Name: Autor im Rampenlicht: Enthüllung der Dynamik mechanischer und biochemischer Signale in der Morphogeneseforschung an Tieren
Uploaded: 2024-01-19T13:55:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Unveiling the Dynamics of Mechanical and Biochemical Signals in Animal Morphogenesis Research at JoVE.com

Wir danken Dr. Jennifer A. Zallen für die Bereitstellung der Sqh-GFP Drosophila-Linie und die Unterstützung bei der ersten Entwicklung dieser Technik sowie Dr. Francois Schweisguth für die Bereitstellung der Notch-GFP Drosophila-Linie . Diese Arbeit wurde von der National Natural Science Foundation of China (32270809) an S.H.Yu, großzügiger finanzieller und personeller Unterstützung von der School of Life Sciences, SUSTech, und von Y. Yan von der Shenzhen Science and Technology Innovation Commission/JCYJ20200109140201722 unterstützt.

Die Experimente wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien und Genehmigungen der School of Life Sciences der SUSTech University durchgeführt. Der verwendete Organismus ist Drosophila melanogaster, und die Genotypen sind Notch-Knockin-GFP (Chromosom X) und Sqh-sqh-GFP (Chromosom II), die großzügigerweise von den Labors von Dr. François Schweisguth (Institut Pasteur) bzw. Dr. Jennifer Zallen (Sloan Kettering Institute) zur Verfügung gestellt wurden. Während sich dieses Protokoll hauptsächlich auf Aspekt...

Verbesserung der Proteinvisualisierung mit Antikörper-vermittelter Live-Bildgebung

<ol>
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Dieses vorgestellte Verfahren beschreibt die spezielle Methode der Fluoreszenzmarkierung mit maßgeschneiderten Antikörpern und der anschließenden Injektion in Drosophila-Embryonen im Frühstadium. Diese Technik ermöglicht die Echtzeit-Visualisierung von Proteinen oder posttranslationalen Modifikationen, die in geringen Mengen vorliegen und mit herkömmlichen GFP/mCherry-Markierungsmethoden typischerweise nur schwer zu beobachten sind.
Vorsicht ist geboten, wenn diese Methode erwei...

