Veldverzameling en laboratoriumonderhoud van bladerdakvormende reuzenkelp om herstel te vergemakkelijken

Kelpbossen worden geconfronteerd met ongekende verliezen als gevolg van klimaatgedreven milieustressoren en verschuivingen in trofische dynamiek. Deze video illustreert een protocol en hulpmiddelen voor het kweken van reuzenkelp, Macrocystis pyrifera, met behulp van de groene grindtechniek, en biedt een waardevolle bron voor verdere proeven om de successen en beperkingen van deze methode in verschillende omgevingen aan te pakken. Kelpkweekfaciliteiten moeten in staat zijn om temperaturen tussen 10 en 15 graden Celsius te regelen, licht met een volledig spectrum te leveren tussen nul en 180 micromolfotonen per vierkante meter per seconde en gefilterde beluchting.

Incubatorsystemen met een ingebouwde uitlaat of een toegangspoort voor draden en slangen kunnen worden aangepast met lampen en een luchtbron. Als een incubatorsysteem niet binnen de reikwijdte, het budget of de beoogde schaal van het project valt, kunnen waterbaden worden gebruikt die zijn getemperd door koel natuurlijk zeewater of een koelmachine. De opfoktemperaturen zijn plaats- en seizoensgebonden.

Plaats een thermometer in groeimedia, of gebruik een temperatuurpistool om ervoor te zorgen dat de temperatuur tussen de 10 en 18 graden Celsius ligt. Stel lampen met volledig spectrum in op een lichtperiode van 12 uur en een donkere fotoperiode van 12 uur met behulp van de timinginstellingen op de lichtbron of door de lichtbron aan te sluiten op een timer met een programmeerbare cyclus. Meet de lichtintensiteit met een PAR-kwantummeter onder het oppervlak in de buurt van het grind en pas deze aan met behulp van een dimbare lichtbron of door gaas over de lichtbron te leggen.

Beluchting wordt toegevoegd aan culturen met behulp van luchtpompen. Gebruik filters met een poriegrootte van 02 micrometer om bacteriële besmetting in de lucht te verminderen. Materialen en stations moeten van tevoren worden gesteriliseerd en voorbereid.

Zie tekst voor details. Grind dat voor het zaaien wordt gebruikt, moet een gestructureerd of licht ontpit oppervlak hebben, omdat gametofyten eerder worden vastgehouden op substraten met een hoge ruwheid. Schrob en spoel grind totdat het water helder is om stof of vuil te verwijderen.

Week grind minimaal 24 uur in een 10% verdunde bleekoplossing en spoel af met gefilterd zeewater. Bereken het volume gefilterd zeewater dat nodig is om kweekcontainers elke week te verversen en plan deze filtratie- en sterilisatietaak dienovereenkomstig. Grote partijen gefilterd zeewater kunnen tot zes maanden in donkere containers worden bewaard bij acht tot 10 graden Celsius.

Als er geen koeling beschikbaar is, bewaar deze dan op een donkere, koele plaats. Filter water met behulp van een vacuümfiltratiesysteem met een poriegrootte van 55 tot één micrometer. Schakel de vacuümbron uit voordat al het water erdoorheen is getrokken om beschadiging van het filter te voorkomen, en giet het gefilterde water in een speciale steriele container.

Voor grotere volumes kan een doorstroomfiltratiesysteem worden gebruikt. Laat bijvoorbeeld zeewater door een reeks van drie geplooide filters lopen, 10 micrometer, vijf micrometer en één micrometer, gerangschikt van de grootste naar de kleinste poriegrootte. Dit doorstroomsysteem is aangesloten op een UV-lamp van het aquarium.

Steriliseer gefilterd zeewater met behulp van UV- en/of autoclaafmethoden. Verrijking van filtergesteriliseerd zeewater met voedingsstoffen en vitamines is van cruciaal belang voor de groei van kelp. Veel voorkomende verrijkingsopties zijn met Provasoli verrijkte zeewatermedia en F/2-media.

Zie tekst voor details. Verkrijg de nodige vergunningen voor het verzamelen van kelpweefsel die voldoen aan de lokale wet- en regelgeving. Selecteer bij duiken drie tot vijf sporofylbladen van 10 tot 15 vruchtbare Macrocystis pyrifera-individuen met zichtbare sori op een afstand van twee tot vijf meter van elkaar.

Selecteer indien mogelijk schone en intacte sporofyllen met weinig tot geen vervuiling of degradatie. Bewaar sporofylmessen vanaf dit moment apart volgens de ouderpersoon. Sporofyllen groeien in een dichte rok aan de basis boven het houvast van de volwassen kelp en zijn te herkennen aan hun gebrek aan met gas gevulde pneumatocysten.

Vervoer sporofylbladen in donkere opvangzakken om overmatige blootstelling aan zonlicht te voorkomen, minimaal gevuld met zeewater van de locatie om messen nat te houden en opgeslagen in koelers bij ongeveer 12 graden Celsius tot aankomst in de kweekruimte. Zorg ervoor dat monsters niet in direct contact komen met ijs. Sporofyllen kunnen naar of van andere locaties worden verzonden.

