Collecte sur le terrain et entretien en laboratoire du varech géant formant le couvert forestier pour faciliter la restauration

Les forêts de varech sont confrontées à des pertes sans précédent en raison des facteurs de stress environnementaux liés au climat et des changements dans la dynamique trophique. Cette vidéo illustre un protocole et des outils pour la culture du varech géant, Macrocystis pyrifera, à l’aide de la technique du gravier vert, et fournit une ressource précieuse pour d’autres essais visant à aborder les succès et les limites de cette méthode dans différents contextes. Les installations d’élevage de varech doivent être en mesure de contrôler des températures comprises entre 10 et 15 degrés Celsius, de fournir une lumière à spectre complet allant de zéro à 180 micromoles photons par mètre carré par seconde carrée et une aération filtrée.

Les systèmes d’incubation avec une sortie intégrée ou un port d’accès pour les fils et les tubes peuvent être adaptés avec des lumières et une source d’air. Si un système d’incubation n’est pas conforme à la portée, au budget ou à l’échelle prévue du projet, des bains-marie tempérés par de l’eau de mer naturelle fraîche ou un refroidisseur peuvent être utilisés. Les températures d’élevage sont spécifiques au site et à la saison.

Placez un thermomètre dans un milieu de culture ou utilisez un pistolet thermique pour vous assurer que la température se situe entre 10 et 18 degrés Celsius. Réglez les lumières à spectre complet sur une période de lumière de 12 heures, une période de photo sombre de 12 heures à l’aide des paramètres de synchronisation de la source lumineuse ou en branchant la source lumineuse sur une minuterie avec un cycle programmable. Mesurez l’intensité lumineuse avec un compteur quantique PAR sous la surface près du gravier et ajustez à l’aide d’une source lumineuse à intensité variable ou en superposant un maillage sur la source lumineuse.

L’aération est ajoutée aux cultures à l’aide de pompes à air. Utilisez des filtres avec une taille de pores de 02 micromètres pour réduire la contamination bactérienne en suspension dans l’air. Le matériel et les stations doivent être stérilisés et préparés à l’avance.

Voir le texte pour plus de détails. Le gravier utilisé pour l’ensemencement doit avoir une surface texturée ou légèrement piquée, car les gamétophytes sont plus susceptibles d’être retenus sur des substrats à forte rugosité. Frottez et rincez le gravier jusqu’à ce que l’eau soit claire pour éliminer la poussière ou les débris.

Faites tremper le gravier dans une solution d’eau de Javel diluée à 10 % pendant au moins 24 heures et rincez à l’eau de mer stérilisée par filtre. Calculez le volume d’eau de mer stérilisée par filtre nécessaire pour rafraîchir les récipients de culture chaque semaine et planifiez cette tâche de filtration et de stérilisation en conséquence. De grandes quantités d’eau de mer stérilisée par filtre peuvent être stockées dans des récipients sombres jusqu’à six mois à une température de huit à 10 degrés Celsius.

Si la réfrigération n’est pas disponible, conservez-la dans un endroit sombre et frais. Filtrez l’eau à l’aide d’un système de filtration sous vide avec une taille de pores de 55 à un micromètre. Éteignez la source d’aspiration avant que toute l’eau ne soit aspirée pour éviter d’endommager le filtre et versez l’eau filtrée dans un récipient stérile dédié.

Pour les volumes plus importants, un système de filtration à flux continu peut être utilisé. Par exemple, faites passer l’eau de mer à travers une série de trois filtres plissés, 10 micromètres, cinq micromètres et un micromètre, disposés de la plus grande à la plus petite taille de pore. Ce système à flux continu est connecté à une lumière UV d’aquarium.

Stériliser l’eau de mer filtrée à l’aide de méthodes UV et/ou d’autoclavage. L’enrichissement de l’eau de mer stérilisée par filtre avec des nutriments et des vitamines est essentiel à la croissance du varech. Les options d’enrichissement courantes comprennent les milieux d’eau de mer enrichis en Provasoli et les milieux F/2.

Voir le texte pour plus de détails. Obtenez les permis nécessaires pour la collecte de tissus de varech qui répondent aux lois et réglementations locales. En plongée, sélectionnez trois à cinq lames sporophylles parmi 10 à 15 individus fertiles de Macrocystis pyrifera avec des sores visibles espacés de deux à cinq mètres.

Choisir des sporophylles propres et intacts si possible avec peu ou pas d’encrassement ou de dégradation. Stocker les lames sporophylles séparément selon l’individu parent à partir de ce moment. Les sporophylles poussent dans une jupe dense à la base au-dessus de la forteresse du varech adulte, et peuvent être identifiées par leur absence de pneumatocystes remplis de gaz.

Transporter les lames de sporophylle dans des sacs de collecte sombres pour éviter la surexposition à la lumière du soleil, remplis au minimum d’eau de mer du site pour les garder humides et entreposées dans des glacières à environ 12 degrés Celsius jusqu’à l’arrivée à l’espace de culture. S’assurer que les échantillons ne sont pas en contact direct avec la glace. Les sporophylles peuvent être expédiés vers ou depuis d’autres endroits.

