Name: Forfatter Spotlight: Avsløring av dynamikken til mekaniske og biokjemiske signaler i dyremorfogeneseforskning
Uploaded: 2024-01-19T13:55:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Unveiling the Dynamics of Mechanical and Biochemical Signals in Animal Morphogenesis Research at JoVE.com

Vi vil gjerne takke Dr. Jennifer A. Zallen for å gi Sqh-GFP Drosophila-linjen og støtte til den første utviklingen av denne teknikken, og Dr. Francois Schweisguth for å gi Notch-GFP Drosophila-linjen . Dette arbeidet ble støttet av finansiering fra National Natural Science Foundation of China (32270809) til HH Yu, sjenerøs økonomisk og personalstøtte fra School of Life Sciences, SUSTech, og finansiering til Y. Yan fra Shenzhen Science and Technology Innovation Commission / JCYJ20200109140201722.

Forsøkene ble utført i samsvar med retningslinjene og godkjenning fra School of Life Sciences, SUSTech University. Organismen som brukes er Drosophila melanogaster, og genotypene er Notch-Knockin-GFP (Chromosome X) og Sqh-sqh-GFP (Chromosome II), sjenerøst levert av laboratoriene til henholdsvis Dr. Francois Schweisguth (Institute Pasteur) og Dr. Jennifer Zallen (Sloan Kettering Institute). Selv om denne protokollen hovedsakelig fokuserer på aspekter ved antistoffmerking og levende bildebehandling, se publis...

