Name: 저자 스포트라이트: Unveiling the Dynamics of Mechanical and Biochemical Signals in Animal Morphogenesis Research (동물 형태 형성 연구에서 기계적 및 생화학적 신호의 역학 공개)
Uploaded: 2024-01-19T13:55:00
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Sqh-GFP 초파리 라인을 제공하고 이 기술의 초기 개발을 지원해 주신 Jennifer A. Zallen 박사와 Notch-GFP Drosophila 라인을 제공해 주신 Francois Schweisguth 박사님께 감사드립니다. 이 연구는 중국 국립 자연 과학 재단(National Natural Science Foundation of China, 32270809)이 H.H.Yu에게 자금을 지원하고, 생명과학부(School of Life Sciences, SUSTech)의 관대한 재정 및 직원 지원, 선전 과학 기술 혁신 위원회(Shenzhen Science and Technology Innovation Commission/JCYJ20200109140201722)의 Y. Yan에게 자금을 지원했습니다.

실험은 SUSTech University의 생명 과학 대학의 지침 및 승인에 따라 수행되었습니다. 사용된 유기체는 Drosophila melanogaster이며, 유전자형은 Notch-Knockin-GFP(염색체 X) 및 Sqh-sqh-GFP(염색체 II)이며, 각각 Francois Schweisguth 박사(파스퇴르 연구소)와 Jennifer Zallen 박사(슬론 케터링 연구소)의 실험실에서 아낌없이 제공합니다. 이 프로토콜은 주로 항체 표지 및 실시간 이미징의 측면에 초점을 맞추고 있지만, <...

Antibody-Mediated Live Imaging을 통한 단백질 시각화 향상

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G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+interactions+between+the+protein+products+of+the+neurogenic+loci+Notch+and+Delta,+two+EGF-homologous+genes+in+Drosophila.">Molecular interactions between the protein products of the neurogenic loci Notch and Delta, two EGF-homologous genes in Drosophila.</a> Cell. 61 (3), 523-534 (1990).</li><li>Struhl, G., Greenwald, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presenilin+is+required+for+activity+and+nuclear+access+of+Notch+in+Drosophila.">Presenilin is required for activity and nuclear access of Notch in Drosophila.</a> Nature. 398 (6727), 522-525 (1999).</li><li>Henrique, D., Schweisguth, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+Notch+signaling:+a+simple+logic+deployed+in+time+and+space.">Mechanisms of Notch signaling: a simple logic deployed in time and space.</a> Development. 146 (3), dev172148 (2019).</li><li>Trylinski, M., Mazouni, K., Schweisguth, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intra-lineage+fate+decisions+involve+of+notch+receptors+basal+to+the+midbody+in+drosophila+sensory+organ+precursor+cells.">Intra-lineage fate decisions involve of notch receptors basal to the midbody in drosophila sensory organ precursor cells.</a> Current Biology. 27 (15), 2239.e3-2247.e3 (2017).</li><li>Hunter, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+kinases+and+phosphatases:+The+Yin+and+Yang+of+protein+phosphorylation+and+signaling.">Protein kinases and phosphatases: The Yin and Yang of protein phosphorylation and signaling.</a> Cell. 80 (2), 225-236 (1995).</li><li>Glenney, J. R., Zokas, L., Kamps, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monoclonal+antibodies+to+phosphotyrosine.">Monoclonal antibodies to phosphotyrosine.</a> Journal of Immunological Methods. 109 (2), 277-285 (1988).</li><li>Hunter, T., Cooper, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidermal+growth+factor+induces+rapid+tyrosine+phosphorylation+of+proteins+in+A431+human+tumor+cells.">Epidermal growth factor induces rapid tyrosine phosphorylation of proteins in A431 human tumor cells.</a> Cell. 24 (3), 741-752 (1981).</li><li>Yu, H. H., Zallen, J. 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이 제시된 절차는 맞춤형 항체를 사용한 형광 표지 및 초기 단계 의 초파리 배아에 대한 후속 주입의 특수 방법을 간략하게 설명합니다. 이 기술은 소량으로 존재하고 일반적으로 기존의 GFP/mCherry 태깅 방법을 통해 관찰하기 어려운 단백질 또는 번역 후 변형의 실시간 시각화를 용이하게 합니다.
야생형 배아와 돌연변이 배아를 정량적으로 비교하기 위해 이 방법을 확?...

