Name: 著者スポットライト:動物の形態形成研究における機械的および生化学的シグナルのダイナミクスの解明
Uploaded: 2024-01-19T13:55:00
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Sqh-GFP ショウジョウバエ ラインを提供し、この技術の初期開発を支援してくださったJennifer A. Zallen博士と、Notch-GFPショウ ジョウバエ ラインを提供してくれたFrancois Schweisguth博士に感謝します。この研究は、中国国家自然科学基金会(32270809)からH.H.Yuへの資金提供、SUSTech生命科学院からの寛大な財政的およびスタッフ的支援、および深セン科学技術イノベーション委員会/JCYJ20200109140201722からのY. Yanへの資金提供によって支援されました。

実験は、SUSTech University生命科学部のガイドラインと承認に従って行われました。使用される生物はショウジョウバエ(Drosophila melanogaster)で、遺伝子型はNotch-Knockin-GFP(染色体X)とSqh-sqh-GFP(染色体II)で、それぞれフランソワ・シュヴァイスグース博士(パスツール研究所)とジェニファー・ザレン博士(スローン・ケタリング研究所)の研究室から寛大に提供されました。このプロトコルが抗体の...

抗体媒介ライブイメージングによるタンパク質可視化の強化

<ol>
	<li>Coons, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+beginnings+of+immunofluorescence.">The beginnings of immunofluorescence.</a> Journal of Immunology (Baltimore, Md). 87, 499-503 (1961).</li><li>Arthur, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Harnessing+the+power+of+the+antibody.">Harnessing the power of the antibody.</a> The Lancet Respiratory Medicine. 4 (3), 181-182 (2016).</li><li>Im, K., Mareninov, S., Diaz, M. F. P., Yong, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biobanking,+methods+and+protocols.">Biobanking, methods and protocols.</a> Methods in Molecular Biology. 1897, 299-311 (2018).</li><li>Ragkousi, K., Gibson, M. 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G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+interactions+between+the+protein+products+of+the+neurogenic+loci+Notch+and+Delta,+two+EGF-homologous+genes+in+Drosophila.">Molecular interactions between the protein products of the neurogenic loci Notch and Delta, two EGF-homologous genes in Drosophila.</a> Cell. 61 (3), 523-534 (1990).</li><li>Struhl, G., Greenwald, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presenilin+is+required+for+activity+and+nuclear+access+of+Notch+in+Drosophila.">Presenilin is required for activity and nuclear access of Notch in Drosophila.</a> Nature. 398 (6727), 522-525 (1999).</li><li>Henrique, D., Schweisguth, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+Notch+signaling:+a+simple+logic+deployed+in+time+and+space.">Mechanisms of Notch signaling: a simple logic deployed in time and space.</a> Development. 146 (3), dev172148 (2019).</li><li>Trylinski, M., Mazouni, K., Schweisguth, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intra-lineage+fate+decisions+involve+of+notch+receptors+basal+to+the+midbody+in+drosophila+sensory+organ+precursor+cells.">Intra-lineage fate decisions involve of notch receptors basal to the midbody in drosophila sensory organ precursor cells.</a> Current Biology. 27 (15), 2239.e3-2247.e3 (2017).</li><li>Hunter, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+kinases+and+phosphatases:+The+Yin+and+Yang+of+protein+phosphorylation+and+signaling.">Protein kinases and phosphatases: The Yin and Yang of protein phosphorylation and signaling.</a> Cell. 80 (2), 225-236 (1995).</li><li>Glenney, J. R., Zokas, L., Kamps, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monoclonal+antibodies+to+phosphotyrosine.">Monoclonal antibodies to phosphotyrosine.</a> Journal of Immunological Methods. 109 (2), 277-285 (1988).</li><li>Hunter, T., Cooper, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidermal+growth+factor+induces+rapid+tyrosine+phosphorylation+of+proteins+in+A431+human+tumor+cells.">Epidermal growth factor induces rapid tyrosine phosphorylation of proteins in A431 human tumor cells.</a> Cell. 24 (3), 741-752 (1981).</li><li>Yu, H. H., Zallen, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Abl+and+Canoe/Afadin+mediate+mechanotransduction+at+tricellular+junctions.">Abl and Canoe/Afadin mediate mechanotransduction at tricellular junctions.</a> Science. 370 (6520), eaba5528 (2020).</li><li>Martin, A. C., Kaschube, M., Wieschaus, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pulsed+contractions+of+an+actin&#8211;myosin+network+drive+apical+constriction.">Pulsed contractions of an actin&#8211;myosin network drive apical constriction.</a> Nature. 457 (7228), 495-499 (2009).</li></ol>

