Name: Autor em destaque: Revelando a dinâmica dos sinais mecânicos e bioquímicos na pesquisa de morfogênese animal
Uploaded: 2024-01-19T13:55:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Unveiling the Dynamics of Mechanical and Biochemical Signals in Animal Morphogenesis Research at JoVE.com

Gostaríamos de agradecer à Dra. Jennifer A. Zallen por fornecer a linha Sqh-GFP Drosophila e apoio para o desenvolvimento inicial desta técnica, e ao Dr. François Schweisguth por fornecer a linha Notch-GFP Drosophila . Este trabalho foi apoiado por financiamento da Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (32270809) para H.H.Yu, generoso apoio financeiro e pessoal da Escola de Ciências da Vida, SUSTech, e financiamento para Y. Yan da Comissão de Inovação em Ciência e Tecnologia de Shenzhen/JCYJ20200109140201722.

Os experimentos foram conduzidos de acordo com as diretrizes e aprovação da Faculdade de Ciências da Vida da Universidade SUSTech. O organismo utilizado é Drosophila melanogaster, e os genótipos são Notch-Knockin-GFP (Cromossomo X) e Sqh-sqh-GFP (Cromossomo II), generosamente fornecidos pelos laboratórios do Dr. François Schweisguth (Instituto Pasteur) e da Dra. Jennifer Zallen (Instituto Sloan Kettering), respectivamente. Embora este protocolo se concentre principalmente em aspectos de marcação de ant...

Aprimorando a visualização de proteínas com imagens ao vivo mediadas por anticorpos