면역형광은 앨버트 쿤스(Albert Coons)가 처음 개발한 현대 세포 생물학의 초석 기술로, 본래 세포 구획에서 분자를 검출하고 세포 내 세포 소기관 또는 기계의 분자 조성을 특성화할 수 있습니다1. 유전자 조작과 결합된 면역형광은 단백질 국소화가 그 기능에 필수적이라는 현재 잘 받아들여지고 있는 개념을 확립하는 데 도움이 됩니다2. 특정 1차 항체 및 밝은 형광 염료 외에도 이 기술의 성공은 세포 형태를 보존하고 항원을 고정하며 세포 내 구획에 대한 항체의 접근성을 높이는 고정 및 투과화라는 예비 공정에 달려 있습니다. 필연적으로 고정 및 투과화 과정은 세포를 죽이고 모든 생물학적 과정을 종료합니다3. 따라서 면역형광은 단백질의 생애 여정에 대한 스냅샷만 제공합니다. 그러나 세포 이동 및 분열과 같은 많은 생물학적 과정은 본질적으로 동적이므로 공간-시간적으로 분해되는 방식으로 단백질 거동을 조사해야 합니다 4,5.
살아있는 유기체의 단백질 역학을 조사하기 위해 녹색 형광 단백질(GFP)6 및 고속 컨포칼 현미경과 같은 유전적으로 인코딩된 형광 단백질을 기반으로 하는 라이브 이미징 방법이 개발되었습니다. 간단히 말해서, 관심있는 단백질은 GFP7과 융합되도록 유전적으로 조작 될 수 있으며, cytomegalovirus (CMV) 8 또는 upstream activation sequence (UAS) 9와 같은 바이러스 또는 효모 프로모터로부터 ectopically 발현 될 수 있습니다. GFP는 성격에서 autofluorescent 이기 때문에, 아무 형광단도 결합한 항체는 기정 침투성의 예비적인 과정의 필요를 우회하는 표적 단백질의 지방화를 계시하기 위하여 요구되지 않습니다. 지난 20년 동안 전체 파장 스펙트럼에 걸쳐 형광 태그가 개발되어10 여러 표적 단백질의 다색 라이브 이미징을 동시에 수행할 수 있습니다. 그러나, AlexaFluor 또는 ATTO와 같은 화학적으로 조작된 형광 염료와 비교하여, 이러한 유전적으로 암호화된 형광 단백질의 자가형광은 내인성 프로모터로부터 발현될 때, 특히 장시간 스케일에 걸친 라이브 이미징 중에 상대적으로 약하고 불안정하다10. 이러한 결핍은 형광 표지된 표적 단백질을 과발현시킴으로써 완화될 수 있지만, 키나아제 및 인산가수분해효소와 같은 효소 활성을 가진 많은 단백질은 생리학적 수준에서 발현되지 않을 경우 정상적인 생물학적 과정을 심각하게 방해합니다.
이 프로토콜은 실시간 이미지 설정에서 광안정성 항체 기반 표적 조명을 가능하게 하는 방법을 제시하며, 기본적으로 고정 또는 투과화 과정 없이 면역형광을 허용합니다(그림 1). 간단한 NHS 기반 1차 아민 반응(11)을 통해 AlexaFluor 488 또는 594와 같은 형광 염료를 본질적으로 모든 1차 항체 또는 GFP/HA/Myc nanobody(12)와 접합할 수 있습니다. 모든 초파리 배아 세포가 싱크리튬(syncytium) 단계13 동안 공통 세포질을 공유한다는 발달적 특징을 이용하여, 염료 접합 항체를 주입한 후 전체 배아에 걸쳐 항원 결합 및 조명을 달성할 수 있습니다. 초파리(Drosophila ) 및 다른 모델 시스템(14)에서 이용 가능한 내인성 표지 단백질의 라이브러리가 확장됨에 따라, 이 방법은 살아있는 조직에서 저농도 형광 표지 단백질 및 기타 비형광 표지(HA/Myc-표지) 단백질의 역학을 밝혀냄으로써 잠재적으로 이들 라이브러리의 응용을 확대할 수 있다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>&#160;A620014&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 594 Antibody Labeling Kit</td>
			<td>Invitrogen&#160;</td>
			<td>A20185</td>
			<td>Purification column from step 1.6 is included in this kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biological Microscope</td>
			<td>SOPTOP</td>
			<td>EX20</td>
			<td>Eyepiece lens: PL 10X/20. Objective lens: 10x/0.25</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bleach</td>
			<td>Clorox&#174;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate Glass Capillaries</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>TW100F-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5245</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Strainer</td>
			<td>FALCON</td>
			<td>352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Desiccation chamber&#160;</td>
			<td>LOCK&#38;LOCK</td>
			<td>HSM8200</td>
			<td>320ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting Microscope</td>
			<td>Mshot</td>
			<td>MZ62</td>
			<td>Eyepiece lens: WF10X/22mm.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double-sided Tape</td>
			<td>Scotch</td>
			<td>665</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Super Tweezer</td>
			<td>VETUS</td>
			<td>ST-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand&#8482; Cover Glasses: Rectangles</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>12-545F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand&#8482; Superfrost&#8482; Plus Microscope Slides</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>12-550-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forcep</td>
			<td>VETUS</td>
			<td>33A-SA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Halocarbon oil 27</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H8773-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Halocarbon oil 700</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H8898-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heptane</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H2198-1L</td>
			<td>Heptane glue is made of double-sided tape immersed in heptane</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dehydration reagent&#160;</td>
			<td>TOKAI</td>
			<td>1-7315-01</td>
			<td>Fill to 90% volume of the dessication chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manual Micromanipulator</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>M3301R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette puller</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>PUL-1000</td>
			<td>Procedure: step 1, Heat: 290, Force:300, Distance:1.00, Delay:50. 
			Step 2, Heat: 290, Force:300, Distance:2.21, Delay:50&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pneumatic picopump</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>PV 830</td>
			<td>Eject: 20 psi;&#160; Range: 100ms; Duration: timed</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PY20</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>SC-508</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Square petri dishes</td>
			<td>Biosharp</td>
			<td>BS-100-SD</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFP nanobody</td>
			<td>Chromotek</td>
			<td>gt</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualizing low-abundance proteins and post-translational modifications in living drosophila embryos via fluorescent antibody injection

