Name: Auteur in de schijnwerpers: Stomataal onderzoek bevorderen met geautomatiseerde diafragmameting
Uploaded: 2024-02-09T13:55:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Author Spotlight: Advancing Stomatal Research with Automated Aperture Measurement at JoVE.com

We danken alle leden van het onderzoeksproject, 'Co-creatie van plant adaptieve eigenschappen via assemblage van plant-microbe holobiont', voor vruchtbare discussies. Dit werk werd ondersteund door Grant-in-Aid for Transformative Research Areas (21H05151 en 21H05149 aan AM en 21H05152 aan Y.T.) en Grant-in-Aid for Challenging Exploratory Research (22K19178 aan A. M.).

1. Planten kweken
<ol><li>Om de kiemrust te doorbreken, resuspendeert u de zaden van A. thaliana (Col-0) in gedeïoniseerd water en broedt u ze gedurende 4 dagen in het donker uit bij 4 °C.</li>
	<li>Zaai de zaden op de grond en kweek in een kamer die is uitgerust met wit fluorescerend licht. Houd de volgende groeiomstandigheden aan: temperatuur van 22 °C, lichtintensiteit van 6.000 lux (ca. 100 μmol/m2/s) gedurende 10 uur en relatieve vochtigheid van 60%.</li>
	<li>Geef de plant...

Geautomatiseerde meting van de stomatale respons op bacteriële invasie bij Arabidopsis

<ol>
	<li>Shimono, M., Higaki, T., Kaku, H., Shibuya, N., Hasezawa, S., Day, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+evaluation+of+stomatal+cytoskeletal+patterns+during+the+activation+of+immune+signaling+in+Arabidopsis+thaliana.">Quantitative evaluation of stomatal cytoskeletal patterns during the activation of immune signaling in Arabidopsis thaliana.</a> PLoS One. 11, e0159291 (2016).</li><li>Bourdais, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+quantitative+imaging+to+investigate+regulators+of+membrane+trafficking+in+Arabidopsis+stomatal+closure.">The use of quantitative imaging to investigate regulators of membrane trafficking in Arabidopsis stomatal closure.</a> Traffic. 20 (2), 168-180 (2019).</li><li>Higaki, T., Kutsuna, N., Hasezawa, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CARTA-based+semi-automatic+detection+of+stomatal+regions+on+an+Arabidopsis+cotyledon+surface.">CARTA-based semi-automatic detection of stomatal regions on an Arabidopsis cotyledon surface.</a> Plant Morphology. 26 (1), 9-12 (2014).</li><li>Eisele, J. F., F&#228;&#223;ler, F., B&#252;rgel, F., Chaban, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+and+simple+method+for+microscopy-based+stomata+analyses.">A rapid and simple method for microscopy-based stomata analyses.</a> PLoS One. 11, e0164576 (2016).</li><li>Chitraker, R., Melotto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+stomatal+response+to+live+bacterial+cells+using+whole+leaf+imaging.">Assessing stomatal response to live bacterial cells using whole leaf imaging.</a> Journal of Visualized Experiments. 44, 2185 (2010).</li><li>Sai, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=StomaAI:+an+efficient+and+user-friendly+tool+for+measurement+of+stomatal+pores+and+density+using+deep+computer+vision.">StomaAI: an efficient and user-friendly tool for measurement of stomatal pores and density using deep computer vision.</a> New Phytologist. 238 (2), 904-915 (2023).</li><li>Takagi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Image-based+quantification+of+Arabidopsis+thaliana+stomatal+aperture+from+leaf+images.">Image-based quantification of Arabidopsis thaliana stomatal aperture from leaf images.</a> Plant and Cell Physiology. pcad018, (2023).</li><li>Melotto, M., Zhang, L., Oblessuc, P. R., He, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stomatal+defense+a+decade+later.">Stomatal defense a decade later.</a> Plant Physiology. 174 (2), 561-571 (2017).</li><li>Melotto, M., Underwood, W., Koczan, J., Nomura, K., He, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant+stomata+function+in+innate+immunity+against+bacterial+invasion.">Plant stomata function in innate immunity against bacterial invasion.</a> Cell. 126 (5), 969-980 (2006).</li><li>Zeng, W., He, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+prominent+role+of+the+flagellin+receptor+FLAGELLIN-SENSING2+in+mediating+stomatal+response+to+Pseudomonas+syringae+pv+tomato+DC3000+in+Arabidopsis.">A prominent role of the flagellin receptor FLAGELLIN-SENSING2 in mediating stomatal response to Pseudomonas syringae pv tomato DC3000 in Arabidopsis.</a> Plant Physiology. 153 (3), 1188-1198 (2010).</li><li>Zheng, X. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coronatine+promotes+Pseudomonas+syringae+virulence+in+plants+by+activating+a+signaling+cascade+that+inhibits+salicylic+acid+accumulation.">Coronatine promotes Pseudomonas syringae virulence in plants by activating a signaling cascade that inhibits salicylic acid accumulation.</a> Cell Host and Microbe. 11 (6), 587-596 (2012).</li><li>Raffeiner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Xanthomonas+type-III+effector+XopS+stabilizes+CaWRKY40a+to+regulate+defense+responses+and+stomatal+immunity+in+pepper+(Capsicum+annuum).">The Xanthomonas type-III effector XopS stabilizes CaWRKY40a to regulate defense responses and stomatal immunity in pepper (Capsicum annuum).</a> The Plant Cell. 34 (5), 1684-1708 (2022).</li><li>Munemasa, S., Hauser, F., Park, J., Waadt, R., Brandt, B., Schroeder, J. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+abscisic+acid-mediated+control+of+stomatal+aperture.">Mechanisms of abscisic acid-mediated control of stomatal aperture.</a> Current Opinion in Plant Biology. 28, 154-162 (2015).</li><li>F&#246;rster, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wounding-induced+stomatal+closure+requires+jasmonate-mediated+activation+of+GORK+K++channels+by+a+Ca2++sensor-kinase+CBL1-CIPK5+complex.">Wounding-induced stomatal closure requires jasmonate-mediated activation of GORK K+ channels by a Ca2+ sensor-kinase CBL1-CIPK5 complex.</a> Developmental Cell. 48 (1), 87-99 (2018).</li><li>Cheng, Y. T., Zhang, L., He, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant-microbe+interactions+facing+environmental+challenge.">Plant-microbe interactions facing environmental challenge.</a> Cell Host and Microbe. 26 (2), 183-192 (2019).</li></ol>