Forbedring av proteinvisualisering med antistoffmediert levende avbildning

<ol>
	<li>Coons, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+beginnings+of+immunofluorescence.">The beginnings of immunofluorescence.</a> Journal of Immunology (Baltimore, Md). 87, 499-503 (1961).</li><li>Arthur, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Harnessing+the+power+of+the+antibody.">Harnessing the power of the antibody.</a> The Lancet Respiratory Medicine. 4 (3), 181-182 (2016).</li><li>Im, K., Mareninov, S., Diaz, M. F. P., Yong, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biobanking,+methods+and+protocols.">Biobanking, methods and protocols.</a> Methods in Molecular Biology. 1897, 299-311 (2018).</li><li>Ragkousi, K., Gibson, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial+integrity+and+cell+division:+Concerted+cell+cycle+control.">Epithelial integrity and cell division: Concerted cell cycle control.</a> Cell Cycle. 17 (4), 399-400 (2018).</li><li>Herszterg, S., Leibfried, A., Bosveld, F., Martin, C., Bellaiche, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interplay+between+the+dividing+cell+and+its+neighbors+regulates+adherens+junction+formation+during+cytokinesis+in+epithelial+tissue.">Interplay between the dividing cell and its neighbors regulates adherens junction formation during cytokinesis in epithelial tissue.</a> Developmental Cell. 24 (3), 256-270 (2013).</li><li>Shimomura, O., Johnson, F. H., Saiga, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extraction,+purification+and+properties+of+aequorin,+a+bioluminescent+protein+from+the+luminous+hydromedusan,+aequorea.">Extraction, purification and properties of aequorin, a bioluminescent protein from the luminous hydromedusan, aequorea.</a> Journal of Cellular and Comparative Physiology. 59 (3), 223-239 (1962).</li><li>Chalfie, M., Tu, Y., Euskirchen, G., Ward, W. W., Prasher, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Green+fluorescent+protein+as+a+marker+for+gene+expression.">Green fluorescent protein as a marker for gene expression.</a> Science. 263 (5148), 802-805 (1994).</li><li>Boshart, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+very+strong+enhancer+is+located+upstream+of+an+immediate+early+gene+of+human+cytomegalovirus.">A very strong enhancer is located upstream of an immediate early gene of human cytomegalovirus.</a> Cell. 41 (2), 521-530 (1985).</li><li>Brand, A. H., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+gene+expression+as+a+means+of+altering+cell+fates+and+generating+dominant+phenotypes.">Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes.</a> Development. 118 (2), 401-415 (1993).</li><li>Rodriguez, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+growing+and+glowing+toolbox+of+fluorescent+and+photoactive+proteins.">The growing and glowing toolbox of fluorescent and photoactive proteins.</a> Trends in Biochemical Sciences. 42 (2), 111-129 (2016).</li><li>Berg, E. A., Fishman, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Labeling+antibodies+using+N+-Hydroxysuccinimide+(NHS)-fluorescein.">Labeling antibodies using N -Hydroxysuccinimide (NHS)-fluorescein.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2019 (3), (2019).</li><li>Saerens, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+universal+VHH+framework+to+graft+non-canonical+antigen-binding+loops+of+camel+single-domain+antibodies.">Identification of a universal VHH framework to graft non-canonical antigen-binding loops of camel single-domain antibodies.</a> Journal of Molecular Biology. 352 (3), 597-607 (2005).</li><li>Loncar, D., Singer, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+membrane+formation+during+the+cellularization+of+the+syncytial+blastoderm+of+Drosophila.">Cell membrane formation during the cellularization of the syncytial blastoderm of Drosophila.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 92 (6), 2199-2203 (1995).</li><li>Lye, C. M., Naylor, H. W., Sanson, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subcellular+localisations+of+the+CPTI+collection+of+YFP-tagged+proteins+in+Drosophila+embryos.">Subcellular localisations of the CPTI collection of YFP-tagged proteins in Drosophila embryos.</a> Development. 141 (20), 4006-4017 (2014).</li><li>Iordanou, E., Chandran, R. R., Blackstone, N., Jiang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNAi+interference+by+dsRNA+injection+into+Drosophila+embryos.">RNAi interference by dsRNA injection into Drosophila embryos.</a> Journal of Visualized Experiments. 50, e2477 (2011).</li><li>Figard, L., Sokac, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+cell+shape+change+in+living+Drosophila+embryos.">Imaging cell shape change in living Drosophila embryos.</a> Journal of Visualized Experiments. 49, e2503 (2011).</li><li>Campos-Ortega, J. A., Hartenstein, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+embryonic+development+of+Drosophila+melanogaster.">The embryonic development of Drosophila melanogaster.</a> , 9-102 (1997).</li><li>Ho, D. M., Artavanis-Tsakonas, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Notch-mediated+proliferation+circuitry.">The Notch-mediated proliferation circuitry.</a> Current Topics in Developmental Biology. 116, 17-33 (2016).</li><li>Kopan, R., Ilagan, X. G., Ma, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+canonical+Notch+signaling+pathway:+unfolding+the+activation+mechanism.">The canonical Notch signaling pathway: unfolding the activation mechanism.</a> Cell. 137 (2), 216-233 (2009).</li><li>Fehon, R. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+interactions+between+the+protein+products+of+the+neurogenic+loci+Notch+and+Delta,+two+EGF-homologous+genes+in+Drosophila.">Molecular interactions between the protein products of the neurogenic loci Notch and Delta, two EGF-homologous genes in Drosophila.</a> Cell. 61 (3), 523-534 (1990).</li><li>Struhl, G., Greenwald, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presenilin+is+required+for+activity+and+nuclear+access+of+Notch+in+Drosophila.">Presenilin is required for activity and nuclear access of Notch in Drosophila.</a> Nature. 398 (6727), 522-525 (1999).</li><li>Henrique, D., Schweisguth, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+Notch+signaling:+a+simple+logic+deployed+in+time+and+space.">Mechanisms of Notch signaling: a simple logic deployed in time and space.</a> Development. 146 (3), dev172148 (2019).</li><li>Trylinski, M., Mazouni, K., Schweisguth, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intra-lineage+fate+decisions+involve+of+notch+receptors+basal+to+the+midbody+in+drosophila+sensory+organ+precursor+cells.">Intra-lineage fate decisions involve of notch receptors basal to the midbody in drosophila sensory organ precursor cells.</a> Current Biology. 27 (15), 2239.e3-2247.e3 (2017).</li><li>Hunter, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+kinases+and+phosphatases:+The+Yin+and+Yang+of+protein+phosphorylation+and+signaling.">Protein kinases and phosphatases: The Yin and Yang of protein phosphorylation and signaling.</a> Cell. 80 (2), 225-236 (1995).</li><li>Glenney, J. R., Zokas, L., Kamps, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monoclonal+antibodies+to+phosphotyrosine.">Monoclonal antibodies to phosphotyrosine.</a> Journal of Immunological Methods. 109 (2), 277-285 (1988).</li><li>Hunter, T., Cooper, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidermal+growth+factor+induces+rapid+tyrosine+phosphorylation+of+proteins+in+A431+human+tumor+cells.">Epidermal growth factor induces rapid tyrosine phosphorylation of proteins in A431 human tumor cells.</a> Cell. 24 (3), 741-752 (1981).</li><li>Yu, H. H., Zallen, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Abl+and+Canoe/Afadin+mediate+mechanotransduction+at+tricellular+junctions.">Abl and Canoe/Afadin mediate mechanotransduction at tricellular junctions.</a> Science. 370 (6520), eaba5528 (2020).</li><li>Martin, A. C., Kaschube, M., Wieschaus, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pulsed+contractions+of+an+actin&#8211;myosin+network+drive+apical+constriction.">Pulsed contractions of an actin&#8211;myosin network drive apical constriction.</a> Nature. 457 (7228), 495-499 (2009).</li></ol>

