791 Views
•
14:44 min
•
June 7th, 2024
DOI :
June 7th, 2024
•0:05
Introduction
0:35
Preparation of Facilities and Materials
2:27
Preparation of Growth Media
3:52
Field Collection
5:38
Sporulation
7:50
Inoculation
8:35
Rearing Conditions
9:05
Monitoring
10:58
Maintenance
12:02
Deployment
12:45
Results
14:21
Conclusion
Transcript
Kelpskogar står inför oöverträffade förluster på grund av klimatdrivna miljöstressfaktorer och förändringar i trofisk dynamik. Den här videon illustrerar ett protokoll och verktyg för odling av jättekelp, Macrocystis pyrifera, med hjälp av grön grusteknik, och ger en värdefull resurs för ytterligare försök för att ta itu med framgångarna och begränsningarna med denna metod i olika miljöer. Kelpodlingsanläggningar måste kunna kontrollera temperaturer mellan 10 och 15 grader Celsius, tillhandahålla fullspektrumljus mellan noll och 180 mikromolfotoner per kvadratmeter sekund och filtrerad luftning.
Inkubatorsystem med inbyggt uttag eller åtkomstport för ledningar och slangar kan anpassas med belysning och luftkälla. Om ett inkubatorsystem inte ligger inom projektets omfattning, budget eller avsedda skala kan vattenbad tempereras med antingen kallt naturligt havsvatten eller en kylare användas. Uppfödningstemperaturerna är plats- och säsongsspecifika.
Placera en termometer i odlingsmedia eller använd en temperaturpistol för att säkerställa att temperaturen är mellan 10 och 18 grader Celsius. Ställ in fullspektrumljus på en 12 timmars ljus, 12 timmars mörk fotoperiod med hjälp av tidsinställningarna på ljuskällan, eller genom att ansluta ljuskällan till en timer med en programmerbar cykel. Mät ljusintensiteten med en PAR-kvantmätare under ytan nära gruset och justera med hjälp av en dimbar ljuskälla, eller genom att lägga nät över ljuskällan.
Luftning tillsätts till kulturer med hjälp av luftpumpar. Använd filter med en porstorlek på 02 mikrometer för att minska luftburen bakteriell kontaminering. Material och stationer bör steriliseras och förberedas i förväg.
Se texten för mer information. Grus som används för sådd bör ha en strukturerad eller lätt gropig yta, eftersom gametofyter är mer benägna att hållas kvar på substrat med hög rugositet. Skrubba och skölj grus tills vattnet blir klart för att ta bort eventuellt damm eller skräp.
Blötlägg grus i en 10 % utspädd blekmedelslösning i minst 24 timmar och skölj med filtersteriliserat havsvatten. Beräkna volymen filtersteriliserat havsvatten som behövs för att uppdatera odlingsbehållare varje vecka och schemalägg denna filtrerings- och steriliseringsuppgift därefter. Stora partier av filtersteriliserat havsvatten kan förvaras i mörka behållare i upp till sex månader vid åtta till 10 grader Celsius.
Om kylning inte är tillgänglig, förvara på ett mörkt, svalt utrymme. Filtrera vatten med ett vakuumfiltreringssystem med en porstorlek på 55 till en mikrometer. Stäng av vakuumkällan innan allt vatten dras igenom för att undvika att skada filtret och häll det filtrerade vattnet i en dedikerad steril behållare.
För större volymer kan ett genomströmningsfiltreringssystem användas. Kör till exempel havsvatten genom en serie av tre veckade filter, 10 mikrometer, fem mikrometer och en mikrometer, ordnade från största till minsta porstorlek. Detta genomströmningssystem är anslutet till ett akvariums UV-ljus.
Sterilisera filtrerat havsvatten med UV- och/eller autoklaveringsmetoder. Berikning av filtersteriliserat havsvatten med näringsämnen och vitaminer är avgörande för tångtillväxten. Vanliga anrikningsalternativ inkluderar Provasoli-berikade havsvattenmedier och F/2-medier.
Se texten för mer information. Skaffa nödvändiga tillstånd för insamling av tångvävnad som uppfyller lokala lagar och förordningar. Genom att dyka, välj tre till fem sporofyllblad från 10 till 15 fertila Macrocystis pyrifera-individer med synlig sori på två till fem meters avstånd från varandra.
Välj rena och intakta sporofyller om möjligt med liten eller ingen nedsmutsning eller nedbrytning. Förvara sporofyllbladen separat enligt föräldraindividen från och med nu. Sporofyller växer i en tät kjol vid basen ovanför den vuxna tångens fäste och kan identifieras genom sin avsaknad av gasfyllda pneumatocyster.
Transportera sporofyllbladen i mörka uppsamlingspåsar för att undvika överexponering för solljus som fylls minimalt med havsvatten från platsen för att hålla bladen våta och förvaras i kylare vid cirka 12 grader Celsius fram till ankomsten till odlingsutrymmet. Se till att proverna inte kommer i direkt kontakt med is. Sporofyller kan skickas till eller från andra platser.