Die Immunfluoreszenz ist eine Grundtechnik der modernen Zellbiologie, die ursprünglich von Albert Coons entwickelt wurde und die Detektion von Molekülen in ihren nativen zellulären Kompartimenten und die Charakterisierung der molekularen Zusammensetzung von subzellulären Organellen oder Maschinen ermöglicht1. In Verbindung mit genetischen Manipulationen trägt die Immunfluoreszenz dazu bei, das heute allgemein akzeptierte Konzept zu etablieren, dass die Lokalisierung von Proteinen für ihre Funktion unerlässlich ist2. Abgesehen von spezifischen Primärantikörpern und hellen Fluoreszenzfarbstoffen beruht der Erfolg dieser Technik auf einem vorläufigen Prozess namens Fixierung und Permeabilisierung, der zelluläre Morphologien bewahrt, Antigene immobilisiert und die Zugänglichkeit von Antikörpern in intrazelluläre Kompartimente erhöht. Der Fixierungs- und Permeabilisierungsprozess würde unweigerlich Zellen abtöten und alle biologischen Prozesse beenden3. Daher liefert die Immunfluoreszenz nur Momentaufnahmen des Lebenswegs von Proteinen. Viele biologische Prozesse, wie z.B. Zellmigration und Zellteilungen, sind jedoch dynamischer Natur und erfordern eine räumlich-zeitlich aufgelöste Untersuchung des Verhaltens von Proteinen 4,5.
Um die Proteindynamik in lebenden Organismen zu untersuchen, wurden Live-Imaging-Methoden entwickelt, die auf genetisch kodierten fluoreszierenden Proteinen wie dem grün fluoreszierenden Protein (GFP)6 basieren, und konfokale Hochgeschwindigkeitsmikroskope. Kurz gesagt, das interessierende Protein kann genetisch so manipuliert werden, dass es mit GFP7 fusioniert wird, und dann ektopisch aus viralen oder Hefepromotoren wie dem Cytomegalievirus (CMV)8 oder der Upstream-Aktivierungssequenz (UAS)9 exprimiert werden. Da GFP von Natur aus autofluoreszierend ist, sind keine Fluorophor-gekoppelten Antikörper erforderlich, um die Lokalisierung von Zielproteinen aufzudecken, wodurch die Notwendigkeit vorbereitender Prozesse der Fixierung oder Permeabilisierung umgangen wird. In den letzten zwei Jahrzehnten wurden fluoreszierende Markierungen entwickelt, die das gesamte Wellenlängenspektrum abdecken10 und eine mehrfarbige Live-Bildgebung mehrerer Zielproteine gleichzeitig ermöglichen. Im Vergleich zu chemisch hergestellten Fluoreszenzfarbstoffen wie AlexaFluor oder ATTO ist die Autofluoreszenz dieser genetisch kodierten fluoreszierenden Proteine jedoch relativ schwach und instabil, wenn sie von endogenen Promotoren exprimiert werden, insbesondere während der Live-Bildgebung über längere Zeitskalen10. Während dieses Defizit durch die Überexpression fluoreszenzmarkierter Zielproteine gemildert werden kann, stören viele mit enzymatischen Aktivitäten wie Kinasen und Phosphatasen normale biologische Prozesse erheblich, wenn sie nicht auf physiologischem Niveau exprimiert werden.
Dieses Protokoll stellt eine Methode dar, die eine photostabile antikörperbasierte Zielbeleuchtung in einem Live-Bildaufbau ermöglicht, die im Wesentlichen Immunfluoreszenz ohne den Prozess der Fixierung oder Permeabilisierung ermöglicht (Abbildung 1). Durch eine einfache NHS-basierte primäre Aminreaktion11 kann man Fluoreszenzfarbstoffe wie AlexaFluor 488 oder 594 mit im Wesentlichen jedem primären Antikörper oder GFP/HA/Myc-Nanobody12 konjugieren. Unter Ausnutzung eines Entwicklungsmerkmals, dass alle embryonalen Zellen von Drosophila während des Synzytiumstadiums13 ein gemeinsames Zytoplasma teilen, kann man nach der Injektion von farbstoffkonjugierten Antikörpern eine Antigenbindung und Beleuchtung über ganze Embryonen erreichen. Mit der Erweiterung von Bibliotheken endogen markierter Proteine, die in Drosophila und anderen Modellsystemen verfügbar sind14, kann diese Methode die Anwendungen dieser Bibliotheken möglicherweise erweitern, indem sie die Dynamik von fluoreszenzmarkierten Proteinen mit geringer Häufigkeit und anderen nicht-fluoreszenzmarkierten Proteinen (HA/Myc-markierten) Proteinen in lebenden Geweben aufdeckt.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>&#160;A620014&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 594 Antibody Labeling Kit</td>
			<td>Invitrogen&#160;</td>
			<td>A20185</td>
			<td>Purification column from step 1.6 is included in this kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biological Microscope</td>
			<td>SOPTOP</td>
			<td>EX20</td>
			<td>Eyepiece lens: PL 10X/20. Objective lens: 10x/0.25</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bleach</td>
			<td>Clorox&#174;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate Glass Capillaries</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>TW100F-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5245</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Strainer</td>
			<td>FALCON</td>
			<td>352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Desiccation chamber&#160;</td>
			<td>LOCK&#38;LOCK</td>
			<td>HSM8200</td>
			<td>320ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting Microscope</td>
			<td>Mshot</td>
			<td>MZ62</td>
			<td>Eyepiece lens: WF10X/22mm.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double-sided Tape</td>
			<td>Scotch</td>
			<td>665</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Super Tweezer</td>
			<td>VETUS</td>
			<td>ST-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand&#8482; Cover Glasses: Rectangles</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>12-545F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand&#8482; Superfrost&#8482; Plus Microscope Slides</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>12-550-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forcep</td>
			<td>VETUS</td>
			<td>33A-SA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Halocarbon oil 27</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H8773-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Halocarbon oil 700</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H8898-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heptane</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H2198-1L</td>
			<td>Heptane glue is made of double-sided tape immersed in heptane</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dehydration reagent&#160;</td>
			<td>TOKAI</td>
			<td>1-7315-01</td>
			<td>Fill to 90% volume of the dessication chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manual Micromanipulator</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>M3301R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette puller</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>PUL-1000</td>
			<td>Procedure: step 1, Heat: 290, Force:300, Distance:1.00, Delay:50. 
			Step 2, Heat: 290, Force:300, Distance:2.21, Delay:50&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pneumatic picopump</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>PV 830</td>
			<td>Eject: 20 psi;&#160; Range: 100ms; Duration: timed</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PY20</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>SC-508</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Square petri dishes</td>
			<td>Biosharp</td>
			<td>BS-100-SD</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFP nanobody</td>
			<td>Chromotek</td>
			<td>gt</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualizing low-abundance proteins and post-translational modifications in living drosophila embryos via fluorescent antibody injection