<ol>
	<li>Coons, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+beginnings+of+immunofluorescence.">The beginnings of immunofluorescence.</a> Journal of Immunology (Baltimore, Md). 87, 499-503 (1961).</li><li>Arthur, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Harnessing+the+power+of+the+antibody.">Harnessing the power of the antibody.</a> The Lancet Respiratory Medicine. 4 (3), 181-182 (2016).</li><li>Im, K., Mareninov, S., Diaz, M. F. P., Yong, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biobanking,+methods+and+protocols.">Biobanking, methods and protocols.</a> Methods in Molecular Biology. 1897, 299-311 (2018).</li><li>Ragkousi, K., Gibson, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial+integrity+and+cell+division:+Concerted+cell+cycle+control.">Epithelial integrity and cell division: Concerted cell cycle control.</a> Cell Cycle. 17 (4), 399-400 (2018).</li><li>Herszterg, S., Leibfried, A., Bosveld, F., Martin, C., Bellaiche, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interplay+between+the+dividing+cell+and+its+neighbors+regulates+adherens+junction+formation+during+cytokinesis+in+epithelial+tissue.">Interplay between the dividing cell and its neighbors regulates adherens junction formation during cytokinesis in epithelial tissue.</a> Developmental Cell. 24 (3), 256-270 (2013).</li><li>Shimomura, O., Johnson, F. H., Saiga, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extraction,+purification+and+properties+of+aequorin,+a+bioluminescent+protein+from+the+luminous+hydromedusan,+aequorea.">Extraction, purification and properties of aequorin, a bioluminescent protein from the luminous hydromedusan, aequorea.</a> Journal of Cellular and Comparative Physiology. 59 (3), 223-239 (1962).</li><li>Chalfie, M., Tu, Y., Euskirchen, G., Ward, W. W., Prasher, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Green+fluorescent+protein+as+a+marker+for+gene+expression.">Green fluorescent protein as a marker for gene expression.</a> Science. 263 (5148), 802-805 (1994).</li><li>Boshart, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+very+strong+enhancer+is+located+upstream+of+an+immediate+early+gene+of+human+cytomegalovirus.">A very strong enhancer is located upstream of an immediate early gene of human cytomegalovirus.</a> Cell. 41 (2), 521-530 (1985).</li><li>Brand, A. H., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+gene+expression+as+a+means+of+altering+cell+fates+and+generating+dominant+phenotypes.">Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes.</a> Development. 118 (2), 401-415 (1993).</li><li>Rodriguez, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+growing+and+glowing+toolbox+of+fluorescent+and+photoactive+proteins.">The growing and glowing toolbox of fluorescent and photoactive proteins.</a> Trends in Biochemical Sciences. 42 (2), 111-129 (2016).</li><li>Berg, E. A., Fishman, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Labeling+antibodies+using+N+-Hydroxysuccinimide+(NHS)-fluorescein.">Labeling antibodies using N -Hydroxysuccinimide (NHS)-fluorescein.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2019 (3), (2019).</li><li>Saerens, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+universal+VHH+framework+to+graft+non-canonical+antigen-binding+loops+of+camel+single-domain+antibodies.">Identification of a universal VHH framework to graft non-canonical antigen-binding loops of camel single-domain antibodies.</a> Journal of Molecular Biology. 352 (3), 597-607 (2005).</li><li>Loncar, D., Singer, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+membrane+formation+during+the+cellularization+of+the+syncytial+blastoderm+of+Drosophila.">Cell membrane formation during the cellularization of the syncytial blastoderm of Drosophila.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 92 (6), 2199-2203 (1995).</li><li>Lye, C. M., Naylor, H. W., Sanson, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subcellular+localisations+of+the+CPTI+collection+of+YFP-tagged+proteins+in+Drosophila+embryos.">Subcellular localisations of the CPTI collection of YFP-tagged proteins in Drosophila embryos.</a> Development. 141 (20), 4006-4017 (2014).</li><li>Iordanou, E., Chandran, R. R., Blackstone, N., Jiang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNAi+interference+by+dsRNA+injection+into+Drosophila+embryos.">RNAi interference by dsRNA injection into Drosophila embryos.</a> Journal of Visualized Experiments. 50, e2477 (2011).</li><li>Figard, L., Sokac, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+cell+shape+change+in+living+Drosophila+embryos.">Imaging cell shape change in living Drosophila embryos.</a> Journal of Visualized Experiments. 49, e2503 (2011).</li><li>Campos-Ortega, J. A., Hartenstein, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+embryonic+development+of+Drosophila+melanogaster.">The embryonic development of Drosophila melanogaster.</a> , 9-102 (1997).</li><li>Ho, D. M., Artavanis-Tsakonas, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Notch-mediated+proliferation+circuitry.">The Notch-mediated proliferation circuitry.</a> Current Topics in Developmental Biology. 116, 17-33 (2016).</li><li>Kopan, R., Ilagan, X. G., Ma, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+canonical+Notch+signaling+pathway:+unfolding+the+activation+mechanism.">The canonical Notch signaling pathway: unfolding the activation mechanism.</a> Cell. 137 (2), 216-233 (2009).</li><li>Fehon, R. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+interactions+between+the+protein+products+of+the+neurogenic+loci+Notch+and+Delta,+two+EGF-homologous+genes+in+Drosophila.">Molecular interactions between the protein products of the neurogenic loci Notch and Delta, two EGF-homologous genes in Drosophila.</a> Cell. 61 (3), 523-534 (1990).</li><li>Struhl, G., Greenwald, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presenilin+is+required+for+activity+and+nuclear+access+of+Notch+in+Drosophila.">Presenilin is required for activity and nuclear access of Notch in Drosophila.</a> Nature. 398 (6727), 522-525 (1999).</li><li>Henrique, D., Schweisguth, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+Notch+signaling:+a+simple+logic+deployed+in+time+and+space.">Mechanisms of Notch signaling: a simple logic deployed in time and space.</a> Development. 146 (3), dev172148 (2019).</li><li>Trylinski, M., Mazouni, K., Schweisguth, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intra-lineage+fate+decisions+involve+of+notch+receptors+basal+to+the+midbody+in+drosophila+sensory+organ+precursor+cells.">Intra-lineage fate decisions involve of notch receptors basal to the midbody in drosophila sensory organ precursor cells.</a> Current Biology. 27 (15), 2239.e3-2247.e3 (2017).</li><li>Hunter, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+kinases+and+phosphatases:+The+Yin+and+Yang+of+protein+phosphorylation+and+signaling.">Protein kinases and phosphatases: The Yin and Yang of protein phosphorylation and signaling.</a> Cell. 80 (2), 225-236 (1995).</li><li>Glenney, J. R., Zokas, L., Kamps, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monoclonal+antibodies+to+phosphotyrosine.">Monoclonal antibodies to phosphotyrosine.</a> Journal of Immunological Methods. 109 (2), 277-285 (1988).</li><li>Hunter, T., Cooper, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidermal+growth+factor+induces+rapid+tyrosine+phosphorylation+of+proteins+in+A431+human+tumor+cells.">Epidermal growth factor induces rapid tyrosine phosphorylation of proteins in A431 human tumor cells.</a> Cell. 24 (3), 741-752 (1981).</li><li>Yu, H. H., Zallen, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Abl+and+Canoe/Afadin+mediate+mechanotransduction+at+tricellular+junctions.">Abl and Canoe/Afadin mediate mechanotransduction at tricellular junctions.</a> Science. 370 (6520), eaba5528 (2020).</li><li>Martin, A. C., Kaschube, M., Wieschaus, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pulsed+contractions+of+an+actin&#8211;myosin+network+drive+apical+constriction.">Pulsed contractions of an actin&#8211;myosin network drive apical constriction.</a> Nature. 457 (7228), 495-499 (2009).</li></ol>

