791 Views
•
14:44 min
•
June 7th, 2024
DOI :
June 7th, 2024
•0:05
Introduction
0:35
Preparation of Facilities and Materials
2:27
Preparation of Growth Media
3:52
Field Collection
5:38
Sporulation
7:50
Inoculation
8:35
Rearing Conditions
9:05
Monitoring
10:58
Maintenance
12:02
Deployment
12:45
Results
14:21
Conclusion
Transcript
Tareskoger står overfor enestående tap på grunn av klimadrevne miljøstressorer og skift i trofisk dynamikk. Denne videoen illustrerer en protokoll og verktøy for dyrking av stortare, Macrocystis pyrifera, ved hjelp av grønn grusteknikk, og gir en verdifull ressurs for videre forsøk for å adressere suksessene og begrensningene til denne metoden i forskjellige innstillinger. Taredyrkingsanlegg må kunne kontrollere temperaturer mellom 10 og 15 grader Celsius, gi fullspektret lys som varierer mellom null og 180 mikromolfotoner per meter kvadratsekund og filtrert lufting.
Inkubatorsystemer med innebygd stikkontakt, eller en tilgangsport for ledninger og rør kan tilpasses med lys og en luftkilde. Hvis et inkubatorsystem ikke er innenfor prosjektets omfang, budsjett eller tiltenkt skala, kan vannbad temperert av enten kjølig naturlig sjøvann eller en kjøler brukes. Oppdrettstemperaturer er steds- og sesongspesifikke.
Plasser et termometer i vekstmedier, eller bruk en temperaturpistol for å sikre at temperaturen er mellom 10 og 18 grader Celsius. Sett fullspektret lys til en 12 timers lys, 12 timers mørk fotoperiode ved hjelp av tidsinnstillingene på lyskilden, eller ved å koble lyskilden til en timer med en programmerbar syklus. Mål lysintensiteten med en PAR kvantemåler under overflaten nær grusen og juster ved hjelp av en dimbar lyskilde, eller ved å legge nett over lyskilden.
Lufting legges til kulturer ved bruk av luftpumper. Bruk filtre med en porestørrelse på 02 mikrometer for å redusere luftbåren bakteriell forurensning. Materialer og stasjoner bør steriliseres og tilberedes på forhånd.
Se teksten for detaljer. Grus som brukes til såing bør ha en strukturert eller litt pitted overflate, siden gametofytter er mer sannsynlig å bli beholdt på underlag med høy rugøsitet. Skrubb og skyll grus til vannet renner klart for å fjerne støv eller rusk.
Bløtlegg grus i en 10% fortynnet blekemiddelløsning i minst 24 timer, og skyll med filtersterilisert sjøvann. Beregn volumet av filtersterilisert sjøvann som trengs for å oppdatere kulturbeholdere hver uke, og planlegg denne filtrerings- og steriliseringsoppgaven deretter. Store partier filtersterilisert sjøvann kan lagres i mørke beholdere i opptil seks måneder ved åtte til 10 grader Celsius.
Hvis kjøling ikke er tilgjengelig, oppbevares i et mørkt, kjølig område. Filtrer vann ved hjelp av et vakuumfiltreringssystem med en porestørrelse på 55 til en mikrometer. Slå av vakuumkilden før alt vannet trekkes gjennom for å unngå å skade filteret, og hell det filtrerte vannet i en dedikert steril beholder.
For større volumer kan et gjennomstrømningsfiltreringssystem brukes. For eksempel, kjør sjøvann gjennom en serie med tre plisserte filtre, 10 mikrometer, fem mikrometer og en mikrometer, arrangert fra største til minste porestørrelse. Dette gjennomstrømningssystemet er koblet til et akvarium UV-lys.
Steriliser filtrert sjøvann ved hjelp av UV- og/eller autoklavermetoder. Anrikning av filtersterilisert sjøvann med næringsstoffer og vitaminer er avgjørende for kelpvekst. Vanlige anrikningsalternativer inkluderer Provasoli-berikede sjøvannsmedier og F/2-medier.
Se teksten for detaljer. Få de nødvendige tillatelsene for innsamling av tarevev som oppfyller lokale lover og forskrifter. Ved dykking, velg tre til fem sporofyllblad fra 10 til 15 fruktbare Macrocystis pyrifera individer med synlig sori fordelt to til fem meter fra hverandre.
Velg rene og intakte sporofyller hvis mulig med liten eller ingen begroing eller nedbrytning. Oppbevar sporofyllbladene separat i henhold til foreldrepersonen fra dette tidspunktet. Sporofyller vokser i et tett skjørt ved basen over holdfast av den voksne taren, og kan identifiseres ved deres mangel på gassfylte pneumatocyster.
Transporter sporofyllblader i mørke oppsamlingsposer for å unngå overeksponering for sollys fylt minimalt med sjøvann fra stedet for å holde bladene våte og lagret i kjølere ved ca. 12 grader Celsius til ankomst til dyrkingsområdet. Sørg for at prøvene ikke er i direkte kontakt med is. Sporofyller kan sendes til, eller fra andre steder.