Die Visualisierung von Proteinen in lebenden Zellen mit GFP (Green Fluorescent Protein) und anderen fluoreszierenden Markierungen hat das Verständnis der Lokalisierung, Dynamik und Funktion von Proteinen erheblich verbessert. Im Vergleich zur Immunfluoreszenz spiegelt die Live-Bildgebung die Proteinlokalisierung genauer wider, ohne dass potenzielle Artefakte durch die Gewebefixierung entstehen. Wichtig ist, dass die Live-Bildgebung eine quantitative und zeitliche Charakterisierung von Proteinspiegeln und -lokalisierungen ermöglicht, was für das Verständnis dynamischer biologischer Prozesse wie Zellbewegung oder -teilung entscheidend ist. Eine wesentliche Einschränkung von Fluoreszenz-Markierungsansätzen ist jedoch die Notwendigkeit einer ausreichend hohen Proteinexpression, um eine erfolgreiche Visualisierung zu erreichen. Folglich können viele endogen markierte fluoreszierende Proteine mit relativ geringer Expression nicht nachgewiesen werden. Auf der anderen Seite kann die ektopische Expression mit viralen Promotoren manchmal zu Proteinfehllokalisationen oder funktionellen Veränderungen in physiologischen Kontexten führen. Um diese Einschränkungen zu adressieren, wird ein Ansatz vorgestellt, der einen hochempfindlichen Antikörper-vermittelten Proteinnachweis in lebenden Embryonen verwendet, der im Wesentlichen Immunfluoreszenz ohne Gewebefixierung durchführt. Als Proof of Principle kann ein endogen GFP-markierter Notch-Rezeptor, der in lebenden Embryonen kaum nachweisbar ist, nach Antikörperinjektion erfolgreich sichtbar gemacht werden. Darüber hinaus wurde dieser Ansatz angepasst, um posttranslationale Modifikationen (PTMs) in lebenden Embryonen sichtbar zu machen, was die Detektion zeitlicher Veränderungen der Tyrosinphosphorylierungsmuster während der frühen Embryogenese ermöglicht und eine neue Subpopulation von Phosphotyrosin (p-Tyr) unter apikalen Membranen aufdeckt. Dieser Ansatz kann modifiziert werden, um andere proteinspezifische, tagspezifische oder PTM-spezifische Antikörper aufzunehmen, und sollte mit anderen injektionsfähigen Modellorganismen oder Zelllinien kompatibel sein. Dieses Protokoll eröffnet neue Möglichkeiten für die Live-Bildgebung von Proteinen mit geringer Häufigkeit oder PTMs, die bisher mit herkömmlichen Fluoreszenz-Markierungsmethoden nur schwer zu erkennen waren.