GFP(Green Fluorescent Protein) 및 기타 형광 태그를 사용하여 살아있는 세포의 단백질을 시각화하면 단백질 국소화, 역학 및 기능에 대한 이해가 크게 향상됩니다. 면역형광과 비교했을 때, 실시간 이미징은 조직 고정으로 인해 발생할 수 있는 잠재적인 아티팩트 없이 단백질 국소화를 더 정확하게 반영합니다. 중요한 것은 라이브 이미징을 통해 단백질 수준과 국소화의 정량적 및 시간적 특성 분석이 가능하며, 이는 세포 이동 또는 분열과 같은 역동적인 생물학적 과정을 이해하는 데 매우 중요하다는 것입니다. 그러나 형광 태깅 접근법의 주요 한계는 성공적인 시각화를 달성하기 위해 충분히 높은 단백질 발현 수준이 필요하다는 것입니다. 결과적으로, 상대적으로 낮은 발현 수준을 가진 많은 내인성 표지 형광 단백질은 검출될 수 없습니다. 반면에, 바이러스 프로모터를 사용한 이소성 발현은 때때로 생리학적 맥락에서 단백질의 국소화 불량 또는 기능적 변화를 초래할 수 있습니다. 이러한 한계를 해결하기 위해 살아있는 배아에서 고감도 항체 매개 단백질 검출을 활용하여 조직 고정 없이 면역형광을 수행하는 접근 방식이 제시됩니다. 원리의 증거로, 살아있는 배아에서 거의 검출할 수 없는 내인성 GFP 태그 노치 수용체는 항체 주입 후 성공적으로 시각화할 수 있습니다. 또한, 이 접근법은 살아있는 배아의 번역 후 변형(PTM)을 시각화하도록 조정되어 초기 배아 발생 중 티로신 인산화 패턴의 시간적 변화를 감지하고 정점 막 아래에 있는 포스포티로신(p-Tyr)의 새로운 하위 집단을 밝힐 수 있습니다. 이 접근법은 다른 단백질 특이적, 태그 특이적 또는 PTM 특이적 항체를 수용하도록 수정할 수 있으며 다른 주입 가능 모델 유기체 또는 세포주와 호환되어야 합니다. 이 프로토콜은 기존의 형광 태깅 방법을 사용하여 검출하기 어려웠던 저농도 단백질 또는 PTM의 실시간 이미징을 위한 새로운 가능성을 열어줍니다.