Skölj sporofyllerna med filtrerat steriliserat havsvatten. Linda in blad som samlats in från en enda Macrocystis pyrifera-individ i fuktiga pappershanddukar indränkta i filtrerat steriliserat havsvatten och igen i aluminiumfolie för att undvika ljusinträngning och ytterligare uttorkning. Denna lagringsmetod är allmänt känd som burritometoden.
Placera dessa förpackningar i en kylväska med is med en skyddande barriär, t.ex. återvunnen bubbelplast eller kartong. Förbered kylaren för leverans över natten och se till att någon är tillgänglig för att ta emot försändelsen och placera paketen i kylda förhållanden. Alternativt kan du förvara sporofyller i 12 till 48 timmar i kylskåp, vilket uppmuntrar sporfrisättning från sorusvävnad.
Använd burritometoden för att förvara. Om det finns en valfri förvaring, hitta tecken på partiell sporulation på pappershanddukarna som indikerar förekomst av fertil sorusvävnad. Sorysvävnad är ofta något upphöjd och mörkare i färgen än omgivande vävnad.
Välj mogen sorusvävnad och skär i 25 centimeter fyrkantiga sektioner med en steril sax. Välj en till två rena sorisektioner från 10 till 15 individuella kelpföräldrar för att främja genetisk mångfald. För att rengöra, skrubba försiktigt båda sidor av sorusvävnaden i en riktning endast med en steril gasväv fuktad med filtersteriliserat havsvatten.
Om det behövs, skrapa sorusvävnaden försiktigt med ett sterilt rakblad. Sänk ner sori-sektionen i ett sötvattenbad i 30 sekunder till en minut och skölj med filtersteriliserat havsvatten. Sänk ner varje sorisektion i filtersteriliserat havsvatten tempererat till 10 till 15 grader Celsius i ett sterilt 50 milliliters Falcon-rör.
Alternativt kan sorisektioner sporuera i en enda steril behållare. Placera rören vid fyra till 12 grader Celsius i mörker för att sporulera i högst fyra timmar. Om inget kylskåp finns tillgängligt, förvara i ett svalt utrymme med svagt ljus.
Använd ett sammansatt mikroskop och hemocytometer och observera sportätheten hos tre till fyra samples var 30:e minut upp till fyra timmar. Byt pipettspetsar mellan proverna. Om densiteten är minst 10 000 sporer per milliliter, gå vidare till nästa steg.
Om en sorisektion inte producerar några sporer efter fyra timmar, kassera provet. Sporer kan sätta sig inom några timmar efter att de släppts, men kan observeras simma i en cirkulär rörelse. Ta bort var och en av sorisektionerna från deras Falcon-rör.
Kombinera de resulterande sporlösningarna i en enda steriliserad behållare och kvantifiera den slutliga kombinerade densiteten. Beräkna den slutliga volymen sporlösning som behövs för inokulering för en slutlig koncentration på 500–1 000 sporer per ml i odlingsbehållare. Se texten för mer information.
Placera sterila glasskivor i odlingsbehållare för att övervaka tångutvecklingen. Inkludera minst 30 objektglas som fördelas slumpmässigt över odlingscontainrar för tillräcklig övervakning. Inokulera den beräknade volymen sporlösning i odlingsbehållaren med hjälp av en steril pipettspets som innehåller substrat nedsänkta i odlingssubstrat.
Stäng behållaren och rör om försiktigt för att sprida sporer. Placera behållaren i ditt odlingssystem. Ställ in temperaturen mellan 10 och 15 grader Celsius baserat på temperaturen på distributionsplatsen.
Fullspektrumljus för vattenväxter är inställda på en 12 timmars ljus, 12 timmars mörk cykel med ljusintensiteter som sträcker sig mellan noll till 180 mikromolfoton per kvadratmeter kvadratsekund. Se texten för en tidslinje över specifika ljusförhållanden. Efter en dag, ge lätt luftning med en filtrerad luftkälla.
Övervaka minst två slumpmässiga glasglas dagligen eller varannan dag under de första två veckorna för att bedöma utvecklingen. Efter två veckor, övervaka minst två slumpmässiga glasglas en till två gånger i veckan för hälsosam tillväxt och kontaminering tills sporofyterna når en till två centimeter i storlek. För att övervaka, hantera glaset med steriliserad pincett och placera i en ren petriskål som innehåller tillräckligt med steriliserat havsvatten för att sänka glasglaset.
Sätt inte tillbaka glasskivorna i odlingarna efter att de har tagits bort för att undvika korskontaminering. Använd ett sammansatt eller inverterat mikroskop med en förstoring på 40 till 400x för att observera tång i ett tidigt skede. Utvecklingen förväntas följa följande tidslinje.