Eerdere studies gebruikten epidermale schillen, bladschijven of losse bladeren om stomatale reacties op bacteriële invasies te onderzoeken 9,11,12. De methode die in deze studie wordt voorgesteld, maakt daarentegen gebruik van het draagbare stomatale beeldvormingsapparaat om huidmondjes direct te observeren op een blad dat aan de plant is bevestigd na spray-inoculatie van Pto, waardoor natuurlijke omstandigheden van ba...

Huidmondjes zijn microscopisch kleine poriën omgeven door een paar wachtcellen op het oppervlak van bladeren en andere bovengrondse delen van planten. In steeds veranderende omgevingen is de regulering van de huidmondjesopening van cruciaal belang voor planten om de opname van kooldioxide te regelen die nodig is voor fotosynthese ten koste van waterverlies via transpiratie. De kwantificering van de huidmondjesopening is dus van groot belang geweest voor het begrijpen van de aanpassing van het milieu aan planten. Het kwantificeren van de huidmondjesopening is echter inherent tijdrovend en omslachtig, omdat het menselijke arbeid vereist om stomatale poriën te herkennen en te meten in een bladbeeld dat door een microscoop is vastgelegd. Om deze beperkingen te omzeilen, zijn verschillende methoden ontwikkeld om de kwantificering van de stomatale opening in Arabidopsis thaliana te vergemakkelijken, een modelplant die op grote schaal wordt gebruikt om de stomatale biologie 1,2,3,4,5,6 te bestuderen. Een porometer kan bijvoorbeeld worden gebruikt om de transpiratiesnelheid te meten als maatstaf voor stomatale geleiding. Deze methode geeft echter geen directe informatie over het huidmondgetal en de opening die de huidmondgeleiding bepalen. Sommige onderzoeken hebben confocale microscopietechnieken gebruikt die de stomatale poriën benadrukken met behulp van een fluorescerende actinemarker, een fluorescerende kleurstof of celwandautofluorescentie 1,2,3,4,5. Hoewel deze benaderingen de detectie van huidmondjes vergemakkelijken, kunnen de kosten van zowel het exploiteren van een confocale microscopiefaciliteit als het voorbereiden van microscopiemonsters een obstakel vormen voor routinematige toepassing. In een baanbrekend werk van Sai et al. werd een diep neuraal netwerkmodel ontwikkeld om automatisch de stomatale opening te meten op basis van helderveldmicroscopische beelden van A. thaliana epidermale peelings6. Toch ontslaat deze innovatie onderzoekers niet van de taak om een epidermale peeling voor te bereiden op microscopische observatie. Onlangs werd dit obstakel overwonnen door een draagbaar beeldvormingsapparaat te ontwikkelen dat huidmondjes kan observeren door in een blad van A. thaliana te knijpen, samen met een op deep learning gebaseerde beeldanalysepijplijn die automatisch de huidmondopening meet op basis van bladbeelden die door het apparaat zijn vastgelegd7.
Huidmondjes dragen bij aan de aangeboren immuniteit van planten tegen bacteriële ziekteverwekkers. De sleutel tot deze immuunrespons is stomatale sluiting die het binnendringen van bacteriën door de microscopisch kleine porie in het binnenste van het blad beperkt, waar bacteriële ziekteverwekkers zich vermenigvuldigen en ziekten veroorzaken. Stomatale sluiting wordt geïnduceerd na herkenning van microbe-geassocieerde moleculaire patronen (MAMP's), immunogene moleculen die vaak gemeenschappelijk zijn voor een klasse van microben, door plasmamembraan-gelokaliseerde patroonherkenningsreceptoren (PRR's)9. Een epitoop van 22 aminozuren van bacterieel flagelline, bekend als flg22, is een typische MAMP die stomatale sluiting induceert door de herkenning ervan door de PRR FLS210. Als tegenmaatregel kunnen bacteriële ziekteverwekkers zoals Pseudomonas syringae pv. tomaat DC3000 (PTO) en Xanthomonas campestris pv. Vesicatoria hebben virulentiemechanismen ontwikkeld om huidmondjes te heropenen 9,11,12. Deze huidmondjes op bacteriële pathogenen zijn conventioneel geanalyseerd in tests waarbij epidermale peelings van bladeren, bladschijven of losse bladeren op bacteriële suspensie worden gezweefd en vervolgens huidmondjes worden waargenomen onder een microscoop, gevolgd door handmatige meting van de huidmondjesopening. Deze tests zijn echter omslachtig en weerspiegelen mogelijk geen huidmondjes op natuurlijke bacteriële invasie die optreden in een blad dat aan de plant is bevestigd.