Rincer les sporophylles avec de l’eau de mer filtrée et stérilisée. Envelopper les lames prélevées sur un seul individu de Macrocystis pyrifera dans des serviettes en papier humides trempées dans de l’eau de mer stérilisée filtrée, puis dans du papier d’aluminium pour éviter la pénétration de la lumière et une dessiccation supplémentaire. Cette méthode de stockage est communément appelée méthode burrito.

Placez ces emballages dans une glacière avec de la glace avec une barrière protectrice, comme du papier bulle recyclé ou du carton. Préparez la glacière pour l’expédition de nuit et assurez-vous que quelqu’un est disponible pour recevoir l’envoi et placer les colis dans des conditions réfrigérées. Facultativement, conservez les sporophylles pendant 12 à 48 heures dans des conditions réfrigérées, ce qui favorise la libération des spores du tissu du sorus.

Pour conserver, utilisez la méthode du burrito. Si vous les stockez en option, trouvez des preuves de sporulation partielle sur les serviettes en papier indiquant la présence de tissu sorus fertile. Le tissu Sorus est souvent légèrement surélevé et de couleur plus foncée que le tissu environnant.

Sélectionnez le tissu de sorus mûr et coupez-le en sections de 25 centimètres carrés à l’aide de ciseaux stériles. Sélectionnez une ou deux sections de sori propres parmi 10 à 15 parents de varech individuels pour favoriser la diversité génétique. Pour nettoyer, frottez doucement les deux côtés du tissu du sorus dans un seul sens avec une gaze stérile imbibée d’eau de mer stérilisée par filtre.

Si nécessaire, grattez doucement le tissu du sorus avec une lame de rasoir stérile. Immerger la section de sori dans un bain d’eau douce pendant 30 secondes à une minute et rincer à l’eau de mer stérilisée par filtre. Immergez chaque section de sori dans de l’eau de mer stérilisée par filtre tempérée à 10 à 15 degrés Celsius dans un tube Falcon stérile de 50 millilitres.

Alternativement, les sections de sori peuvent sporuler dans un seul récipient stérile. Placez les tubes à une température de quatre à 12 degrés Celsius dans l’obscurité pour qu’ils sporulent pendant un maximum de quatre heures. Si aucun réfrigérateur n’est disponible, conservez-le dans un endroit frais et peu éclairé.

À l’aide d’un microscope composé et d’un hémocytomètre, observez la densité des spores de trois à quatre échantillons toutes les 30 minutes jusqu’à quatre heures. Changez les pointes de pipette entre les échantillons. Si les densités sont d’au moins 10 000 spores par millilitre, passez à l’étape suivante.

Si une coupe de sori ne produit aucune spores après quatre heures, jetez l’échantillon. Les spores peuvent se déposer dans les heures qui suivent leur libération, mais peuvent être observées nageant dans un mouvement circulaire. Retirez chacune des sections de sori de leurs tubes Falcon.

Combinez les solutions de spores résultantes dans un seul récipient stérilisé et quantifiez la densité combinée finale. Calculer le volume final de solution de spores nécessaire à l’inoculation pour une concentration finale de 500 à 1 000 spores par millilitre dans des récipients de culture. Voir le texte pour plus de détails.

Placez des lames de verre stériles dans des récipients de culture pour surveiller le développement du varech. Inclure au moins 30 lames réparties au hasard dans les contenants de culture pour une surveillance suffisante. Inoculer le volume calculé de solution de spores dans le récipient de culture à l’aide d’une pointe de pipette stérile contenant des substrats immergés dans un milieu de culture.

Fermez le récipient et remuez doucement pour répartir les spores. Placez le récipient dans votre système de culture. Réglez votre température entre 10 et 15 degrés Celsius en fonction de la température de votre site de déploiement.

Les lumières à spectre complet pour les plantes aquatiques sont réglées sur un cycle de lumière de 12 heures et d’obscurité de 12 heures avec des intensités lumineuses allant de zéro à 180 micromoles photons par mètre carré de seconde. Voir le texte pour une chronologie des conditions d’éclairage spécifiques. Après une journée, prévoir une légère aération avec une source d’air filtré.

Surveillez au moins deux lames de verre aléatoires par jour, ou tous les deux jours pendant les deux premières semaines pour évaluer le développement. Après deux semaines, surveillez au moins deux lames de verre aléatoires une à deux fois par semaine pour une croissance saine et une contamination jusqu’à ce que les sporophytes atteignent une taille d’un à deux centimètres. Pour surveiller, manipulez la lame avec une pince à épiler stérilisée et placez-la dans une boîte de Pétri propre contenant suffisamment d’eau de mer stérilisée pour immerger la lame de verre.