Este procedimento apresentado descreve o método especializado de marcação por fluorescência com anticorpos personalizados e subsequente injeção em embriões de Drosophila em estágio inicial. Esta técnica facilita a visualização em tempo real de proteínas ou modificações pós-traducionais que existem em baixas quantidades e são tipicamente difíceis de observar através de métodos convencionais de marcação GFP/mCherry.
Deve-se ter cautela ao estender esse método para ...

A imunofluorescência é uma técnica fundamental da biologia celular moderna originalmente desenvolvida por Albert Coons, que permite a detecção de moléculas em seus compartimentos celulares nativos e a caracterização das composições moleculares de organelas ou máquinassubcelulares1. Aliada às manipulações genéticas, a imunofluorescência ajuda a estabelecer o conceito hoje bem aceito de que a localização de proteínas é essencial para sua função2. Além de anticorpos primários específicos e corantes fluorescentes brilhantes, o sucesso dessa técnica depende de um processo preliminar denominado fixação e permeabilização, que preserva morfologias celulares, imobiliza antígenos e aumenta a acessibilidade dos anticorpos nos compartimentos intracelulares. Inevitavelmente, o processo de fixação e permeabilização mataria as células e encerraria todos os processos biológicos3. Portanto, a imunofluorescência fornece apenas instantâneos da jornada de vida das proteínas. Entretanto, muitos processos biológicos, como migração e divisão celular, são de natureza dinâmica, exigindo investigação do comportamento proteico de forma espacial-temporalmente resolvida 4,5.
Para examinar a dinâmica de proteínas em organismos vivos, métodos de imagem vivos baseados em proteínas fluorescentes codificadas geneticamente, como a proteína fluorescente verde (GFP)6 e microscópios confocais de alta velocidade, foram desenvolvidos. Resumidamente, a proteína de interesse pode ser geneticamente manipulada para ser fundida com GFP7 e, em seguida, expressa ectopicamente a partir de promotores virais ou de leveduras, como citomegalovírus (CMV)8 ou sequência de ativação a montante (UAS)9. Como a GFP é de natureza autofluorescente, não são necessários anticorpos acoplados a fluoróforos para revelar a localização das proteínas-alvo, o que ignora a necessidade de processos preliminares de fixação ou permeabilização. Nas últimas duas décadas, etiquetas fluorescentes abrangendo todo o espectro de comprimento de onda foram desenvolvidas10, permitindo imagens ao vivo multicoloridas de várias proteínas-alvo ao mesmo tempo. No entanto, em comparação com corantes fluorescentes quimicamente modificados, como AlexaFluor ou ATTO, a autofluorescência dessas proteínas fluorescentes codificadas geneticamente é relativamente fraca e instável quando expressa a partir de promotores endógenos, especialmente durante imagens ao vivo em escalas de tempo mais longas10. Embora essa deficiência possa ser atenuada pela superexpressão de proteínas-alvo marcadas fluorescentemente, muitas com atividades enzimáticas, como quinases e fosfatases, interrompem severamente os processos biológicos normais se não forem expressas em níveis fisiológicos.
Este protocolo apresenta um método que permite a iluminação do alvo fotoestável baseada em anticorpos em uma configuração de imagem ao vivo, permitindo essencialmente a imunofluorescência sem o processo de fixação ou permeabilização (Figura 1). Através de uma reação de amina primária simples baseada no NHS11, pode-se conjugar corantes fluorescentes como AlexaFluor 488 ou 594 com essencialmente qualquer anticorpo primário ou nanocorpo GFP/HA/Myc12. Aproveitando uma característica de desenvolvimento de que todas as células embrionárias de Drosophila compartilham um citoplasma comum durante o estágio de sincício13, pode-se obter ligação e iluminação antigênica em embriões inteiros após a injeção de anticorpos conjugados com corante. Com a expansão de bibliotecas de proteínas marcadas endogenamente disponíveis em Drosophila e outros sistemas modelo14, este método pode potencialmente ampliar as aplicações dessas bibliotecas revelando a dinâmica de proteínas marcadas fluorescentemente de baixa abundância e outras proteínas marcadas não fluorescentemente (HA/Myc-tagged) em tecidos vivos.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>&#160;A620014&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 594 Antibody Labeling Kit</td>
			<td>Invitrogen&#160;</td>
			<td>A20185</td>
			<td>Purification column from step 1.6 is included in this kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biological Microscope</td>
			<td>SOPTOP</td>
			<td>EX20</td>
			<td>Eyepiece lens: PL 10X/20. Objective lens: 10x/0.25</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bleach</td>
			<td>Clorox&#174;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate Glass Capillaries</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>TW100F-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5245</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Strainer</td>
			<td>FALCON</td>
			<td>352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Desiccation chamber&#160;</td>
			<td>LOCK&#38;LOCK</td>
			<td>HSM8200</td>
			<td>320ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting Microscope</td>
			<td>Mshot</td>
			<td>MZ62</td>
			<td>Eyepiece lens: WF10X/22mm.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double-sided Tape</td>
			<td>Scotch</td>
			<td>665</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Super Tweezer</td>
			<td>VETUS</td>
			<td>ST-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand&#8482; Cover Glasses: Rectangles</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>12-545F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand&#8482; Superfrost&#8482; Plus Microscope Slides</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>12-550-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forcep</td>
			<td>VETUS</td>
			<td>33A-SA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Halocarbon oil 27</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H8773-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Halocarbon oil 700</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H8898-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heptane</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H2198-1L</td>
			<td>Heptane glue is made of double-sided tape immersed in heptane</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dehydration reagent&#160;</td>
			<td>TOKAI</td>
			<td>1-7315-01</td>
			<td>Fill to 90% volume of the dessication chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manual Micromanipulator</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>M3301R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette puller</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>PUL-1000</td>
			<td>Procedure: step 1, Heat: 290, Force:300, Distance:1.00, Delay:50. 
			Step 2, Heat: 290, Force:300, Distance:2.21, Delay:50&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pneumatic picopump</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>PV 830</td>
			<td>Eject: 20 psi;&#160; Range: 100ms; Duration: timed</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PY20</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>SC-508</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Square petri dishes</td>
			<td>Biosharp</td>
			<td>BS-100-SD</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFP nanobody</td>
			<td>Chromotek</td>
			<td>gt</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualizing low-abundance proteins and post-translational modifications in living drosophila embryos via fluorescent antibody injection