この手順では、カスタム抗体による蛍光標識と、その後の初期段階の ショウジョウバエ 胚への注入の特殊な方法の概要を説明します。この手法により、従来のGFP/mCherryタグ法では観察が困難な少量のタンパク質や翻訳後修飾をリアルタイムで可視化することができます。
この方法を拡張して野生型胚と変異胚の定量的比較を行う場合は注意が必要です。一次抗体?...

免疫蛍光法は、アルバート・クーンズによって最初に開発された現代細胞生物学の基礎技術であり、天然の細胞区画で分子を検出し、細胞内オルガネラまたは機械の分子組成の特性評価を可能にします1。遺伝子操作と相まって、免疫蛍光法は、タンパク質の局在化がその機能に不可欠であるという、現在広く受け入れられている概念の確立に役立ちます2。この技術の成功は、特異的な一次抗体と明るい蛍光色素の他に、細胞形態を維持し、抗原を固定化し、細胞内コンパートメントへの抗体のアクセス性を高める固定および透過化という予備プロセスに依存しています。必然的に、固定と透過のプロセスは細胞を殺し、すべての生物学的プロセスを終了させます3。したがって、免疫蛍光法は、タンパク質のライフジャーニーのスナップショットを提供するだけです。しかし、細胞の遊走や分裂などの多くの生物学的プロセスは本質的に動的であり、時空間的に分解された方法でタンパク質の挙動を調べる必要があります4,5。
生体内の蛋白質動態を調べるために、緑色蛍光蛋白質(GFP)6 などの遺伝子にコードされた蛍光蛋白質を用いたライブイメージング法や高速共焦点顕微鏡が開発されています。簡単に説明すると、目的のタンパク質を遺伝子操作してGFP7と融合させ、サイトメガロウイルス(CMV)8 や上流活性化配列(UAS)9などのウイルスまたは酵母のプロモーターから異所的に発現させることができます。GFPは本質的に自家蛍光であるため、標的タンパク質の局在を明らかにするために蛍光色素結合抗体は必要なく、固定または透過処理の予備プロセスの必要性を回避します。過去20年間で、波長の全スペクトルにわたる蛍光タグが開発され10、複数の標的タンパク質のマルチカラーライブイメージングを同時に可能にしました。しかし、AlexaFluorやATTOなどの化学的に操作された蛍光色素と比較して、これらの遺伝的にコードされた蛍光タンパク質の自家蛍光は、内因性プロモーターから発現する場合、特により長い時間スケールにわたるライブイメージング中に、比較的弱く不安定である10。この不足は、蛍光タグ付き標的タンパク質を過剰発現させることで軽減できますが、キナーゼやホスファターゼなどの酵素活性を持つ多くは、生理学的レベルで発現しない場合、正常な生物学的プロセスを著しく破壊します。
このプロトコルは、ライブ画像セットアップで光安定性抗体ベースのターゲット照明を可能にする方法を示しており、固定または透過処理のプロセスなしで本質的に免疫蛍光を可能にします(図1)。単純なNHSベースの第一級アミン反応11により、AlexaFluor 488や594などの蛍光色素を、基本的に任意の一次抗体またはGFP/HA/Mycナノボディ12と結合させることができます。ショウ ジョウバエ の胚細胞は合胞体期13で共通の細胞質を共有するという発生上の特徴を利用して、色素標識抗体の注入後、胚全体にわたる抗原結合と照明を達成することができます。ショウ ジョウバエ やその他のモデル系で利用可能な内因性タグ付きタンパク質のライブラリが拡大しているため14、この方法は、生体組織における少量の蛍光タグ付きタンパク質およびその他の非蛍光タグ付き(HA / Mycタグ付き)タンパク質のダイナミクスを明らかにすることにより、これらのライブラリのアプリケーションを潜在的に広げることができます。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>&#160;A620014&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 594 Antibody Labeling Kit</td>
			<td>Invitrogen&#160;</td>
			<td>A20185</td>
			<td>Purification column from step 1.6 is included in this kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biological Microscope</td>
			<td>SOPTOP</td>
			<td>EX20</td>
			<td>Eyepiece lens: PL 10X/20. Objective lens: 10x/0.25</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bleach</td>
			<td>Clorox&#174;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate Glass Capillaries</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>TW100F-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5245</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Strainer</td>
			<td>FALCON</td>
			<td>352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Desiccation chamber&#160;</td>
			<td>LOCK&#38;LOCK</td>
			<td>HSM8200</td>
			<td>320ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting Microscope</td>
			<td>Mshot</td>
			<td>MZ62</td>
			<td>Eyepiece lens: WF10X/22mm.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double-sided Tape</td>
			<td>Scotch</td>
			<td>665</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Super Tweezer</td>
			<td>VETUS</td>
			<td>ST-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand&#8482; Cover Glasses: Rectangles</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>12-545F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand&#8482; Superfrost&#8482; Plus Microscope Slides</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>12-550-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forcep</td>
			<td>VETUS</td>
			<td>33A-SA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Halocarbon oil 27</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H8773-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Halocarbon oil 700</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H8898-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heptane</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H2198-1L</td>
			<td>Heptane glue is made of double-sided tape immersed in heptane</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dehydration reagent&#160;</td>
			<td>TOKAI</td>
			<td>1-7315-01</td>
			<td>Fill to 90% volume of the dessication chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manual Micromanipulator</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>M3301R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette puller</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>PUL-1000</td>
			<td>Procedure: step 1, Heat: 290, Force:300, Distance:1.00, Delay:50. 
			Step 2, Heat: 290, Force:300, Distance:2.21, Delay:50&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pneumatic picopump</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>PV 830</td>
			<td>Eject: 20 psi;&#160; Range: 100ms; Duration: timed</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PY20</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>SC-508</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Square petri dishes</td>
			<td>Biosharp</td>
			<td>BS-100-SD</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFP nanobody</td>
			<td>Chromotek</td>
			<td>gt</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualizing low-abundance proteins and post-translational modifications in living drosophila embryos via fluorescent antibody injection