Immunofluorescence is a cornerstone technique of modern cell biology originally developed by Albert Coons, which enables the detection of molecules at their native cellular compartments and characterization of the molecular compositions of subcellular organelles or machineries1. Coupled with genetic manipulations, immunofluorescence helps establish the now well-accepted concept that protein localization is essential for its function2. Aside from specific primary antibodies and bright fluorescent dyes, the success of this technique relies on a preliminary process named fixation and permeabilization, which preserves cellular morphologies, immobilizes antigens, and increases the accessibility of antibodies into intracellular compartments. Inevitably, the fixation and permeabilization process would kill cells and terminate all biological processes3. Therefore, immunofluorescence only provides snapshots of the life journey of proteins. However, many biological processes such as cell migration and divisions are dynamic in nature, requiring investigation of protein behaviors in a spatial-temporally resolved manner4,5.
To examine protein dynamics in living organisms, live imaging methods based on genetically encoded fluorescent proteins such as green fluorescent protein (GFP)6 and high-speed confocal microscopes have been developed. Briefly, the protein of interest can be genetically manipulated to be fused with GFP7, and then ectopically expressed from viral or yeast promoters such as cytomegalovirus (CMV)8 or upstream activation sequence (UAS)9. Because GFP is autofluorescent in nature, no fluorophore-coupled antibodies are required to reveal the localization of target proteins, which bypasses the necessity of preliminary processes of fixation or permeabilization. Over the last two decades, fluorescent tags spanning the whole spectrum of wavelength have been developed10, enabling multi-color live imaging of several target proteins at the same time. However, compared to chemically engineered fluorescent dyes such as AlexaFluor or ATTO, the autofluorescence of these genetically encoded fluorescent proteins is relatively weak and unstable when expressed from endogenous promoters, especially during live imaging over longer time scales10. While this shortfall can be mitigated by over-expressing fluorescently tagged target proteins, many with enzymatic activities such as kinases and phosphatases severely disrupt normal biological processes if not expressed at physiological levels.
This protocol presents a method that enables photostable antibody-based target illumination in a live image setup, essentially allowing immunofluorescence without the process of fixation or permeabilization (Figure 1). Through a simple NHS-based primary amine reaction11, one can conjugate fluorescent dyes such as AlexaFluor 488 or 594 with essentially any primary antibody or GFP/HA/Myc nanobody12. Taking advantage of a developmental feature that all Drosophila embryonic cells share a common cytoplasm during the syncytium stage13, one can achieve antigen binding and illumination across entire embryos after the injection of dye-conjugated antibodies. With expanding libraries of endogenously tagged proteins available in Drosophila and other model systems14, this method can potentially broaden applications of these libraries by revealing dynamics of low-abundance fluorescently tagged proteins and other non-fluorescently tagged (HA/Myc-tagged) proteins in living tissues.

Autor im Rampenlicht: Enthüllung der Dynamik mechanischer und biochemischer Signale in der Morphogeneseforschung an Tieren 

Visualisierung von Proteinen mit geringer Häufigkeit und posttranslationalen Modifikationen in lebenden Drosophila-Embryonen mittels Fluoreszenz-Antikörper-Injektion

We aim to understand how mechanical and biochemical signals correlate animal morphogenesis, including the detection and the response to forces by cells and molecules. More molecules have been discovered to be mechanosensitive, functioning differently under varying levels of tension. However, the physiological context and the function of these force-sensitive events remain largely unknown.Due to the dynamic nature of force-sensitive events, our field largely relies on high-speed fluorescence imaging and time-lapse recording to capture molecular and cellular behaviors. Many fluorescently-tagged proteins are not bright enough to be imaged, and it requires spatial-temporal resolution without significant bleach. On the other hand, traditional immunofluorescence methods can only capture a snapshot of molecular and cellular fixture after fixation.This method paves the way to dynamically track the localization of many low-abundance protein receptors of major signaling pathways, such as Notch, Wnt, and the BMP pathways. Eventually, in addition to the traditional linear signaling cascades, we can pinpoint and where the signaling events occur at the subcellular scales.

Um die Vorteile der Antikörper-Injektionsmethode gegenüber der Fluoreszenz-Tag-basierten Live-Bildgebung oder Immunfluoreszenz zu demonstrieren, werden zwei Fallstudien vorgestellt, die die dynamische Lokalisierung eines Transmembranrezeptors mit geringer Häufigkeit, Notch, und eine Art posttranslationaler Modifikation, die als Tyrosinphosphorylierung bezeichnet wird, in lebenden Embryonen charakterisieren.
Die Notch-Signalaktivität spielt eine wichtige Rolle bei der Bestimmung des Zellsch...