Hier wordt een eenvoudige methode gepresenteerd om stomatale sluiting en heropening tijdens Pto-invasie te onderzoeken onder de voorwaarde die de natuurlijke interactie tussen plant en bacterie nauw nabootst. Deze methode maakt gebruik van het draagbare beeldvormingsapparaat voor directe observatie van A. thaliana huidmondjes op een blad dat is bevestigd aan de plant die is geïnoculeerd met Pto, samen met de beeldanalysepijplijn voor geautomatiseerde meting van de huidmondaopening.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Nakarai tesque</td>
			<td>01028-85</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Airbrush kits</td>
			<td>ANEST IWATA</td>
			<td>MX2900</td>
			<td>Accessory kits for SPRINT JET</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotron</td>
			<td>Nippon Medical &#38; Chemical Instruments</td>
			<td>LPH-411S</td>
			<td>Plant Growth Chamber with white fluorescent light</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Wako</td>
			<td>072-00626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Half tray</td>
			<td>Sakata</td>
			<td>72000113</td>
			<td>A set of tray and lid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hyponex</td>
			<td>Hyponex</td>
			<td>No catalogue number available</td>
			<td>Dilute the solution of Hyponex at a ratio of 1:2000 in deionized water for watering plants</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image J</td>
			<td>Natinal Institute of Health</td>
			<td>Download at https://imagej.nih.gov/ij/download.html</td>
			<td>Used for manual measurement of stomatal aperture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2HPO4</td>
			<td>Wako</td>
			<td>164-04295</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Wako</td>
			<td>163-03545</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KOH</td>
			<td>Wako</td>
			<td>168-21815</td>
			<td>For MES-KOH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MES</td>
			<td>Wako</td>
			<td>343-01621</td>
			<td>For MES-KOH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Portable stomatal imaging device</td>
			<td>Phytometrics</td>
			<td>Order at https://www.phytometrics.jp/</td>
			<td>Takagi et al.(2023) doi: 10.1093/pcp/pcad018.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rifampicin</td>
			<td>Wako</td>
			<td>185-01003</td>
			<td>Dissolve in DMSO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silwet-L77</td>
			<td>Bio medical science</td>
			<td>BMS-SL7755</td>
			<td>silicone surfactant used in spray inoculation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPRINT JET</td>
			<td>ANEST IWATA</td>
			<td>IS-800</td>
			<td>Airbrush used for spray inoculation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperMix A</td>
			<td>Sakata seed</td>
			<td>72000083</td>
			<td>Mix with Vermiculite G20 in equal proportions for preparing soil</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone</td>
			<td>Nakarai tesque</td>
			<td>35640-95</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vermiculite G20</td>
			<td>Nittai</td>
			<td>No catalogue number available</td>
			<td>Mix with Super Mix A in equal proportions for preparing soil</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>White fluorescent light</td>
			<td>NEC</td>
			<td>FHF32EX-N-HX-S</td>
			<td>Used for Biotron</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

direct observation and automated measurement of stomatal responses to pseudomonas syringae pv. tomato dc3000 in arabidopsis thaliana