Denne presenterte prosedyren skisserer den spesialiserte metoden for fluorescensmerking med tilpassede antistoffer og påfølgende injeksjon i Drosophila-embryoer i tidlig stadium. Denne teknikken muliggjør sanntidsvisualisering av proteiner eller posttranslasjonelle modifikasjoner som eksisterer i lave mengder og er vanligvis vanskelige å observere gjennom konvensjonelle GFP / mCherry-merkingsmetoder.
Forsiktighet bør utvises ved utvidelse av denne metoden for å gjøre kvantitati...

Immunfluorescens er en hjørnesteinsteknikk for moderne cellebiologi opprinnelig utviklet av Albert Coons, som muliggjør påvisning av molekyler ved deres opprinnelige cellulære rom og karakterisering av molekylære sammensetninger av subcellulære organeller eller maskiner. Sammen med genetiske manipulasjoner bidrar immunfluorescens til å etablere det nå aksepterte konseptet om at proteinlokalisering er avgjørende for dens funksjon2. Bortsett fra spesifikke primære antistoffer og lyse fluorescerende fargestoffer, er suksessen til denne teknikken avhengig av en foreløpig prosess kalt fiksering og permeabilisering, som bevarer cellulære morfologier, immobiliserer antigener og øker tilgjengeligheten av antistoffer i intracellulære rom. Uunngåelig vil fikserings- og permeabiliseringsprosessen drepe celler og avslutte alle biologiske prosesser3. Derfor gir immunfluorescens bare øyeblikksbilder av livsreisen til proteiner. Imidlertid er mange biologiske prosesser som cellemigrasjon og divisjoner dynamiske i naturen, og krever undersøkelse av proteinadferd på en romlig-temporalt løst måte 4,5.
For å undersøke proteindynamikk i levende organismer har levende bildebehandlingsmetoder basert på genetisk kodede fluorescerende proteiner som grønt fluorescerende protein (GFP) 6 og høyhastighets konfokale mikroskoper blitt utviklet. Kort fortalt kan proteinet av interesse bli genetisk manipulert for å bli smeltet sammen med GFP7, og deretter ektopisk uttrykt fra virale eller gjærpromotorer som cytomegalovirus (CMV) 8 eller oppstrøms aktiveringssekvens (UAS) 9. Fordi GFP er autofluorescerende i naturen, er det ikke nødvendig med fluoroforkoblede antistoffer for å avsløre lokaliseringen av målproteiner, som omgår nødvendigheten av foreløpige prosesser for fiksering eller permeabilisering. I løpet av de siste to tiårene har fluorescerende koder som spenner over hele spekteret av bølgelengde blitt utviklet10, noe som muliggjør flerfarget levende avbildning av flere målproteiner samtidig. Imidlertid, sammenlignet med kjemisk konstruerte fluorescerende fargestoffer som AlexaFluor eller ATTO, er autofluorescensen av disse genetisk kodede fluorescerende proteinene relativt svak og ustabil når den uttrykkes fra endogene promotorer, spesielt under levende avbildning over lengre tidsskalaer10. Selv om denne mangelen kan reduseres ved å overuttrykke fluorescerende merkede målproteiner, forstyrrer mange med enzymatiske aktiviteter som kinaser og fosfataser alvorlige normale biologiske prosesser hvis de ikke uttrykkes på fysiologiske nivåer.
Denne protokollen presenterer en metode som muliggjør fotostabil antistoffbasert målbelysning i et levende bildeoppsett, som i hovedsak tillater immunfluorescens uten fikserings- eller permeabiliseringsprosess (figur 1). Gjennom en enkel NHS-basert primær aminreaksjon11 kan man konjugere fluorescerende fargestoffer som AlexaFluor 488 eller 594 med i hovedsak et primært antistoff eller GFP / HA / Myc nanobody12. Ved å dra nytte av en utviklingsfunksjon at alle Drosophila embryonale celler deler en felles cytoplasma under syncytiumstadiet13, kan man oppnå antigenbinding og belysning over hele embryoer etter injeksjon av fargekonjugerte antistoffer. Med utvidende biblioteker av endogent merkede proteiner tilgjengelig i Drosophila og andre modellsystemer14, kan denne metoden potensielt utvide anvendelser av disse bibliotekene ved å avsløre dynamikken i fluorescerende merkede proteiner med lav overflod og andre ikke-fluorescerende merkede (HA / Myc-merkede) proteiner i levende vev.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>&#160;A620014&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 594 Antibody Labeling Kit</td>
			<td>Invitrogen&#160;</td>
			<td>A20185</td>
			<td>Purification column from step 1.6 is included in this kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biological Microscope</td>
			<td>SOPTOP</td>
			<td>EX20</td>
			<td>Eyepiece lens: PL 10X/20. Objective lens: 10x/0.25</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bleach</td>
			<td>Clorox&#174;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate Glass Capillaries</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>TW100F-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5245</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Strainer</td>
			<td>FALCON</td>
			<td>352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Desiccation chamber&#160;</td>
			<td>LOCK&#38;LOCK</td>
			<td>HSM8200</td>
			<td>320ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting Microscope</td>
			<td>Mshot</td>
			<td>MZ62</td>
			<td>Eyepiece lens: WF10X/22mm.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double-sided Tape</td>
			<td>Scotch</td>
			<td>665</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Super Tweezer</td>
			<td>VETUS</td>
			<td>ST-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand&#8482; Cover Glasses: Rectangles</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>12-545F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand&#8482; Superfrost&#8482; Plus Microscope Slides</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>12-550-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forcep</td>
			<td>VETUS</td>
			<td>33A-SA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Halocarbon oil 27</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H8773-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Halocarbon oil 700</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H8898-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heptane</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H2198-1L</td>
			<td>Heptane glue is made of double-sided tape immersed in heptane</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dehydration reagent&#160;</td>
			<td>TOKAI</td>
			<td>1-7315-01</td>
			<td>Fill to 90% volume of the dessication chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manual Micromanipulator</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>M3301R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette puller</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>PUL-1000</td>
			<td>Procedure: step 1, Heat: 290, Force:300, Distance:1.00, Delay:50. 
			Step 2, Heat: 290, Force:300, Distance:2.21, Delay:50&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pneumatic picopump</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>PV 830</td>
			<td>Eject: 20 psi;&#160; Range: 100ms; Duration: timed</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PY20</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>SC-508</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Square petri dishes</td>
			<td>Biosharp</td>
			<td>BS-100-SD</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFP nanobody</td>
			<td>Chromotek</td>
			<td>gt</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualizing low-abundance proteins and post-translational modifications in living drosophila embryos via fluorescent antibody injection

