791 Views
•
14:44 min
•
June 7th, 2024
DOI :
June 7th, 2024
•0:05
Introduction
0:35
Preparation of Facilities and Materials
2:27
Preparation of Growth Media
3:52
Field Collection
5:38
Sporulation
7:50
Inoculation
8:35
Rearing Conditions
9:05
Monitoring
10:58
Maintenance
12:02
Deployment
12:45
Results
14:21
Conclusion
Transcript
Kelpskove står over for hidtil usete tab på grund af klimadrevne miljømæssige stressfaktorer og skift i trofisk dynamik. Denne video illustrerer en protokol og værktøjer til dyrkning af kæmpetang, Macrocystis pyrifera, ved hjælp af grøn grusteknik, og giver en værdifuld ressource til yderligere forsøg for at løse succeserne og begrænsningerne ved denne metode i forskellige indstillinger. Kelpdyrkningsanlæg skal være i stand til at kontrollere temperaturer mellem 10 og 15 grader Celsius, give fuldspektret lys mellem nul og 180 mikromolfotoner pr. meter kvadratisk sekund og filtreret beluftning.
Inkubatorsystemer med indbygget stikkontakt eller en adgangsport til ledninger og slanger kan tilpasses med lys og luftkilde. Hvis et inkubatorsystem ikke er inden for projektets omfang, budget eller tilsigtede skala, kan vandbade hærdet af enten køligt naturligt havvand eller en køler anvendes. Opdrætstemperaturer er sted- og sæsonspecifikke.
Placer et termometer i vækstmedier, eller brug en temperaturpistol for at sikre, at temperaturen er mellem 10 og 18 grader Celsius. Indstil fuldspektret lys til en 12 timers lys, 12 timers mørk fotoperiode ved hjælp af timingindstillingerne på lyskilden eller ved at tilslutte lyskilden til en timer med en programmerbar cyklus. Mål lysintensiteten med en PAR-kvantemåler under overfladen nær gruset, og juster ved hjælp af en dæmpbar lyskilde eller ved at lægge net over lyskilden.
Luftning tilsættes til kulturer ved brug af luftpumper. Brug filtre med en porestørrelse på 02 mikrometer for at reducere luftbåren bakteriel forurening. Materialer og stationer skal steriliseres og forberedes på forhånd.
Se teksten for detaljer. Grus, der anvendes til såning, skal have en struktureret eller let pitted overflade, da gametofytter er mere tilbøjelige til at blive bevaret på underlag med høj rugositet. Skrub og skyl grus, indtil vandet løber klart for at fjerne støv eller snavs.
Læg grus i blød i en 10% fortyndet blegemiddelopløsning i mindst 24 timer, og skyl med filtersteriliseret havvand. Beregn mængden af filtersteriliseret havvand, der er nødvendigt for at opdatere kulturbeholdere hver uge, og planlæg denne filtrerings- og steriliseringsopgave i overensstemmelse hermed. Store partier filtersteriliseret havvand kan opbevares i mørke beholdere i op til seks måneder ved otte til 10 grader Celsius.
Hvis køling ikke er tilgængelig, skal den opbevares i et mørkt, køligt område. Filtrer vand ved hjælp af et vakuumfiltreringssystem med en porestørrelse på 55 til en mikrometer. Sluk for vakuumkilden, før alt vandet trækkes igennem for at undgå at beskadige filteret, og hæld det filtrerede vand i en dedikeret steril beholder.
For større mængder kan et gennemstrømningsfiltreringssystem anvendes. Kør for eksempel havvand gennem en serie på tre plisserede filtre, 10 mikrometer, fem mikrometer og en mikrometer, arrangeret fra største til mindste porestørrelse. Dette gennemstrømningssystem er forbundet til et akvarium UV-lys.
Steriliser filtreret havvand ved hjælp af UV- og/eller autoklaveringsmetoder. Berigelse af filtersteriliseret havvand med næringsstoffer og vitaminer er afgørende for kelpvækst. Almindelige berigelsesmuligheder omfatter Provasoli-berigede havvandsmedier og F/2-medier.
Se teksten for detaljer. Få de nødvendige tilladelser til kelpvævsopsamling, der opfylder lokale love og regler. Ved scuba skal du vælge tre til fem sporofylblade fra 10 til 15 frugtbare Macrocystis pyrifera-individer med synlig sori adskilt to til fem meter fra hinanden.
Vælg rene og intakte sporofyler, hvis det er muligt med ringe eller ingen tilsmudsning eller nedbrydning. Opbevar sporofylblade separat i henhold til forældrepersonen fra dette tidspunkt. Sporofyler vokser i et tæt nederdel ved bunden over holdfast af den voksne kelp og kan identificeres ved deres mangel på gasfyldte pneumatocyster.