A visualização de proteínas em células vivas usando GFP (Green Fluorescent Protein) e outras etiquetas fluorescentes melhorou muito a compreensão da localização, dinâmica e função de proteínas. Em comparação com a imunofluorescência, a imagem viva reflete com mais precisão a localização de proteínas sem potenciais artefatos decorrentes da fixação tecidual. É importante ressaltar que imagens ao vivo permitem a caracterização quantitativa e temporal dos níveis e localização de proteínas, cruciais para a compreensão de processos biológicos dinâmicos, como movimento ou divisão celular. No entanto, uma das principais limitações das abordagens de marcação fluorescente é a necessidade de níveis de expressão proteica suficientemente altos para alcançar uma visualização bem-sucedida. Consequentemente, muitas proteínas fluorescentes marcadas endogenamente com níveis de expressão relativamente baixos não podem ser detectadas. Por outro lado, a expressão ectópica usando promotores virais pode, por vezes, levar à má localização de proteínas ou alterações funcionais em contextos fisiológicos. Para abordar essas limitações, é apresentada uma abordagem que utiliza a detecção de proteínas mediadas por anticorpos altamente sensíveis em embriões vivos, essencialmente realizando imunofluorescência sem a necessidade de fixação tecidual. Como prova de princípio, o receptor Notch marcado com GFP endogenamente que é pouco detectável em embriões vivos pode ser visualizado com sucesso após a injeção de anticorpos. Além disso, essa abordagem foi adaptada para visualizar modificações pós-traducionais (MPTs) em embriões vivos, permitindo a detecção de mudanças temporais nos padrões de fosforilação da tirosina durante o início da embriogênese e revelando uma nova subpopulação de fosfotirosina (p-Tyr) sob membranas apicais. Essa abordagem pode ser modificada para acomodar outros anticorpos específicos para proteínas, específicos para tags ou específicos para PTM e deve ser compatível com outros organismos modelo ou linhagens celulares passíveis de injeção. Este protocolo abre novas possibilidades para imagens ao vivo de proteínas de baixa abundância ou PTMs que anteriormente eram difíceis de detectar usando métodos tradicionais de marcação fluorescente.