Visualisering av proteiner i levende celler ved hjelp av GFP (Green Fluorescent Protein) og andre fluorescerende koder har forbedret forståelsen av proteinlokalisering, dynamikk og funksjon. Sammenlignet med immunfluorescens reflekterer levende avbildning mer nøyaktig proteinlokalisering uten potensielle artefakter som oppstår fra vevfiksering. Det er viktig at levende bildebehandling muliggjør kvantitativ og tidsmessig karakterisering av proteinnivåer og lokalisering, avgjørende for å forstå dynamiske biologiske prosesser som cellebevegelse eller deling. En stor begrensning ved fluorescerende merkingsmetoder er imidlertid behovet for tilstrekkelig høye proteinuttrykksnivåer for å oppnå vellykket visualisering. Følgelig kan mange endogent merkede fluorescerende proteiner med relativt lave uttrykksnivåer ikke påvises. På den annen side kan ektopisk uttrykk ved bruk av virale promotorer noen ganger føre til feillokalisering av protein eller funksjonelle endringer i fysiologiske sammenhenger. For å løse disse begrensningene presenteres en tilnærming som benytter svært sensitiv antistoffmediert proteindeteksjon i levende embryoer, som i hovedsak utfører immunfluorescens uten behov for vevsfiksering. Som prinsippbevis kan endogent GFP-merket Notch-reseptor som knapt kan påvises i levende embryoer, visualiseres vellykket etter antistoffinjeksjon. Videre ble denne tilnærmingen tilpasset for å visualisere posttranslasjonelle modifikasjoner (PTM) i levende embryoer, noe som muliggjorde påvisning av tidsmessige endringer i tyrosinfosforyleringsmønstre under tidlig embryogenese og avsløring av en ny underpopulasjon av fosfotyrosin (p-Tyr) under apikale membraner. Denne tilnærmingen kan modifiseres for å imøtekomme andre proteinspesifikke, tag-spesifikke eller PTM-spesifikke antistoffer og bør være kompatibel med andre injeksjonsvennlige modellorganismer eller cellelinjer. Denne protokollen åpner nye muligheter for levende avbildning av proteiner med lav overflod eller PTM som tidligere var utfordrende å oppdage ved hjelp av tradisjonelle fluorescerende merkingsmetoder.