GFP(Green Fluorescent Protein)やその他の蛍光タグを用いて生細胞内のタンパク質を可視化することで、タンパク質の局在、動態、機能の理解が大幅に向上しました。免疫蛍光法と比較して、ライブイメージングは、組織固定から生じる潜在的なアーチファクトなしに、タンパク質の局在をより正確に反映します。重要なことは、ライブイメージングにより、細胞の動きや分裂などの動的な生物学的プロセスを理解するために重要な、タンパク質レベルと局在の定量的および時間的特性評価が可能になることです。しかし、蛍光標識法の主な制限は、可視化を成功させるために十分に高いタンパク質発現レベルが必要であることです。その結果、発現レベルが比較的低い内因性タグ付き蛍光タンパク質の多くは検出できません。一方、ウイルスプロモーターを用いた異所性発現は、生理学的状況におけるタンパク質の誤局在や機能的変化につながることがあります。これらの制限に対処するために、生体胚における高感度の抗体媒介タンパク質検出を利用し、本質的に組織固定を必要とせずに免疫蛍光を実行するアプローチが提示されます。原理の証明として、生体胚ではほとんど検出できない内因性GFPタグ付きノッチ受容体を、抗体注入後にうまく可視化することができます。さらに、このアプローチは、生きた胚の翻訳後修飾(PTM)を可視化するために適用され、初期胚発生中のチロシンリン酸化パターンの経時的変化の検出を可能にし、頂端膜下のホスホチロシン(p-Tyr)の新しい亜集団を明らかにしました。このアプローチは、他のタンパク質特異的抗体、タグ特異的抗体、またはPTM特異的抗体に対応するように変更することができ、他の注入に適したモデル生物または細胞株と適合性があるはずです。このプロトコルは、従来の蛍光タグ法では検出が困難であった低存在量タンパク質またはPTMのライブイメージングに新たな可能性を開きます。