Immunofluorescence is a cornerstone technique of modern cell biology originally developed by Albert Coons, which enables the detection of molecules at their native cellular compartments and characterization of the molecular compositions of subcellular organelles or machineries1. Coupled with genetic manipulations, immunofluorescence helps establish the now well-accepted concept that protein localization is essential for its function2. Aside from specific primary antibodies and bright fluorescent dyes, the success of this technique relies on a preliminary process named fixation and permeabilization, which preserves cellular morphologies, immobilizes antigens, and increases the accessibility of antibodies into intracellular compartments. Inevitably, the fixation and permeabilization process would kill cells and terminate all biological processes3. Therefore, immunofluorescence only provides snapshots of the life journey of proteins. However, many biological processes such as cell migration and divisions are dynamic in nature, requiring investigation of protein behaviors in a spatial-temporally resolved manner4,5.
To examine protein dynamics in living organisms, live imaging methods based on genetically encoded fluorescent proteins such as green fluorescent protein (GFP)6 and high-speed confocal microscopes have been developed. Briefly, the protein of interest can be genetically manipulated to be fused with GFP7, and then ectopically expressed from viral or yeast promoters such as cytomegalovirus (CMV)8 or upstream activation sequence (UAS)9. Because GFP is autofluorescent in nature, no fluorophore-coupled antibodies are required to reveal the localization of target proteins, which bypasses the necessity of preliminary processes of fixation or permeabilization. Over the last two decades, fluorescent tags spanning the whole spectrum of wavelength have been developed10, enabling multi-color live imaging of several target proteins at the same time. However, compared to chemically engineered fluorescent dyes such as AlexaFluor or ATTO, the autofluorescence of these genetically encoded fluorescent proteins is relatively weak and unstable when expressed from endogenous promoters, especially during live imaging over longer time scales10. While this shortfall can be mitigated by over-expressing fluorescently tagged target proteins, many with enzymatic activities such as kinases and phosphatases severely disrupt normal biological processes if not expressed at physiological levels.
This protocol presents a method that enables photostable antibody-based target illumination in a live image setup, essentially allowing immunofluorescence without the process of fixation or permeabilization (Figure 1). Through a simple NHS-based primary amine reaction11, one can conjugate fluorescent dyes such as AlexaFluor 488 or 594 with essentially any primary antibody or GFP/HA/Myc nanobody12. Taking advantage of a developmental feature that all Drosophila embryonic cells share a common cytoplasm during the syncytium stage13, one can achieve antigen binding and illumination across entire embryos after the injection of dye-conjugated antibodies. With expanding libraries of endogenously tagged proteins available in Drosophila and other model systems14, this method can potentially broaden applications of these libraries by revealing dynamics of low-abundance fluorescently tagged proteins and other non-fluorescently tagged (HA/Myc-tagged) proteins in living tissues.

Autor em destaque: Revelando a dinâmica dos sinais mecânicos e bioquímicos na pesquisa de morfogênese animal 

Visualizando Proteínas de Baixa Abundância e Modificações Pós-Traducionais em Embriões Vivos de Drosophila Via Injeção de Anticorpos Fluorescentes

We aim to understand how mechanical and biochemical signals correlate animal morphogenesis, including the detection and the response to forces by cells and molecules. More molecules have been discovered to be mechanosensitive, functioning differently under varying levels of tension. However, the physiological context and the function of these force-sensitive events remain largely unknown.Due to the dynamic nature of force-sensitive events, our field largely relies on high-speed fluorescence imaging and time-lapse recording to capture molecular and cellular behaviors. Many fluorescently-tagged proteins are not bright enough to be imaged, and it requires spatial-temporal resolution without significant bleach. On the other hand, traditional immunofluorescence methods can only capture a snapshot of molecular and cellular fixture after fixation.This method paves the way to dynamically track the localization of many low-abundance protein receptors of major signaling pathways, such as Notch, Wnt, and the BMP pathways. Eventually, in addition to the traditional linear signaling cascades, we can pinpoint and where the signaling events occur at the subcellular scales.