Transport sporofylblade i mørke opsamlingsposer for at undgå overeksponering for sollys fyldt minimalt med havvand fra stedet for at holde knivene våde og opbevares i kølere ved ca. 12 grader Celsius indtil ankomst til dyrkningsområdet. Sørg for, at prøverne ikke er i direkte kontakt med is. Sporofyler kan sendes til eller fra andre steder.
Skyl sporofyler med filtreret steriliseret havvand. Wrap blade opsamlet fra en enkelt Macrocystis pyrifera person i fugtige papirhåndklæder gennemblødt i filtreret steriliseret havvand og igen i aluminiumsfolie for at undgå lysindtrængning og yderligere udtørring. Denne opbevaringsmetode er almindeligt kendt som burrito-metoden.
Placer disse pakker i en køler med is med en beskyttende barriere, såsom genanvendt bobleplast eller pap. Forbered køleren til forsendelse natten over, og sørg for, at der er nogen til rådighed til at modtage forsendelsen, og placer pakkerne under køleforhold. Opbevar eventuelt sporofyler i 12 til 48 timer under nedkølede forhold, hvilket tilskynder til sporfrigivelse fra sorusvæv.
For at opbevare skal du bruge burrito-metoden. Hvis det eventuelt opbevares, skal du finde tegn på delvis sporulation på papirhåndklæderne, der indikerer tilstedeværelse af frugtbart sorusvæv. Sorusvæv er ofte lidt hævet og mørkere i farven end omgivende væv.
Vælg modent sorusvæv, og skær i 25 centimeter firkantede sektioner ved hjælp af steril saks. Vælg en til to rene sori-sektioner fra 10 til 15 individuelle kelpforældre for at fremme genetisk mangfoldighed. For at rengøre, skrub forsigtigt begge sider af sorusvævet i en retning kun med en steril gasbind dæmpet med filtersteriliseret havvand.
Skrab om nødvendigt sorusvævet forsigtigt med et sterilt barberblad. Nedsænk sori-sektionen i et ferskvandsbad i 30 sekunder til et minut, og skyl med filtersteriliseret havvand. Nedsænk hver sori-sektion i filtersteriliseret havvand hærdet til 10 til 15 grader Celsius i et sterilt 50 ml Falcon-rør.
Alternativt kan sori-sektioner sporulere i en enkelt steril beholder. Placer rør ved fire til 12 grader Celsius i mørke for at sporulere i højst fire timer. Hvis der ikke er køleskab til rådighed, skal det opbevares køligt i svagt lys.
Ved hjælp af et sammensat mikroskop og hæmocytometer observeres sporetætheden af tre til fire prøver hvert 30. minut op til fire timer. Skift pipettespidser mellem prøverne. Hvis tætheder er mindst 10.000 sporer pr. Milliliter, skal du gå videre til næste trin.
Hvis en sori-sektion ikke producerer sporer efter fire timer, kasseres prøven. Sporer kan slå sig ned inden for timer efter frigivelse, men kan observeres svømme i en cirkulær bevægelse. Fjern hver af sori-sektionerne fra deres Falcon-rør.
Kombiner de resulterende sporeopløsninger i en enkelt steriliseret beholder og kvantificer den endelige kombinerede densitet. Beregn det endelige volumen sporeopløsning, der er nødvendigt til podning for en endelig koncentration på 500 til 1.000 sporer pr. Milliliter i kulturbeholdere. Se teksten for detaljer.
Placer sterile glasglas i kulturbeholdere for at overvåge tangudvikling. Inkluder mindst 30 dias fordelt tilfældigt på tværs af kulturbeholdere for tilstrækkelig overvågning. Pod det beregnede volumen sporeopløsning i dyrkningsbeholderen ved hjælp af en steril pipettespids, der indeholder substrater nedsænket i vækstmedier.
Luk beholderen, og rør forsigtigt for at fordele sporer. Placer beholderen i dit kultursystem. Indstil din temperatur mellem 10 og 15 grader Celsius baseret på temperaturen på dit implementeringssted.
Fuldspektret lys til vandplanter er indstillet til en 12 timers lys, 12 timers mørk cyklus med lysintensiteter mellem nul og 180 mikromol foton pr. Meter kvadratisk sekund. Se teksten for en tidslinje over specifikke lysforhold. Efter en dag skal du give let beluftning med en filtreret luftkilde.
Overvåg mindst to tilfældige glasglas dagligt eller hver anden dag i de første to uger for at vurdere udviklingen. Efter to uger skal du overvåge mindst to tilfældige glasglas en til to gange ugentligt for sund vækst og forurening, indtil sporofytter når en til to centimeter i størrelse. For at overvåge skal du håndtere diaset med steriliseret pincet og placere det i en ren petriskål, der indeholder nok steriliseret havvand til at nedsænke glasrutschebanen.
Returner ikke glasglas til kulturer efter fjernelse for at undgå krydskontaminering. Brug et sammensat eller omvendt mikroskop ved en forstørrelse på 40 til 400x for at observere tang i det tidlige stadium. Udviklingen forventes at følge følgende tidslinje.