Immunofluorescence is a cornerstone technique of modern cell biology originally developed by Albert Coons, which enables the detection of molecules at their native cellular compartments and characterization of the molecular compositions of subcellular organelles or machineries1. Coupled with genetic manipulations, immunofluorescence helps establish the now well-accepted concept that protein localization is essential for its function2. Aside from specific primary antibodies and bright fluorescent dyes, the success of this technique relies on a preliminary process named fixation and permeabilization, which preserves cellular morphologies, immobilizes antigens, and increases the accessibility of antibodies into intracellular compartments. Inevitably, the fixation and permeabilization process would kill cells and terminate all biological processes3. Therefore, immunofluorescence only provides snapshots of the life journey of proteins. However, many biological processes such as cell migration and divisions are dynamic in nature, requiring investigation of protein behaviors in a spatial-temporally resolved manner4,5.
To examine protein dynamics in living organisms, live imaging methods based on genetically encoded fluorescent proteins such as green fluorescent protein (GFP)6 and high-speed confocal microscopes have been developed. Briefly, the protein of interest can be genetically manipulated to be fused with GFP7, and then ectopically expressed from viral or yeast promoters such as cytomegalovirus (CMV)8 or upstream activation sequence (UAS)9. Because GFP is autofluorescent in nature, no fluorophore-coupled antibodies are required to reveal the localization of target proteins, which bypasses the necessity of preliminary processes of fixation or permeabilization. Over the last two decades, fluorescent tags spanning the whole spectrum of wavelength have been developed10, enabling multi-color live imaging of several target proteins at the same time. However, compared to chemically engineered fluorescent dyes such as AlexaFluor or ATTO, the autofluorescence of these genetically encoded fluorescent proteins is relatively weak and unstable when expressed from endogenous promoters, especially during live imaging over longer time scales10. While this shortfall can be mitigated by over-expressing fluorescently tagged target proteins, many with enzymatic activities such as kinases and phosphatases severely disrupt normal biological processes if not expressed at physiological levels.
This protocol presents a method that enables photostable antibody-based target illumination in a live image setup, essentially allowing immunofluorescence without the process of fixation or permeabilization (Figure 1). Through a simple NHS-based primary amine reaction11, one can conjugate fluorescent dyes such as AlexaFluor 488 or 594 with essentially any primary antibody or GFP/HA/Myc nanobody12. Taking advantage of a developmental feature that all Drosophila embryonic cells share a common cytoplasm during the syncytium stage13, one can achieve antigen binding and illumination across entire embryos after the injection of dye-conjugated antibodies. With expanding libraries of endogenously tagged proteins available in Drosophila and other model systems14, this method can potentially broaden applications of these libraries by revealing dynamics of low-abundance fluorescently tagged proteins and other non-fluorescently tagged (HA/Myc-tagged) proteins in living tissues.

著者スポットライト:動物の形態形成研究における機械的および生化学的シグナルのダイナミクスの解明 

蛍光抗体注入によるショウジョウバエの生きた胚における低存在量タンパク質と翻訳後修飾の可視化

We aim to understand how mechanical and biochemical signals correlate animal morphogenesis, including the detection and the response to forces by cells and molecules. More molecules have been discovered to be mechanosensitive, functioning differently under varying levels of tension. However, the physiological context and the function of these force-sensitive events remain largely unknown.Due to the dynamic nature of force-sensitive events, our field largely relies on high-speed fluorescence imaging and time-lapse recording to capture molecular and cellular behaviors. Many fluorescently-tagged proteins are not bright enough to be imaged, and it requires spatial-temporal resolution without significant bleach. On the other hand, traditional immunofluorescence methods can only capture a snapshot of molecular and cellular fixture after fixation.This method paves the way to dynamically track the localization of many low-abundance protein receptors of major signaling pathways, such as Notch, Wnt, and the BMP pathways. Eventually, in addition to the traditional linear signaling cascades, we can pinpoint and where the signaling events occur at the subcellular scales.