Immunofluorescence is a cornerstone technique of modern cell biology originally developed by Albert Coons, which enables the detection of molecules at their native cellular compartments and characterization of the molecular compositions of subcellular organelles or machineries1. Coupled with genetic manipulations, immunofluorescence helps establish the now well-accepted concept that protein localization is essential for its function2. Aside from specific primary antibodies and bright fluorescent dyes, the success of this technique relies on a preliminary process named fixation and permeabilization, which preserves cellular morphologies, immobilizes antigens, and increases the accessibility of antibodies into intracellular compartments. Inevitably, the fixation and permeabilization process would kill cells and terminate all biological processes3. Therefore, immunofluorescence only provides snapshots of the life journey of proteins. However, many biological processes such as cell migration and divisions are dynamic in nature, requiring investigation of protein behaviors in a spatial-temporally resolved manner4,5.
To examine protein dynamics in living organisms, live imaging methods based on genetically encoded fluorescent proteins such as green fluorescent protein (GFP)6 and high-speed confocal microscopes have been developed. Briefly, the protein of interest can be genetically manipulated to be fused with GFP7, and then ectopically expressed from viral or yeast promoters such as cytomegalovirus (CMV)8 or upstream activation sequence (UAS)9. Because GFP is autofluorescent in nature, no fluorophore-coupled antibodies are required to reveal the localization of target proteins, which bypasses the necessity of preliminary processes of fixation or permeabilization. Over the last two decades, fluorescent tags spanning the whole spectrum of wavelength have been developed10, enabling multi-color live imaging of several target proteins at the same time. However, compared to chemically engineered fluorescent dyes such as AlexaFluor or ATTO, the autofluorescence of these genetically encoded fluorescent proteins is relatively weak and unstable when expressed from endogenous promoters, especially during live imaging over longer time scales10. While this shortfall can be mitigated by over-expressing fluorescently tagged target proteins, many with enzymatic activities such as kinases and phosphatases severely disrupt normal biological processes if not expressed at physiological levels.
This protocol presents a method that enables photostable antibody-based target illumination in a live image setup, essentially allowing immunofluorescence without the process of fixation or permeabilization (Figure 1). Through a simple NHS-based primary amine reaction11, one can conjugate fluorescent dyes such as AlexaFluor 488 or 594 with essentially any primary antibody or GFP/HA/Myc nanobody12. Taking advantage of a developmental feature that all Drosophila embryonic cells share a common cytoplasm during the syncytium stage13, one can achieve antigen binding and illumination across entire embryos after the injection of dye-conjugated antibodies. With expanding libraries of endogenously tagged proteins available in Drosophila and other model systems14, this method can potentially broaden applications of these libraries by revealing dynamics of low-abundance fluorescently tagged proteins and other non-fluorescently tagged (HA/Myc-tagged) proteins in living tissues.

Forfatter Spotlight: Avsløring av dynamikken til mekaniske og biokjemiske signaler i dyremorfogeneseforskning 

Visualisering av proteiner med lav overflod og posttranslasjonelle modifikasjoner i levende Drosophila-embryoer via fluorescerende antistoffinjeksjon

We aim to understand how mechanical and biochemical signals correlate animal morphogenesis, including the detection and the response to forces by cells and molecules. More molecules have been discovered to be mechanosensitive, functioning differently under varying levels of tension. However, the physiological context and the function of these force-sensitive events remain largely unknown.Due to the dynamic nature of force-sensitive events, our field largely relies on high-speed fluorescence imaging and time-lapse recording to capture molecular and cellular behaviors. Many fluorescently-tagged proteins are not bright enough to be imaged, and it requires spatial-temporal resolution without significant bleach. On the other hand, traditional immunofluorescence methods can only capture a snapshot of molecular and cellular fixture after fixation.This method paves the way to dynamically track the localization of many low-abundance protein receptors of major signaling pathways, such as Notch, Wnt, and the BMP pathways. Eventually, in addition to the traditional linear signaling cascades, we can pinpoint and where the signaling events occur at the subcellular scales.