Afregnede sporer observeres ved nul til en dag. Sporer kan spire inden for få timer, demonstreret ved dannelsen af et kimrør. Spiring observeres typisk efter en til to dage.
Tidlige gametofytter observeres typisk efter en til fire dage. Gametogenese, den proces, hvorved celler gennemgår opdeling og differentiering for at danne mandlige og kvindelige kønsceller, observeres typisk inden for de første to uger. Kvindelige celler er fem til syv gange større end mænd.
Mandlige gametofytter vokser tynde trådformede grene, mens kvinder er mere runde eller ovale i form. Kvinder producerer typisk æg inden for to til tre uger. Sperm frigivet fra mændene befrugter æggene, som udvikler sig til embryonale sporofytter.
Sporofytter observeres typisk inden for to til fire uger. Zygoten gennemgår hurtig celledeling, hvilket resulterer i vækst af en til to centimeter blade inden for cirka seks til otte uger. Skift hver uge vækstmedier for at genopbygge nødvendige næringsstoffer og mineraler til Macrocystis pyrifera vækst.
Afkøl friske vækstmedier til den passende temperatur. Sørg for, at vækstmedier ikke overstiger 15 grader Celsius under denne proces. Sifonmedier ud af dine dyrkningsbeholdere for at undgå forstyrrelse af frøede underlag.
Lad mediet tømmes, indtil beholderen er næsten tom. Opdater medier med det samme for at minimere udtørring. Vip vækstbeholdere lidt ved genopfyldning, så mediet løber ned ad siden af dyrkningsbeholderen for minimalt at forstyrre underlagene.
Omarranger tilfældigt beholder- eller karpositioner under ugentlige medieskift for at tage højde for forskelle i lysindstråling. Se teksten til en kalender for at spore aktiviteter og forventninger til makrocystiskulturer. Det angiver tidspunktet for justeringer af lys og beluftning samt ugentlige medieændringer.
Efter seks til otte ugers laboratoriedyrkning er unge sporofytter en til to centimeter lange og klar til implementering. Opdater vækstmedier i kulturbeholdere 24 timer før udrulning. Få de nødvendige tilladelser til grusanvendelse, der opfylder lokale love og regler.
Transport grønt grus i op til seks timer i en skyggefuld køler. Implementeringen skal være tidsindstillet for at undgå det mest direkte sollys. Brug en skyggefuld struktur på båden for at undgå direkte sol under implementeringsprocessen.
Spred forsigtigt grønt grus fra overfladen på revet nedenfor eller via dykning, når du prøver på nye steder og i små skalaer. Den grønne grusrestaureringsteknik er stadig i den akademiske fase med begrænsede overlevelsesdata for andre arter og endnu ingen data for Macrocystis pyrifera. Ikke desto mindre er succes på området blevet observeret i en nylig pilotundersøgelse, indikeret ved haptera vedhæftning til omgivende substrat og unge kelper, der vokser op til 1,2 meter efter to måneder i marken.
Ved hjælp af feltindsamling og laboratorievedligeholdelse, der er skitseret i denne protokol, dyrkede vi to forskellige donortangpopulationer ved 12 grader Celsius og 20 grader Celsius for at belyse temperaturafhængige virkninger på udviklingen af mikrostadier af Macrocystis pyrifera gennem tiden. Efter 24 dage blev gametofytter talt fra mikroskopbilleder. Temperaturen havde en effekt for den køligere K1-population, men ikke for K4-populationen, hvilket tyder på en mulig adaptiv divergens i termiske toleranceegenskaber.
Dette understreger betydningen af stedspecifikke opdrætstemperaturer. Efter 32 dage blev synlige sporofytter talt på hvert glasglas. Temperaturen havde en lignende effekt for både K1- og K4-populationer.
Prøver opdrættet ved 20 grader Celsius voksede få synlige sporofytter sammenlignet med dem, der blev opdrættet ved 12 grader Celsius. Dette resultat tyder på, at sporofytproduktion er mere følsom over for temperatur end gametofytstadiet, og at dyrkningstemperaturer ikke må overstige 15 grader Celsius for at opnå sporofytudvikling, som beskrevet i protokollen. Med denne visualiserede protokol håber vi at tilskynde til yderligere forsøg med den grønne grusmetode for at opskalere restaurering af værdifulde undersøiske kelpskove af forskere og forvaltere globalt.
Held og lykke på din grønne grusrejse med Macrocystis pyrifera.
Denne protokol beskriver feltindsamling og regelmæssig laboratorievedligeholdelse af substrater podet med baldakindannende kæmpetang til brug i restaureringsforsøg for at imødegå succesen og begrænsningerne ved 'grøn grus' -teknikken i markindstillinger.
Explore More Videos
ABOUT JoVE
Copyright © 2024 MyJoVE Corporation. All rights reserved