Skyll sporofyller med filtrert sterilisert sjøvann. Pakk blader samlet fra en enkelt Macrocystis pyrifera individ i fuktige papirhåndklær dynket i filtrert sterilisert sjøvann, og igjen i aluminiumsfolie for å unngå lett penetrasjon og ytterligere uttørking. Denne metoden for lagring er kjent som burrito-metoden.
Plasser disse pakkene i en kjøler med is med en beskyttende barriere, for eksempel resirkulert bobleplast eller papp. Forbered kjøleren for forsendelse over natten og sørg for at noen er tilgjengelig for å motta forsendelsen og plassere pakkene i kjøleskap. Eventuelt kan du lagre sporofyller i 12 til 48 timer i kjøleskap, noe som oppmuntrer sporefrigjøring fra sorusvev.
For å lagre, bruk burrito-metoden. Hvis eventuelt lagret, finn bevis på delvis sporulering på papirhåndklærne som indikerer tilstedeværelse av fruktbart sorusvev. Sorusvev er ofte litt hevet og mørkere i fargen enn omkringliggende vev.
Velg modent sorusvev, og kutt i 25 centimeter kvadratiske seksjoner ved hjelp av steril saks. Velg ett til to rene sorisnitt fra 10 til 15 individuelle tareforeldre for å fremme genetisk mangfold. For å rengjøre, skrubb forsiktig begge sider av sorusvevet i en retning bare med en steril gasbind fuktet med filtersterilisert sjøvann.
Hvis nødvendig, skrap sorusvevet forsiktig med et sterilt barberblad. Senk sori-delen i et ferskvannsbad i 30 sekunder til ett minutt, og skyll med filtersterilisert sjøvann. Senk hver sori-seksjon i filtersterilisert sjøvann herdet til 10 til 15 grader Celsius i et sterilt 50 milliliter Falcon-rør.
Alternativt kan sori-seksjoner sporulere i en enkelt steril beholder. Plasser rør ved fire til 12 grader Celsius i mørket for å sporulere i maksimalt fire timer. Hvis ingen kjøleskap er tilgjengelig, oppbevares i et svakt lys, kjølig område.
Ved hjelp av et sammensatt mikroskop og hemocytometer, observer sporetettheten på tre til fire prøver hvert 30. minutt opp til fire timer. Bytt pipettespisser mellom prøvene. Hvis tettheten er minst 10.000 sporer per milliliter, gå videre til neste trinn.
Hvis et sorisnitt ikke produserer sporer etter fire timer, kast prøven. Sporer kan slå seg ned i løpet av timer etter frigjøring, men kan observeres svømmende i en sirkulær bevegelse. Fjern hver av sori-seksjonene fra Falcon-rørene.
Kombiner de resulterende sporeoppløsningene i en enkelt sterilisert beholder og kvantifiser den endelige kombinerte tettheten. Beregn det endelige volumet av sporeoppløsning som trengs for inokulering for en endelig konsentrasjon på 500 til 1.000 sporer per milliliter i kulturbeholdere. Se teksten for detaljer.
Plasser sterile glassglass i kulturbeholdere for å overvåke tareutviklingen. Inkluder minst 30 lysbilder fordelt tilfeldig på tvers av kulturbeholdere for tilstrekkelig overvåking. Inokuler det beregnede volumet av sporeoppløsning i dyrkningsbeholderen ved hjelp av en steril pipettespiss som inneholder substrater nedsenket i vekstmedier.
Lukk beholderen, og rør forsiktig for å fordele sporer. Plasser beholderen i kultursystemet ditt. Still inn temperaturen mellom 10 og 15 grader Celsius basert på temperaturen på distribusjonsstedet.
Fullspektret lys for vannplanter er satt til en 12 timers lys, 12 timers mørk syklus med lysintensiteter mellom null til 180 mikromol foton per meter kvadrat sekund. Se teksten for en tidslinje over spesifikke lysforhold. Etter en dag, sørg for lett lufting med en filtrert luftkilde.
Overvåk minst to tilfeldige glassglass daglig, eller annenhver dag de første to ukene for å vurdere utviklingen. Etter to uker, overvåke minst to tilfeldige glassglass en til to ganger i uken for sunn vekst og forurensning til sporofytter når en til to centimeter i størrelse. For å overvåke, håndter lysbildet med sterilisert pinsett og legg i en ren petriskål som inneholder nok sterilisert sjøvann til å senke glassglasset.
Ikke returner glassglass til kulturer etter at de er fjernet for å unngå krysskontaminering. Bruk et sammensatt eller invertert mikroskop ved en forstørrelse på 40 til 400x for å observere tidlig stadium kelps. Utviklingen forventes å spore følgende tidslinje.