Para demonstrar as vantagens do método de injeção de anticorpos sobre imagens ao vivo baseadas em etiquetas fluorescentes ou imunofluorescência, são fornecidos dois estudos de caso que caracterizam a localização dinâmica de um receptor transmembrana de baixa abundância, Notch, e um tipo de modificação pós-traducional chamada fosforilação de tirosina em embriões vivos.
A atividade de sinalização da fossa desempenha um papel importante na determinação do destino celular durant...

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Este protocolo descreve a marcação e a injeção de fluorescência personalizadas baseadas em anticorpos em embriões iniciais de Drosophila para permitir imagens vivas de proteínas de baixa abundância ou modificações pós-traducionais que são difíceis de detectar usando abordagens tradicionais de GFP/mCherry-tag.

Visualization of proteins in living cells using GFP (Green Fluorescent Protein) and other fluorescent tags has greatly improved understanding of protein ...

Nosso objetivo é entender como sinais mecânicos e bioquímicos correlacionam a morfogênese animal, incluindo a detecção e a resposta a forças por células e moléculas. Descobriu-se que mais moléculas são mecanossensíveis, funcionando de forma diferente sob diferentes níveis de tensão. No entanto, o contexto fisiológico e a função desses eventos sensíveis à força permanecem em grande parte desconhecidos.Devido à natureza dinâmica dos eventos sensíveis à força, nosso campo depende amplamente de imagens de fluorescência de alta velocidade e registro de lapso de tempo para capturar comportamentos moleculares e celulares. Muitas proteínas marcadas fluorescentemente não são brilhantes o suficiente para serem fotografadas, e requerem resolução espaço-temporal sem alvejamento significativo. Por outro lado, os métodos tradicionais de imunofluorescência só podem capturar um instantâneo da fixação molecular e celular após a fixação.Este método abre caminho para rastrear dinamicamente a localização de muitos receptores de proteína de baixa abundância das principais vias de sinalização, como Notch, Wnt e as vias BMP. Eventualmente, além das tradicionais cascatas de sinalização linear, podemos identificar e onde os eventos de sinalização ocorrem nas escalas subcelulares.

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Visualizing Low-Abundance Proteins and Post-Translational Modifications in Living Drosophila Embryos via Fluorescent Antibody Injection

Visualization of proteins in living cells using GFP (Green Fluorescent Protein) and other fluorescent tags has greatly improved understanding of protein localization, dynamics, and function. Compared to immunofluorescence, live imaging more accurately reflects protein localization without potential artifacts arising from tissue fixation. Importantly, live imaging enables quantitative and temporal characterization of protein levels and localization, crucial for understanding dynamic biological processes such as cell movement or division. However, a major limitation of fluorescent tagging approaches is the need for sufficiently high protein expression levels to achieve successful visualization. Consequently, many endogenously tagged fluorescent proteins with relatively low expression levels cannot be detected. On the other hand, ectopic expression using viral promoters can sometimes lead to protein mislocalization or functional alterations in physiological contexts. To address these limitations, an approach is presented that utilizes highly sensitive antibody-mediated protein detection in living embryos, essentially performing immunofluorescence without the need for tissue fixation. As proof of principle, endogenously GFP-tagged Notch receptor that is barely detectable&#160;in living embryos can be successfully visualized after antibody injection. Furthermore, this approach was adapted to visualize post-translational modifications (PTMs) in living embryos, allowing the detection of temporal changes in tyrosine phosphorylation patterns during early embryogenesis and revealing a novel subpopulation of phosphotyrosine (p-Tyr) underneath apical membranes. This approach can be modified to accommodate other protein-specific, tag-specific, or PTM-specific antibodies and should be compatible with other injection-amenable model organisms or cell lines. This protocol opens new possibilities for live imaging of low-abundance proteins or PTMs that were previously challenging to detect using traditional fluorescent tagging methods.

This protocol describes the customized antibody-based fluorescence labeling and injection into early Drosophila embryos to enable live imaging of low-abundance proteins or post-translational modifications that are challenging to detect using traditional GFP/mCherry-tag approaches.