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Dieses Protokoll beschreibt die maßgeschneiderte antikörperbasierte Fluoreszenzmarkierung und Injektion in frühe Drosophila-Embryonen , um Live-Imaging von Proteinen mit geringer Häufigkeit oder posttranslationalen Modifikationen zu ermöglichen, die mit herkömmlichen GFP/mCherry-Tag-Ansätzen nur schwer zu erkennen sind.

Visualization of proteins in living cells using GFP (Green Fluorescent Protein) and other fluorescent tags has greatly improved understanding of protein ...

Unser Ziel ist es, zu verstehen, wie mechanische und biochemische Signale die Morphogenese von Tieren korrelieren, einschließlich der Erkennung und Reaktion auf Kräfte durch Zellen und Moleküle. Es wurden weitere Moleküle entdeckt, die mechanosensitiv sind und unter unterschiedlichen Spannungsniveaus unterschiedlich funktionieren. Der physiologische Kontext und die Funktion dieser kraftsensitiven Ereignisse sind jedoch noch weitgehend unbekannt.Aufgrund der dynamischen Natur kraftsensitiver Ereignisse stützt sich unser Feld weitgehend auf Hochgeschwindigkeits-Fluoreszenzbildgebung und Zeitrafferaufnahmen, um molekulares und zelluläres Verhalten zu erfassen. Viele fluoreszenzmarkierte Proteine sind nicht hell genug, um abgebildet zu werden, und es erfordert eine räumliche und zeitliche Auflösung ohne signifikante Bleichmittel. Auf der anderen Seite können herkömmliche Immunfluoreszenzmethoden nach der Fixierung nur eine Momentaufnahme der molekularen und zellulären Fixierung erfassen.Diese Methode ebnet den Weg, um die Lokalisation vieler Proteinrezeptoren mit geringer Häufigkeit wichtiger Signalwege wie Notch, Wnt und der BMP-Signalwege dynamisch zu verfolgen. Schließlich können wir zusätzlich zu den traditionellen linearen Signalkaskaden genau bestimmen, wo die Signalereignisse auf den subzellulären Skalen auftreten.

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Visualizing Low-Abundance Proteins and Post-Translational Modifications in Living Drosophila Embryos via Fluorescent Antibody Injection

Visualization of proteins in living cells using GFP (Green Fluorescent Protein) and other fluorescent tags has greatly improved understanding of protein localization, dynamics, and function. Compared to immunofluorescence, live imaging more accurately reflects protein localization without potential artifacts arising from tissue fixation. Importantly, live imaging enables quantitative and temporal characterization of protein levels and localization, crucial for understanding dynamic biological processes such as cell movement or division. However, a major limitation of fluorescent tagging approaches is the need for sufficiently high protein expression levels to achieve successful visualization. Consequently, many endogenously tagged fluorescent proteins with relatively low expression levels cannot be detected. On the other hand, ectopic expression using viral promoters can sometimes lead to protein mislocalization or functional alterations in physiological contexts. To address these limitations, an approach is presented that utilizes highly sensitive antibody-mediated protein detection in living embryos, essentially performing immunofluorescence without the need for tissue fixation. As proof of principle, endogenously GFP-tagged Notch receptor that is barely detectable&#160;in living embryos can be successfully visualized after antibody injection. Furthermore, this approach was adapted to visualize post-translational modifications (PTMs) in living embryos, allowing the detection of temporal changes in tyrosine phosphorylation patterns during early embryogenesis and revealing a novel subpopulation of phosphotyrosine (p-Tyr) underneath apical membranes. This approach can be modified to accommodate other protein-specific, tag-specific, or PTM-specific antibodies and should be compatible with other injection-amenable model organisms or cell lines. This protocol opens new possibilities for live imaging of low-abundance proteins or PTMs that were previously challenging to detect using traditional fluorescent tagging methods.

This protocol describes the customized antibody-based fluorescence labeling and injection into early Drosophila embryos to enable live imaging of low-abundance proteins or post-translational modifications that are challenging to detect using traditional GFP/mCherry-tag approaches.