Immunofluorescence is a cornerstone technique of modern cell biology originally developed by Albert Coons, which enables the detection of molecules at their native cellular compartments and characterization of the molecular compositions of subcellular organelles or machineries1. Coupled with genetic manipulations, immunofluorescence helps establish the now well-accepted concept that protein localization is essential for its function2. Aside from specific primary antibodies and bright fluorescent dyes, the success of this technique relies on a preliminary process named fixation and permeabilization, which preserves cellular morphologies, immobilizes antigens, and increases the accessibility of antibodies into intracellular compartments. Inevitably, the fixation and permeabilization process would kill cells and terminate all biological processes3. Therefore, immunofluorescence only provides snapshots of the life journey of proteins. However, many biological processes such as cell migration and divisions are dynamic in nature, requiring investigation of protein behaviors in a spatial-temporally resolved manner4,5.
To examine protein dynamics in living organisms, live imaging methods based on genetically encoded fluorescent proteins such as green fluorescent protein (GFP)6 and high-speed confocal microscopes have been developed. Briefly, the protein of interest can be genetically manipulated to be fused with GFP7, and then ectopically expressed from viral or yeast promoters such as cytomegalovirus (CMV)8 or upstream activation sequence (UAS)9. Because GFP is autofluorescent in nature, no fluorophore-coupled antibodies are required to reveal the localization of target proteins, which bypasses the necessity of preliminary processes of fixation or permeabilization. Over the last two decades, fluorescent tags spanning the whole spectrum of wavelength have been developed10, enabling multi-color live imaging of several target proteins at the same time. However, compared to chemically engineered fluorescent dyes such as AlexaFluor or ATTO, the autofluorescence of these genetically encoded fluorescent proteins is relatively weak and unstable when expressed from endogenous promoters, especially during live imaging over longer time scales10. While this shortfall can be mitigated by over-expressing fluorescently tagged target proteins, many with enzymatic activities such as kinases and phosphatases severely disrupt normal biological processes if not expressed at physiological levels.
This protocol presents a method that enables photostable antibody-based target illumination in a live image setup, essentially allowing immunofluorescence without the process of fixation or permeabilization (Figure 1). Through a simple NHS-based primary amine reaction11, one can conjugate fluorescent dyes such as AlexaFluor 488 or 594 with essentially any primary antibody or GFP/HA/Myc nanobody12. Taking advantage of a developmental feature that all Drosophila embryonic cells share a common cytoplasm during the syncytium stage13, one can achieve antigen binding and illumination across entire embryos after the injection of dye-conjugated antibodies. With expanding libraries of endogenously tagged proteins available in Drosophila and other model systems14, this method can potentially broaden applications of these libraries by revealing dynamics of low-abundance fluorescently tagged proteins and other non-fluorescently tagged (HA/Myc-tagged) proteins in living tissues.

저자 스포트라이트: Unveiling the Dynamics of Mechanical and Biochemical Signals in Animal Morphogenesis Research (동물 형태 형성 연구에서 기계적 및 생화학적 신호의 역학 공개) 

형광 항체 주입을 통한 살아있는 초파리 배아의 저농도 단백질 및 번역 후 변형 시각화

We aim to understand how mechanical and biochemical signals correlate animal morphogenesis, including the detection and the response to forces by cells and molecules. More molecules have been discovered to be mechanosensitive, functioning differently under varying levels of tension. However, the physiological context and the function of these force-sensitive events remain largely unknown.Due to the dynamic nature of force-sensitive events, our field largely relies on high-speed fluorescence imaging and time-lapse recording to capture molecular and cellular behaviors. Many fluorescently-tagged proteins are not bright enough to be imaged, and it requires spatial-temporal resolution without significant bleach. On the other hand, traditional immunofluorescence methods can only capture a snapshot of molecular and cellular fixture after fixation.This method paves the way to dynamically track the localization of many low-abundance protein receptors of major signaling pathways, such as Notch, Wnt, and the BMP pathways. Eventually, in addition to the traditional linear signaling cascades, we can pinpoint and where the signaling events occur at the subcellular scales.