蛍光タグベースのライブイメージングや免疫蛍光法に対する抗体注入法の利点を実証するために、存在量の少ない膜貫通受容体であるNotchの動的局在と、生きた胚におけるチロシンリン酸化と呼ばれる翻訳後修飾の一種を特徴付ける2つのケーススタディを提供します。
ノッチシグナル伝達活性は、胚発生および成体臓器の恒常性維持における細胞運命の決定に大きな役?...

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このプロトコルでは、従来のGFP/mCherryタグアプローチでは検出が困難な少量のタンパク質や翻訳後修飾のライブイメージングを可能にするために、カスタマイズされた抗体ベースの蛍光標識とショウ ジョウバエ の初期胚への注入について説明します。

Visualization of proteins in living cells using GFP (Green Fluorescent Protein) and other fluorescent tags has greatly improved understanding of protein ...

私たちは、力学的および生化学的シグナルが、細胞や分子による力の検出と応答を含む動物の形態形成とどのように相関しているかを理解することを目指しています。より多くの分子が機械に敏感であり、さまざまなレベルの張力の下で異なる機能を発揮することが発見されています。しかし、これらの力に敏感な事象の生理学的背景と機能はほとんど不明のままです。力に敏感な事象の動的な性質により、私たちの分野は、分子や細胞の挙動を捉えるために、高速蛍光イメージングとタイムラプス記録に大きく依存しています。多くの蛍光タグ付きタンパク質は、画像化できるほど明るくなく、著しい漂白を伴わない時空間分解能が必要です。一方、従来の免疫蛍光法では、固定後の分子および細胞固定のスナップショットしか取得できません。この方法は、Notch、Wnt、BMP経路などの主要なシグナル伝達経路の多くの低存在量タンパク質受容体の局在を動的に追跡する道を開きます。最終的には、従来の線形シグナル伝達カスケードに加えて、細胞内スケールでシグナル伝達イベントが発生する場所を特定できるようになります。

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Visualizing Low-Abundance Proteins and Post-Translational Modifications in Living Drosophila Embryos via Fluorescent Antibody Injection

Visualization of proteins in living cells using GFP (Green Fluorescent Protein) and other fluorescent tags has greatly improved understanding of protein localization, dynamics, and function. Compared to immunofluorescence, live imaging more accurately reflects protein localization without potential artifacts arising from tissue fixation. Importantly, live imaging enables quantitative and temporal characterization of protein levels and localization, crucial for understanding dynamic biological processes such as cell movement or division. However, a major limitation of fluorescent tagging approaches is the need for sufficiently high protein expression levels to achieve successful visualization. Consequently, many endogenously tagged fluorescent proteins with relatively low expression levels cannot be detected. On the other hand, ectopic expression using viral promoters can sometimes lead to protein mislocalization or functional alterations in physiological contexts. To address these limitations, an approach is presented that utilizes highly sensitive antibody-mediated protein detection in living embryos, essentially performing immunofluorescence without the need for tissue fixation. As proof of principle, endogenously GFP-tagged Notch receptor that is barely detectable&#160;in living embryos can be successfully visualized after antibody injection. Furthermore, this approach was adapted to visualize post-translational modifications (PTMs) in living embryos, allowing the detection of temporal changes in tyrosine phosphorylation patterns during early embryogenesis and revealing a novel subpopulation of phosphotyrosine (p-Tyr) underneath apical membranes. This approach can be modified to accommodate other protein-specific, tag-specific, or PTM-specific antibodies and should be compatible with other injection-amenable model organisms or cell lines. This protocol opens new possibilities for live imaging of low-abundance proteins or PTMs that were previously challenging to detect using traditional fluorescent tagging methods.

This protocol describes the customized antibody-based fluorescence labeling and injection into early Drosophila embryos to enable live imaging of low-abundance proteins or post-translational modifications that are challenging to detect using traditional GFP/mCherry-tag approaches.