Huidmondjes zijn microscopisch kleine poriën die worden aangetroffen in de epidermis van het plantenblad. Regulering van de huidmondjesopening is niet alleen van cruciaal belang voor het balanceren van de opname van kooldioxide voor fotosynthese en transpiratief waterverlies, maar ook voor het beperken van bacteriële invasie. Terwijl planten huidmondjes sluiten bij herkenning van microben, pathogene bacteriën, zoals Pseudomonas syringae pv. tomaat DC3000 (PTO), heropen de gesloten huidmondjes om toegang te krijgen tot het binnenste van de vleugel. In conventionele tests voor het beoordelen van stomatale reacties op bacteriële invasie, worden epidermale peelings van bladeren, bladschijven of losse bladeren op bacteriële suspensie gezweefd en vervolgens worden huidmondjes onder een microscoop geobserveerd, gevolgd door handmatige meting van de huidmondjesopening. Deze tests zijn echter omslachtig en weerspiegelen mogelijk geen huidmondjes op natuurlijke bacteriële invasie in een blad dat aan de plant vastzit. Onlangs is een draagbaar beeldvormingsapparaat ontwikkeld dat huidmondjes kan observeren door in een blad te knijpen zonder het los te maken van de plant, samen met een op deep learning gebaseerde beeldanalysepijplijn die is ontworpen om automatisch de huidmondopening te meten op basis van bladbeelden die door het apparaat zijn vastgelegd. Voortbouwend op deze technische vooruitgang wordt hier een nieuwe methode geïntroduceerd om de stomatale respons op bacteriële invasie in Arabidopsis thaliana te beoordelen. Deze methode bestaat uit drie eenvoudige stappen: sprayinoculatie van Pto die natuurlijke infectieprocessen nabootst, directe observatie van huidmondjes op een blad van de Pto-geïnoculeerde plant met behulp van het draagbare beeldvormingsapparaat en geautomatiseerde meting van de huidmondjesopening door de beeldanalysepijplijn. Deze methode werd met succes gebruikt om stomatale sluiting en heropening tijdens Pto-invasie aan te tonen onder omstandigheden die de natuurlijke interactie tussen plant en bacterie nauw nabootsen.

Stomata are microscopic pores surrounded by a pair of guard cells on the surface of leaves and other aerial parts of plants. Under ever-changing environments, regulation of the stomatal aperture is central for plants to control the carbon dioxide uptake required for photosynthesis at the expense of water loss via transpiration. Thus, quantification of the stomatal aperture has been instrumental to understanding plant environmental adaptation. However, quantifying the stomatal aperture is inherently time-consuming and cumbersome as it requires human labor to spot and measure stomatal pores in a leaf image captured by a microscope. To circumvent these limitations, various methods have been developed to facilitate the quantification of stomatal aperture in Arabidopsis thaliana, a model plant extensively used to study stomatal biology1,2,3,4,5,6. For instance, a porometer can be used to measure transpiration rate as a metric of stomatal conductance. However, this method does not provide direct information on the stomatal number and aperture that determine stomatal conductance. Some studies have used confocal microscopy techniques highlighting stomatal pores using a fluorescent actin marker, a fluorescent dye, or cell wall autofluorescence1,2,3,4,5. While these approaches facilitate the detection of stomata, the cost of both operating a confocal microscopy facility and preparing microscopy samples can be an obstacle to routine application. In a ground-breaking work by Sai et al., a deep neural network model was developed to automatically measure stomatal aperture from bright-field microscopic images of A. thaliana epidermal peels6. Yet, this innovation does not exempt researchers from the task of preparing an epidermal peel for microscopic observation. Recently, this obstacle was overcome by developing a portable imaging device that can observe stomata by pinching a leaf of A. thaliana, together with a deep learning-based image analysis pipeline that automatically measures stomatal aperture from leaf images captured by the device7.
Stomata contribute to plant innate immunity against bacterial pathogens. The key to this immune response is stomatal closure that restricts bacterial entry through the microscopic pore into the leaf interior, where bacterial pathogens proliferate and cause diseases8. Stomatal closure is induced upon recognition of microbe-associated molecular patterns (MAMPs), immunogenic molecules that are often common to a class of microbes, by plasma membrane-localized pattern recognition receptors (PRRs)9. A 22 amino acid epitope of bacterial flagellin known as flg22 is a typical MAMP that induces stomatal closure through its recognition by the PRR FLS210. As a countermeasure, bacterial pathogens such as Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 (Pto) and Xanthomonas campestris pv. vesicatoria have evolved virulence mechanisms to reopen stomata9,11,12. These stomatal responses to bacterial pathogens have been conventionally analyzed in assays in which either leaf epidermal peels, leaf discs, or detached leaves are floated on bacterial suspension, and then stomata are observed under a microscope followed by manual measurement of stomatal aperture. However, these assays are cumbersome and may not reflect stomatal responses to natural bacterial invasion that occur in a leaf attached to the plant.
Here, a simple method is presented to investigate stomatal closure and reopening during Pto invasion under the condition that closely mimics the natural plant-bacteria interaction. This method leverages the portable imaging device for direct observation of A. thaliana stomata on a leaf attached to the plant inoculated with Pto, together with the image analysis pipeline for automated measurement of stomatal aperture.