Spoel sporofyllen af met gefilterd gesteriliseerd zeewater. Wikkel messen verzameld van een enkele Macrocystis pyrifera-persoon in vochtige papieren handdoeken gedrenkt in gefilterd gesteriliseerd zeewater en opnieuw in aluminiumfolie om lichtpenetratie en extra uitdroging te voorkomen. Deze manier van bewaren is algemeen bekend als de burrito-methode.

Plaats deze pakketten in een koelbox met ijs met een beschermende barrière, zoals gerecycled noppenfolie of karton. Maak de koeler klaar voor verzending 's nachts en zorg ervoor dat er iemand beschikbaar is om de zending in ontvangst te nemen en de pakketten in gekoelde omstandigheden te plaatsen. Bewaar sporofyllen eventueel 12 tot 48 uur in gekoelde omstandigheden, wat het vrijkomen van sporen uit sourweefsel bevordert.

Gebruik de burrito-methode om te bewaren. Indien optioneel bewaard, zoek dan bewijs van gedeeltelijke sporulatie op de papieren handdoeken die wijzen op de aanwezigheid van vruchtbaar sorusweefsel. Sorusweefsel is vaak iets verhoogd en donkerder van kleur dan omringend weefsel.

Selecteer rijp sorusweefsel en knip met een steriele schaar in vierkante secties van 25 centimeter. Selecteer een tot twee schone sori-secties van 10 tot 15 individuele kelpouders om genetische diversiteit te bevorderen. Om schoon te maken, schrobt u beide zijden van het sorusweefsel voorzichtig in één richting, slechts met een steriel gaasje dat is bevochtigd met gefilterd zeewater.

Schraap indien nodig het sorusweefsel voorzichtig af met een steriel scheermesje. Dompel het sorigedeelte 30 seconden tot een minuut onder in een zoetwaterbad en spoel het af met gefilterd zeewater. Dompel elke sori-sectie onder in met filters gesteriliseerd zeewater dat is getemperd tot 10 tot 15 graden Celsius in een steriele Falcon-buis van 50 milliliter.

Als alternatief kunnen sorisecties sporuleren in een enkele steriele container. Plaats buisjes bij vier tot 12 graden Celsius in het donker om maximaal vier uur te sporuleren. Als er geen koelkast beschikbaar is, bewaar deze dan in een koele ruimte met weinig licht.

Observeer met behulp van een samengestelde microscoop en hemocytometer elke 30 minuten tot vier uur de sporendichtheid van drie tot vier monsters. Verwissel de pipetpunten tussen de monsters. Als de dichtheid ten minste 10.000 sporen per milliliter is, ga dan verder met de volgende stap.

Als een sori-sectie na vier uur geen sporen produceert, gooi het monster dan weg. Sporen kunnen zich binnen enkele uren na het vrijkomen nestelen, maar kunnen in een cirkelvormige beweging worden waargenomen. Verwijder elk van de sori-secties uit hun Falcon-buizen.

Combineer de resulterende sporenoplossingen in een enkele gesteriliseerde container en kwantificeer de uiteindelijke gecombineerde dichtheid. Bereken het uiteindelijke volume sporenoplossing dat nodig is voor inoculatie voor een uiteindelijke concentratie van 500 tot 1.000 sporen per milliliter in kweekcontainers. Zie tekst voor details.

Plaats steriele glazen objectglaasjes in kweekcontainers om de ontwikkeling van kelp te volgen. Voeg ten minste 30 objectglaasjes toe die willekeurig over kweekcontainers zijn verdeeld voor voldoende monitoring. Inoculeer het berekende volume sporenoplossing in de kweekcontainer met behulp van een steriele pipetpunt die substraten bevat die zijn ondergedompeld in groeimedia.

Sluit de container en roer voorzichtig om de sporen te verdelen. Plaats de container in uw kweeksysteem. Stel uw temperatuur in tussen 10 en 15 graden Celsius op basis van de temperatuur op uw implementatielocatie.

Lampen met een volledig spectrum voor waterplanten zijn ingesteld op een 12-uurs licht- en 12-uurs donkercyclus met lichtintensiteiten variërend van nul tot 180 micromolfoton per vierkante meter seconde. Zie tekst voor een tijdlijn van specifieke lichtomstandigheden. Zorg na een dag voor lichte beluchting met een gefilterde luchtbron.

Controleer ten minste twee willekeurige glasplaatjes per dag, of om de dag gedurende de eerste twee weken om de ontwikkeling te beoordelen. Controleer na twee weken één tot twee keer per week ten minste twee willekeurige glasplaatjes op gezonde groei en besmetting totdat sporofyten één tot twee centimeter groot zijn. Om het te controleren, hanteert u het objectglaasje met een gesteriliseerd pincet en plaatst u het in een schoon petrischaaltje met voldoende gesteriliseerd zeewater om het glaasje onder te dompelen.

Breng glasplaatjes niet terug naar culturen nadat ze zijn verwijderd om kruisbesmetting te voorkomen. Gebruik een samengestelde of omgekeerde microscoop met een vergroting van 40 tot 400x om kelps in een vroeg stadium te observeren. De ontwikkeling zal naar verwachting de volgende tijdlijn volgen.