형광 태그 기반 라이브 이미징 또는 면역 형광에 비해 항체 주입 방법의 이점을 입증하기 위해 저농도 막관통 수용체인 Notch의 동적 국소화와 살아있는 배아에서 티로신 인산화라고 하는 일종의 번역 후 변형을 특성화하는 두 가지 사례 연구가 제공됩니다.
노치 신호전달 활성은 배아 발생 및 성인 장기 항상성 동안 세포 운명 결정에 중요한 역할을 합니다18,19</su...

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이 프로토콜은 기존의 GFP/mCherry-tag 접근법을 사용하여 검출하기 어려운 저농도 단백질 또는 번역 후 변형의 실시간 이미징을 가능하게 하는 맞춤형 항체 기반 형광 라벨링 및 초기 초파리 배아에 주입하는 방법을 설명합니다.

Visualization of proteins in living cells using GFP (Green Fluorescent Protein) and other fluorescent tags has greatly improved understanding of protein ...

우리는 기계적 및 생화학적 신호가 세포와 분자에 의한 힘에 대한 감지 및 반응을 포함하여 동물의 형태 형성과 어떻게 상관 관계가 있는지 이해하는 것을 목표로 합니다. 더 많은 분자가 기계에 민감하여 다양한 수준의 장력에서 다르게 기능하는 것으로 밝혀졌습니다. 그러나 이러한 힘에 민감한 사건의 생리학적 맥락과 기능은 거의 알려지지 않았습니다.힘에 민감한 이벤트의 동적 특성으로 인해 우리 분야는 분자 및 세포 거동을 캡처하기 위해 고속 형광 이미징 및 타임 랩스 기록에 크게 의존합니다. 형광 태그가 부착된 많은 단백질은 이미징할 수 있을 만큼 밝지 않으며, 상당한 표백제 없이 공간-시간 해상도가 필요합니다. 반면, 기존의 면역형광 분석법은 고정 후 분자 및 세포 고정물의 스냅샷만 캡처할 수 있습니다.이 방법은 Notch, Wnt 및 BMP 경로와 같은 주요 신호 전달 경로의 많은 저농도 단백질 수용체의 국소화를 동적으로 추적할 수 있는 길을 열어줍니다. 결국, 전통적인 선형 신호 캐스케이드 외에도 세포 내 규모에서 신호 이벤트가 발생하는 위치를 정확히 찾아낼 수 있습니다.

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Visualizing Low-Abundance Proteins and Post-Translational Modifications in Living Drosophila Embryos via Fluorescent Antibody Injection

Visualization of proteins in living cells using GFP (Green Fluorescent Protein) and other fluorescent tags has greatly improved understanding of protein localization, dynamics, and function. Compared to immunofluorescence, live imaging more accurately reflects protein localization without potential artifacts arising from tissue fixation. Importantly, live imaging enables quantitative and temporal characterization of protein levels and localization, crucial for understanding dynamic biological processes such as cell movement or division. However, a major limitation of fluorescent tagging approaches is the need for sufficiently high protein expression levels to achieve successful visualization. Consequently, many endogenously tagged fluorescent proteins with relatively low expression levels cannot be detected. On the other hand, ectopic expression using viral promoters can sometimes lead to protein mislocalization or functional alterations in physiological contexts. To address these limitations, an approach is presented that utilizes highly sensitive antibody-mediated protein detection in living embryos, essentially performing immunofluorescence without the need for tissue fixation. As proof of principle, endogenously GFP-tagged Notch receptor that is barely detectable&#160;in living embryos can be successfully visualized after antibody injection. Furthermore, this approach was adapted to visualize post-translational modifications (PTMs) in living embryos, allowing the detection of temporal changes in tyrosine phosphorylation patterns during early embryogenesis and revealing a novel subpopulation of phosphotyrosine (p-Tyr) underneath apical membranes. This approach can be modified to accommodate other protein-specific, tag-specific, or PTM-specific antibodies and should be compatible with other injection-amenable model organisms or cell lines. This protocol opens new possibilities for live imaging of low-abundance proteins or PTMs that were previously challenging to detect using traditional fluorescent tagging methods.

This protocol describes the customized antibody-based fluorescence labeling and injection into early Drosophila embryos to enable live imaging of low-abundance proteins or post-translational modifications that are challenging to detect using traditional GFP/mCherry-tag approaches.