines sans artefacts potentiels résultant de la fixation tissulaire. Il est important de noter que l’imagerie en direct permet une caractérisation quantitative et temporelle des niveaux et de la localisation des protéines, ce qui est crucial pour comprendre les processus biologiques dynamiques tels que le mouvement ou la division cellulaire. Cependant, une limitation majeure des approches de marquage fluorescent est la nécessité d’avoir des niveaux d’expression protéique suffisamment élevés pour obtenir une visualisation réussie. Par conséquent, de nombreuses protéines fluorescentes marquées de manière endogène avec des niveaux d’expression relativement faibles ne peuvent pas être détectées. D’autre part, l’expression ectopique à l’aide de promoteurs viraux peut parfois conduire à une mauvaise localisation des protéines ou à des altérations fonctionnelles dans des contextes physiologiques. Pour remédier à ces limitations, une approche est présentée qui utilise la détection de protéines médiées par des anticorps hautement sensibles dans des embryons vivants, effectuant essentiellement une immunofluorescence sans avoir besoin de fixation tissulaire. Comme preuve de principe, le récepteur Notch marqué à la GFP de manière endogène, qui est à peine détectable dans les embryons vivants, peut être visualisé avec succès après l’injection d’anticorps. De plus, cette approche a été adaptée pour visualiser les modifications post-traductionnelles (PTM) dans les embryons vivants, permettant de détecter les changements temporels dans les schémas de phosphorylation de la tyrosine au cours de l’embryogenèse précoce et révélant une nouvelle sous-population de phosphotyrosine (p-Tyr) sous les membranes apicales. Cette approche peut être modifiée pour s’adapter à d’autres anticorps spécifiques à une protéine, à un marqueur ou à un PTM et devrait être compatible avec d’autres organismes modèles ou lignées cellulaires susceptibles d’être injectés. Ce protocole ouvre de nouvelles possibilités pour l’imagerie en direct de protéines de faible abondance ou PTM qui étaient auparavant difficiles à détecter à l’aide des méthodes traditionnelles de marquage par fluorescence.

Immunofluorescence is a cornerstone technique of modern cell biology originally developed by Albert Coons, which enables the detection of molecules at their native cellular compartments and characterization of the molecular compositions of subcellular organelles or machineries1. Coupled with genetic manipulations, immunofluorescence helps establish the now well-accepted concept that protein localization is essential for its function2. Aside from specific primary antibodies and bright fluorescent dyes, the success of this technique relies on a preliminary process named fixation and permeabilization, which preserves cellular morphologies, immobilizes antigens, and increases the accessibility of antibodies into intracellular compartments. Inevitably, the fixation and permeabilization process would kill cells and terminate all biological processes3. Therefore, immunofluorescence only provides snapshots of the life journey of proteins. However, many biological processes such as cell migration and divisions are dynamic in nature, requiring investigation of protein behaviors in a spatial-temporally resolved manner4,5.
To examine protein dynamics in living organisms, live imaging methods based on genetically encoded fluorescent proteins such as green fluorescent protein (GFP)6 and high-speed confocal microscopes have been developed. Briefly, the protein of interest can be genetically manipulated to be fused with GFP7, and then ectopically expressed from viral or yeast promoters such as cytomegalovirus (CMV)8 or upstream activation sequence (UAS)9. Because GFP is autofluorescent in nature, no fluorophore-coupled antibodies are required to reveal the localization of target proteins, which bypasses the necessity of preliminary processes of fixation or permeabilization. Over the last two decades, fluorescent tags spanning the whole spectrum of wavelength have been developed10, enabling multi-color live imaging of several target proteins at the same time. However, compared to chemically engineered fluorescent dyes such as AlexaFluor or ATTO, the autofluorescence of these genetically encoded fluorescent proteins is relatively weak and unstable when expressed from endogenous promoters, especially during live imaging over longer time scales10. While this shortfall can be mitigated by over-expressing fluorescently tagged target proteins, many with enzymatic activities such as kinases and phosphatases severely disrupt normal biological processes if not expressed at physiological levels.
This protocol presents a method that enables photostable antibody-based target illumination in a live image setup, essentially allowing immunofluorescence without the process of fixation or permeabilization (Figure 1). Through a simple NHS-based primary amine reaction11, one can conjugate fluorescent dyes such as AlexaFluor 488 or 594 with essentially any primary antibody or GFP/HA/Myc nanobody12. Taking advantage of a developmental feature that all Drosophila embryonic cells share a common cytoplasm during the syncytium stage13, one can achieve antigen binding and illumination across entire embryos after the injection of dye-conjugated antibodies. With expanding libraries of endogenously tagged proteins available in Drosophila and other model systems14, this method can potentially broaden applications of these libraries by revealing dynamics of low-abundance fluorescently tagged proteins and other non-fluorescently tagged (HA/Myc-tagged) proteins in living tissues.