Gevestigde sporen worden waargenomen op nul tot één dag. Sporen kunnen binnen enkele uren ontkiemen, wat blijkt uit de vorming van een kiembuis. Kieming wordt meestal waargenomen na één tot twee dagen.

Vroege gametofyten worden meestal waargenomen na één tot vier dagen. Gametogenese, het proces waarbij cellen deling en differentiatie ondergaan om mannelijke en vrouwelijke gameten te vormen, wordt meestal waargenomen binnen de eerste twee weken. Vrouwelijke cellen zijn vijf tot zeven keer groter dan mannelijke.

Mannelijke gametofyten groeien dunne draadvormige takken, terwijl vrouwtjes meer rond of eivormig zijn. Vrouwtjes produceren meestal eieren binnen twee tot drie weken. Sperma dat vrijkomt van de mannetjes bevrucht de eieren, die zich ontwikkelen tot embryonale sporofyten.

Sporofyten worden meestal binnen twee tot vier weken waargenomen. De zygote ondergaat een snelle celdeling, wat resulteert in de groei van bladen van één tot twee centimeter binnen ongeveer zes tot acht weken. Vervang elke week van groeimedium om de noodzakelijke voedingsstoffen en mineralen voor de groei van Macrocystis pyrifera aan te vullen.

Koel verse groeimedia tot de juiste temperatuur. Zorg ervoor dat groeimedia tijdens dit proces niet hoger zijn dan 15 graden Celsius. Hevel media uit uw kweekcontainers om verstoring van gezaaide substraten te voorkomen.

Laat het medium uitlekken totdat de container bijna leeg is. Ververs media onmiddellijk om uitdroging tot een minimum te beperken. Kantel de kweekbakken iets bij het bijvullen, zodat het medium langs de zijkant van de kweekbak loopt om de substraten zo min mogelijk te verstoren.

Herschik willekeurig de posities van containers of kuipen tijdens wekelijkse mediawisselingen om rekening te houden met verschillen in lichtinstraling. Zie de tekst voor een kalender om activiteiten en verwachtingen voor Macrocystis-culturen bij te houden. Het geeft de timing aan van aanpassingen aan licht en beluchting, evenals wekelijkse mediawisselingen.

Na zes tot acht weken laboratoriumkweek zijn juveniele sporofyten één tot twee centimeter lang en klaar voor inzet. Ververs groeimedia in kweekcontainers 24 uur voor implementatie. Verkrijg de benodigde vergunningen voor het inzetten van grind die voldoen aan de lokale wet- en regelgeving.

Vervoer groen grind tot zes uur lang in een schaduwrijke koelbox. De inzet moet zo worden getimed dat het meest directe zonlicht wordt vermeden. Gebruik een schaduwrijke structuur op de boot om direct zonlicht te vermijden tijdens het inzetproces.

Strooi voorzichtig groen grind van het oppervlak op het rif eronder, of via duiken bij het uitproberen op nieuwe locaties en op kleine schaal. De hersteltechniek van groen grind bevindt zich nog in de academische fase met beperkte gegevens over de overleving van planten voor andere soorten en nog geen gegevens voor Macrocystis pyrifera. Desalniettemin is succes in het veld waargenomen in een recente pilotstudie, aangegeven door haptera-hechting aan het omringende substraat en juveniele kelpen die na twee maanden in het veld tot 1,2 meter groeien.

Met behulp van de veldverzameling en laboratoriumonderhoud die in dit protocol worden beschreven, hebben we twee verschillende donorkelppopulaties gekweekt bij 12 graden Celsius en 20 graden Celsius om temperatuurafhankelijke effecten op de ontwikkeling van microstadia van Macrocystis pyrifera door de tijd heen op te helderen. Na 24 dagen werden gametofyten geteld op basis van microscoopbeelden. Temperatuur had een effect voor de koelere K1-populatie, maar niet voor de K4-populatie, wat wijst op een mogelijke adaptieve divergentie in thermische tolerantiekenmerken.

Dit onderstreept het belang van locatiespecifieke opfoktemperaturen. Na 32 dagen werden zichtbare sporofyten geteld op elk glasplaatje. Temperatuur had een vergelijkbaar effect voor zowel K1- als K4-populaties.

Monsters die bij 20 graden Celsius werden gekweekt, vertoonden weinig zichtbare sporofyten in vergelijking met monsters die bij 12 graden Celsius werden gekweekt. Dit resultaat suggereert dat de productie van sporofyten gevoeliger is voor temperatuur dan het gametofytenstadium, en dat de kweektemperatuur niet hoger mag zijn dan 15 graden Celsius om de ontwikkeling van sporofyten te bereiken, zoals beschreven in het protocol. Met dit gevisualiseerde protocol hopen we verdere proeven met de groene grindmethode aan te moedigen om het herstel van waardevolle onderwaterkelpbossen door onderzoekers en beheerders wereldwijd op te schalen.

Veel succes op je groene gravelreis met Macrocystis pyrifera.