Sedimenterade sporer observeras vid noll till en dag. Sporer kan gro inom några timmar, vilket demonstreras genom bildandet av ett groddrör. Groning observeras vanligtvis efter en till två dagar.
Tidiga gametofyter observeras vanligtvis efter en till fyra dagar. Gametogenes, den process genom vilken celler genomgår delning och differentiering för att bilda manliga och kvinnliga könsceller, observeras vanligtvis inom de första två veckorna. Kvinnliga celler är fem till sju gånger större än hanar.
Hanar har tunna trådformiga grenar, medan honorna är mer runda eller ovala till formen. Honorna producerar vanligtvis ägg inom två till tre veckor. Spermier som frigörs från hanarna befruktar äggen, som utvecklas till embryonala sporofyter.
Sporofyter observeras vanligtvis inom två till fyra veckor. Zygoten genomgår snabb celldelning, vilket resulterar i tillväxt av en till två centimeter blad inom cirka sex till åtta veckor. Byt odlingssubstrat varje vecka för att fylla på nödvändiga näringsämnen och mineraler för tillväxt av Macrocystis pyrifera.
Kyl färska odlingsmedier till lämplig temperatur. Se till att odlingsmediet inte överstiger 15 grader Celsius under denna process. Sug ut media ur dina odlingsbehållare för att undvika störningar av sådda substrat.
Låt mediet rinna av tills behållaren är nästan tom. Uppdatera materialet omedelbart för att minimera uttorkning. Luta tillväxtbehållarna något vid påfyllning, så att media rinner ner längs sidan av odlingsbehållaren för att störa substraten minimalt.
Ordna slumpmässigt om behållarens eller badkarets positioner under veckovisa mediebyten för att ta hänsyn till skillnader i ljusinstrålning. Se texten för en kalender för att spåra aktiviteter och förväntningar på Macrocystis-kulturer. Den anger tidpunkten för justeringar av ljus och luftning, samt veckovisa mediebyten.
Efter sex till åtta veckors laboratorieodling är juvenila sporofyter en till två centimeter långa och redo att sättas ut. Uppdatera tillväxtmedia i kulturcontainrar 24 timmar före distributionen. Skaffa nödvändiga tillstånd för grusutplacering som uppfyller lokala lagar och förordningar.
Transportera grönt grus i upp till sex timmar i en skuggig kylväska. Utplaceringen bör ske vid en tidpunkt för att undvika det mest direkta solljuset. Använd en skuggad struktur på båten för att undvika direkt sol under utplaceringsprocessen.
Sprid försiktigt grönt grus från ytan på revet nedanför, eller via dykning när du testar på nya platser och i små skalor. Restaureringstekniken för gröngrus är fortfarande i den akademiska fasen med begränsade överlevnadsdata för andra arter och inga data ännu för Macrocystis pyrifera. Icke desto mindre har framgång i fält observerats i en nyligen genomförd pilotstudie, vilket indikeras av haptera-bindning till omgivande substrat och juvenila tångar som växer upp till 1,2 meter efter två månader i fält.
Med hjälp av fältinsamlingen och laboratorieunderhållet som beskrivs i detta protokoll odlade vi två distinkta donatortångpopulationer vid 12 grader Celsius och 20 grader Celsius för att belysa temperaturberoende effekter på utvecklingen av mikrostadier av Macrocystis pyrifera över tid. Efter 24 dagar räknades gametofyter från mikroskopbilder. Temperaturen hade en effekt för den kallare K1-populationen, men inte för K4-populationen, vilket tyder på en möjlig adaptiv divergens i termiska toleransegenskaper.
Detta understryker vikten av platsspecifika uppfödningstemperaturer. Efter 32 dagar räknades synliga sporofyter på varje glasglas. Temperaturen hade en liknande effekt för både K1- och K4-populationer.
Prover som fötts upp vid 20 grader Celsius fick få synliga sporofyter jämfört med de som fötts upp vid 12 grader Celsius. Detta resultat tyder på att sporofytproduktionen är känsligare för temperatur än gametofytstadiet, och att odlingstemperaturen inte får överstiga 15 grader Celsius för att uppnå sporofytutveckling, vilket beskrivs i protokollet. Med detta visualiserade protokoll hoppas vi kunna uppmuntra till ytterligare försök med metoden med grönt grus för att skala upp restaureringen av värdefulla undervattensskogar av forskare och förvaltare globalt.
Lycka till på din gröna grusresa med Macrocystis pyrifera.
Detta protokoll beskriver fältinsamling och regelbundet laboratorieunderhåll av substrat sådda med krontaksbildande jättekelp för användning i restaureringsförsök för att ta itu med framgången och begränsningarna med tekniken "grönt grus" i fältmiljöer.
Explore More Videos
ABOUT JoVE
Copyright © 2024 MyJoVE Corporation. All rights reserved