Pleins feux sur l’auteur : Dévoilement de la dynamique des signaux mécaniques et biochimiques dans la recherche sur la morphogenèse animale 

Visualisation des protéines de faible abondance et des modifications post-traductionnelles dans des embryons de drosophile vivants par injection d’anticorps fluorescents

We aim to understand how mechanical and biochemical signals correlate animal morphogenesis, including the detection and the response to forces by cells and molecules. More molecules have been discovered to be mechanosensitive, functioning differently under varying levels of tension. However, the physiological context and the function of these force-sensitive events remain largely unknown.Due to the dynamic nature of force-sensitive events, our field largely relies on high-speed fluorescence imaging and time-lapse recording to capture molecular and cellular behaviors. Many fluorescently-tagged proteins are not bright enough to be imaged, and it requires spatial-temporal resolution without significant bleach. On the other hand, traditional immunofluorescence methods can only capture a snapshot of molecular and cellular fixture after fixation.This method paves the way to dynamically track the localization of many low-abundance protein receptors of major signaling pathways, such as Notch, Wnt, and the BMP pathways. Eventually, in addition to the traditional linear signaling cascades, we can pinpoint and where the signaling events occur at the subcellular scales.

Pour démontrer les avantages de la méthode d’injection d’anticorps par rapport à l’imagerie en direct ou à l’immunofluorescence à base de marqueurs fluorescents, deux études de cas sont fournies qui caractérisent la localisation dynamique d’un récepteur transmembranaire de faible abondance, Notch, et un type de modification post-traductionnelle appelée phosphorylation de la tyrosine dans des embryons vivants.
L’activité de signalisation de l’encoche joue un rôle majeur...

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Ce protocole décrit le marquage et l’injection par fluorescence personnalisés à base d’anticorps dans les embryons précoces de drosophile pour permettre l’imagerie en direct de protéines de faible abondance ou de modifications post-traductionnelles difficiles à détecter à l’aide des approches traditionnelles GFP/mCherry-tag.

Visualization of proteins in living cells using GFP (Green Fluorescent Protein) and other fluorescent tags has greatly improved understanding of protein ...

Nous cherchons à comprendre comment les signaux mécaniques et biochimiques sont corrélés à la morphogenèse animale, y compris la détection et la réponse aux forces par les cellules et les molécules. D’autres molécules se sont révélées mécanosensibles, fonctionnant différemment sous différents niveaux de tension. Cependant, le contexte physiologique et la fonction de ces événements sensibles à la force restent largement inconnus.En raison de la nature dynamique des événements sensibles à la force, notre domaine repose en grande partie sur l’imagerie par fluorescence à grande vitesse et l’enregistrement en accéléré pour capturer les comportements moléculaires et cellulaires. De nombreuses protéines marquées par fluorescence ne sont pas assez brillantes pour être imagées, et cela nécessite une résolution spatio-temporelle sans blanchiment significatif. D’autre part, les méthodes traditionnelles d’immunofluorescence ne peuvent capturer qu’un instantané de l’appareil moléculaire et cellulaire après fixation.Cette méthode ouvre la voie au suivi dynamique de la localisation de nombreux récepteurs protéiques de faible abondance des principales voies de signalisation, telles que Notch, Wnt et les voies BMP. Finalement, en plus des cascades de signalisation linéaires traditionnelles, nous pouvons localiser et où les événements de signalisation se produisent à l’échelle subcellulaire.

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Visualizing Low-Abundance Proteins and Post-Translational Modifications in Living Drosophila Embryos via Fluorescent Antibody Injection

Visualization of proteins in living cells using GFP (Green Fluorescent Protein) and other fluorescent tags has greatly improved understanding of protein localization, dynamics, and function. Compared to immunofluorescence, live imaging more accurately reflects protein localization without potential artifacts arising from tissue fixation. Importantly, live imaging enables quantitative and temporal characterization of protein levels and localization, crucial for understanding dynamic biological processes such as cell movement or division. However, a major limitation of fluorescent tagging approaches is the need for sufficiently high protein expression levels to achieve successful visualization. Consequently, many endogenously tagged fluorescent proteins with relatively low expression levels cannot be detected. On the other hand, ectopic expression using viral promoters can sometimes lead to protein mislocalization or functional alterations in physiological contexts. To address these limitations, an approach is presented that utilizes highly sensitive antibody-mediated protein detection in living embryos, essentially performing immunofluorescence without the need for tissue fixation. As proof of principle, endogenously GFP-tagged Notch receptor that is barely detectable&#160;in living embryos can be successfully visualized after antibody injection. Furthermore, this approach was adapted to visualize post-translational modifications (PTMs) in living embryos, allowing the detection of temporal changes in tyrosine phosphorylation patterns during early embryogenesis and revealing a novel subpopulation of phosphotyrosine (p-Tyr) underneath apical membranes. This approach can be modified to accommodate other protein-specific, tag-specific, or PTM-specific antibodies and should be compatible with other injection-amenable model organisms or cell lines. This protocol opens new possibilities for live imaging of low-abundance proteins or PTMs that were previously challenging to detect using traditional fluorescent tagging methods.

This protocol describes the customized antibody-based fluorescence labeling and injection into early Drosophila embryos to enable live imaging of low-abundance proteins or post-translational modifications that are challenging to detect using traditional GFP/mCherry-tag approaches.