For å demonstrere fordelene ved antistoffinjeksjonsmetoden over fluorescent-tag-basert levende bildebehandling eller immunfluorescens, er det gitt to casestudier som karakteriserer den dynamiske lokaliseringen av en transmembranreseptor med lav overflod, Notch, og en type posttranslasjonell modifikasjon kalt tyrosinfosforylering i levende embryoer.
Hakksignaleringsaktivitet spiller en viktig rolle i bestemmelse av celleskjebne under embryogenese og voksen organhomeostase18,1...

Watch this Scientific Journal Video about Unveiling the Dynamics of Mechanical and Biochemical Signals in Animal Morphogenesis Research at JoVE.com

Denne protokollen beskriver den tilpassede antistoffbaserte fluorescensmerkingen og injeksjonen i tidlige Drosophila-embryoer for å muliggjøre levende avbildning av proteiner med lav overflod eller posttranslasjonelle modifikasjoner som er utfordrende å oppdage ved bruk av tradisjonelle GFP / mCherry-tag-tilnærminger.

Visualization of proteins in living cells using GFP (Green Fluorescent Protein) and other fluorescent tags has greatly improved understanding of protein ...

Vi tar sikte på å forstå hvordan mekaniske og biokjemiske signaler korrelerer dyrs morfogenese, inkludert deteksjon og respons på krefter fra celler og molekyler. Flere molekyler har blitt oppdaget å være mekanosensitive, som fungerer forskjellig under varierende spenningsnivåer. Imidlertid forblir den fysiologiske konteksten og funksjonen til disse kraftfølsomme hendelsene stort sett ukjente.På grunn av den dynamiske naturen til kraftfølsomme hendelser, er vårt felt i stor grad avhengig av høyhastighets fluorescensavbildning og time-lapse-opptak for å fange molekylær og cellulær atferd. Mange fluorescerende merkede proteiner er ikke lyse nok til å bli avbildet, og det krever romlig-temporal oppløsning uten signifikant blekemiddel. På den annen side kan tradisjonelle immunfluorescensmetoder bare fange et øyeblikksbilde av molekylær og cellulær armatur etter fiksering.Denne metoden baner vei for dynamisk å spore lokaliseringen av mange proteinreseptorer med lav overflod av viktige signalveier, som Notch, Wnt og BMP-banene. Til slutt, i tillegg til de tradisjonelle lineære signalkaskadene, kan vi finne ut og hvor signalhendelsene forekommer på subcellulære skalaer.

visualizing-low-abundance-proteins-post-translational-modifications

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Visualizing Low-Abundance Proteins and Post-Translational Modifications in Living Drosophila Embryos via Fluorescent Antibody Injection

Visualization of proteins in living cells using GFP (Green Fluorescent Protein) and other fluorescent tags has greatly improved understanding of protein localization, dynamics, and function. Compared to immunofluorescence, live imaging more accurately reflects protein localization without potential artifacts arising from tissue fixation. Importantly, live imaging enables quantitative and temporal characterization of protein levels and localization, crucial for understanding dynamic biological processes such as cell movement or division. However, a major limitation of fluorescent tagging approaches is the need for sufficiently high protein expression levels to achieve successful visualization. Consequently, many endogenously tagged fluorescent proteins with relatively low expression levels cannot be detected. On the other hand, ectopic expression using viral promoters can sometimes lead to protein mislocalization or functional alterations in physiological contexts. To address these limitations, an approach is presented that utilizes highly sensitive antibody-mediated protein detection in living embryos, essentially performing immunofluorescence without the need for tissue fixation. As proof of principle, endogenously GFP-tagged Notch receptor that is barely detectable&#160;in living embryos can be successfully visualized after antibody injection. Furthermore, this approach was adapted to visualize post-translational modifications (PTMs) in living embryos, allowing the detection of temporal changes in tyrosine phosphorylation patterns during early embryogenesis and revealing a novel subpopulation of phosphotyrosine (p-Tyr) underneath apical membranes. This approach can be modified to accommodate other protein-specific, tag-specific, or PTM-specific antibodies and should be compatible with other injection-amenable model organisms or cell lines. This protocol opens new possibilities for live imaging of low-abundance proteins or PTMs that were previously challenging to detect using traditional fluorescent tagging methods.

This protocol describes the customized antibody-based fluorescence labeling and injection into early Drosophila embryos to enable live imaging of low-abundance proteins or post-translational modifications that are challenging to detect using traditional GFP/mCherry-tag approaches.