Ne retournez pas les lames de verre dans les cultures après avoir été retirées pour éviter la contamination croisée. Utilisez un microscope composé ou inversé à un grossissement de 40 à 400x pour observer les varechs à un stade précoce. Le développement devrait suivre le calendrier suivant.

Les spores déposées sont observées à zéro à un jour. Les spores peuvent germer en quelques heures, comme en témoigne la formation d’un tube germinal. La germination est généralement observée au bout d’un à deux jours.

Les gamétophytes précoces sont généralement observés entre un et quatre jours. La gamétogenèse, le processus par lequel les cellules subissent une division et une différenciation pour former des gamètes mâles et femelles, est généralement observée dans les deux premières semaines. Les cellules femelles sont cinq à sept fois plus grandes que les mâles.

Les gamétophytes mâles développent de fines branches filamenteuses, tandis que les femelles sont plus rondes ou de forme ovoïde. Les femelles produisent généralement des œufs en deux à trois semaines. Le sperme libéré par les mâles féconde les œufs, qui se développent en sporophytes embryonnaires.

Les sporophytes sont généralement observés dans les deux à quatre semaines. Le zygote subit une division cellulaire rapide, entraînant la croissance de lames d’un à deux centimètres en six à huit semaines environ. Chaque semaine, changez de milieu de culture pour reconstituer les nutriments et minéraux nécessaires à la croissance de Macrocystis pyrifera.

Réfrigérer le milieu de croissance frais à la température appropriée. Assurez-vous que le milieu de culture ne dépasse pas 15 degrés Celsius pendant ce processus. Siphonnez le milieu hors de vos contenants de culture pour éviter de perturber les substrats ensemencés.

Laissez le média s’écouler jusqu’à ce que le récipient soit presque vide. Rafraîchissez immédiatement le support pour minimiser la dessiccation. Inclinez légèrement les récipients de croissance lors du remplissage, de sorte que le milieu coule sur le côté du récipient de culture pour perturber le moins possible les substrats.

Réorganisez au hasard les positions des récipients ou des cuves lors des changements hebdomadaires de milieu pour tenir compte des différences d’irradiation lumineuse. Voir le texte pour un calendrier pour suivre les activités et les attentes concernant les cultures de Macrocystis. Il indique le moment des ajustements de la lumière et de l’aération, ainsi que les changements hebdomadaires de support.

Après six à huit semaines d’élevage en laboratoire, les sporophytes juvéniles mesurent un à deux centimètres de long et sont prêts à être déployés. Actualisez les milieux de culture dans les conteneurs de culture 24 heures avant le déploiement. Obtenez les permis nécessaires pour le déploiement de gravier qui répondent aux lois et réglementations locales.

Transportez du gravier vert jusqu’à six heures dans une glacière ombragée. Le déploiement doit être programmé pour éviter la lumière la plus directe du soleil. Utilisez une structure ombragée sur le bateau pour éviter le soleil direct pendant le processus de déploiement.

Dispersez soigneusement du gravier vert de la surface sur le récif en contrebas, ou par plongée sous-marine lors d’essais sur de nouveaux sites et à petite échelle. La technique de restauration du gravier vert est encore en phase académique avec des données limitées sur la survie des semis pour d’autres espèces et aucune donnée pour Macrocystis pyrifera. Néanmoins, un succès sur le terrain a été observé dans une étude pilote récente, indiqué par l’attachement des haptera au substrat environnant et des varechs juvéniles atteignant 1,2 mètre après deux mois sur le terrain.

En utilisant la collecte sur le terrain et l’entretien en laboratoire décrits dans ce protocole, nous avons cultivé deux populations distinctes de varech donneur à 12 degrés Celsius et 20 degrés Celsius pour élucider les effets dépendants de la température sur le développement des micro-stades de Macrocystis pyrifera au fil du temps. Après 24 jours, les gamétophytes ont été comptés à partir d’images microscopiques. La température a eu un effet sur la population K1 plus froide, mais pas sur la population K4, suggérant une divergence adaptative possible dans les traits de tolérance thermique.

Cela souligne l’importance des températures d’élevage spécifiques au site. Après 32 jours, les sporophytes visibles ont été comptés sur chaque lame de verre. La température a eu un effet similaire pour les populations K1 et K4.

Les échantillons élevés à 20 degrés Celsius ont produit peu de sporophytes visibles par rapport à ceux élevés à 12 degrés Celsius. Ce résultat suggère que la production de sporophytes est plus sensible à la température que le stade gamétophyte, et que les températures d’élevage ne doivent pas dépasser 15 degrés Celsius pour atteindre le développement des sporophytes, comme indiqué dans le protocole. Avec ce protocole visualisé, nous espérons encourager d’autres essais avec la méthode du gravier vert pour améliorer la restauration de précieuses forêts de varech sous-marines par des chercheurs et des gestionnaires du monde entier.

Bonne chance dans votre voyage sur gravier vert avec Macrocystis pyrifera.