Sedimenterte sporer observeres ved null til en dag. Sporer kan spire innen få timer, demonstrert ved dannelsen av et bakterierør. Spiring observeres vanligvis på en til to dager.
Tidlige gametofytter observeres vanligvis på en til fire dager. Gametogenese, prosessen der celler gjennomgår deling og differensiering for å danne mannlige og kvinnelige gameter, observeres vanligvis i løpet av de første to ukene. Kvinnelige celler er fem til syv ganger større enn menn.
Mannlige gametofytter vokser tynne trådformede grener, mens kvinner er mer runde eller ovoide i form. Hunnene produserer vanligvis egg innen to til tre uker. Sperm frigjort fra hannene befrukter eggene, som utvikler seg til embryonale sporofytter.
Sporofytter observeres vanligvis innen to til fire uker. Zygoten gjennomgår rask celledeling, noe som resulterer i vekst av en til to centimeter blader innen omtrent seks til åtte uker. Hver uke, bytt vekstmedier for å fylle opp nødvendige næringsstoffer og mineraler for Macrocystis pyrifera vekst.
Avkjøl friske vekstmedier til riktig temperatur. Sørg for at vekstmediet ikke overstiger 15 grader Celsius under denne prosessen. Sifonmedier ut av dyrkingsbeholderne dine for å unngå forstyrrelse av såede underlag.
La mediet renne av til beholderen er nesten tom. Oppdater mediet umiddelbart for å minimere uttørking. Vipp vekstbeholderne litt når du fyller på nytt, slik at media renner ned på siden av dyrkingsbeholderen for å forstyrre underlagene minimalt.
Omorganiser beholder- eller karposisjonene tilfeldig under ukentlige medieendringer for å ta hensyn til forskjeller i lysbestråling. Se teksten for en kalender for å spore aktiviteter og forventninger til Macrocystis-kulturer. Det indikerer tidspunktet for justeringer av lys og lufting, samt ukentlige medieendringer.
Etter seks til åtte uker med laboratoriedyrking er unge sporofytter en til to centimeter lange og klare for utplassering. Oppdater vekstmedier i kulturbeholdere 24 timer før distribusjon. Få de nødvendige tillatelsene for grusutsetting som oppfyller lokale lover og forskrifter.
Transporter grønn grus i opptil seks timer i en skyggefull kjøler. Distribusjonen bør tidsberegnes for å unngå det mest direkte sollyset. Bruk en skyggefull struktur på båten for å unngå direkte sol under utsettingsprosessen.
Spre forsiktig grønn grus fra overflaten til revet nedenfor, eller via dykking når du prøver på nye steder og i små skalaer. Den grønne grusrestaureringsteknikken er fortsatt i den akademiske fasen med begrensede overlevelsesdata for andre arter og ingen data ennå for Macrocystis pyrifera. Ikke desto mindre har suksess i feltet blitt observert i en nylig pilotstudie, indikert av haptera vedlegg til omkringliggende substrat og unge tare som vokser opp til 1,2 meter etter to måneder i feltet.
Ved hjelp av feltinnsamling og laboratorievedlikehold som er skissert i denne protokollen, dyrket vi to forskjellige donortarepopulasjoner ved 12 grader Celsius og 20 grader Celsius for å belyse temperaturavhengige effekter på utviklingen av mikrostadier av Macrocystis pyrifera gjennom tiden. Etter 24 dager ble gametofytter talt fra mikroskopbilder. Temperaturen hadde en effekt for den kjøligere K1-populasjonen, men ikke for K4-populasjonen, noe som tyder på en mulig adaptiv divergens i termiske toleranseegenskaper.
Dette understreker viktigheten av stedsspesifikke oppdrettstemperaturer. Etter 32 dager ble synlige sporofytter talt på hvert glassglass. Temperatur hadde tilsvarende effekt for både K1- og K4-populasjoner.
Prøver oppdrettet ved 20 grader Celsius vokste få synlige sporofytter sammenlignet med de oppdrettet ved 12 grader Celsius. Dette resultatet antyder at sporofyttproduksjonen er mer følsom for temperatur enn gametofyttstadiet, og at dyrkingstemperaturen ikke må overstige 15 grader Celsius for å oppnå sporofyttutvikling, som beskrevet i protokollen. Med denne visualiserte protokollen håper vi å oppmuntre til videre forsøk med den grønne grusmetoden for å oppskalere restaurering av verdifulle undersjøiske tareskoger av forskere og ledere globalt.
Lykke til på din grønne grustur med Macrocystis pyrifera.
Denne protokollen beskriver feltinnsamling og regelmessig laboratorievedlikehold av substrater sådd med baldakindannende gigantisk tare for bruk i restaureringsforsøk for å løse suksessen og begrensningene til "grønn grus" -teknikken i feltinnstillinger.
Explore More Videos
ABOUT JoVE
Copyright © 2024 MyJoVE Corporation. All rights reserved