Auteur in de schijnwerpers: Stomataal onderzoek bevorderen met geautomatiseerde diafragmameting

Directe observatie en geautomatiseerde meting van stomatale responsen op Pseudomonas syringae pv. tomaat DC3000 in Arabidopsis thaliana

Plantal stomata play central roles in adaptation to stress conditions, so we need to measure stomata aperture to understand how plants respond to biotic and abiotic stresses. However, stomata aperture measurement is time-consuming and cumbersome. To measure stomata aperture, we peel the epidermis and observe stomata under a microscope.Then we manually measure stomata aperture, which takes a long time even for very experienced researchers. We challenged these barriers and developed a tool and a technique that can automatically measure stomata aperture in intact Arabidopsis leaves. So we strongly believe that stomata measuring device and deep-learning algorithm that we developed will facilitate functional analysis of stomata responses to various biotic and abiotic stresses because these technical advances significantly reduce time and human labor required for stomata aperture measurement.

Na spray-inoculatie van Pto werden huidmondjes op bladeren die aan de geïnoculeerde planten waren bevestigd, direct waargenomen door het draagbare stomatale beeldvormingsapparaat. Met behulp van handmatige en geautomatiseerde metingen werden dezelfde bladafbeeldingen gebruikt om de huidmondjesopening te berekenen door verhoudingen van breedte tot lengte van ongeveer 60 huidmondjes te nemen. Handmatige en geautomatiseerde metingen duidden consequent op een afname van de huidmondjesopening in Pto-geïnoculeerde p...

Watch this Scientific Journal Video about Author Spotlight: Advancing Stomatal Research with Automated Aperture Measurement at JoVE.com

Hier presenteren we een eenvoudige methode voor directe observatie en geautomatiseerde meting van stomatale reacties op bacteriële invasie in Arabidopsis thaliana. Deze methode maakt gebruik van een draagbaar stomatale beeldvormingsapparaat, samen met een beeldanalysepijplijn die is ontworpen voor bladbeelden die door het apparaat zijn vastgelegd.

Stomata are microscopic pores found in the plant leaf epidermis. Regulation of stomatal aperture is pivotal not only for balancing carbon dioxide uptake ...

Plantale huidmondjes spelen een centrale rol bij de aanpassing aan stressomstandigheden, dus we moeten de huidmondjesopening meten om te begrijpen hoe planten reageren op biotische en abiotische stress. Het meten van de huidmondjesopening is echter tijdrovend en omslachtig. Om de opening van huidmondjes te meten, pellen we de opperhuid en observeren we huidmondjes onder een microscoop.Vervolgens meten we handmatig de opening van huidmondjes, wat zelfs voor zeer ervaren onderzoekers lang duurt. We daagden deze barrières uit en ontwikkelden een tool en een techniek die automatisch de huidmondjesopening in intacte Arabidopsis-bladeren kan meten. We zijn er dus sterk van overtuigd dat het huidmondjesmeetapparaat en het deep-learning-algoritme dat we hebben ontwikkeld, de functionele analyse van huidmondjesreacties op verschillende biotische en abiotische stress zullen vergemakkelijken, omdat deze technische vooruitgang de tijd en menselijke arbeid die nodig is voor het meten van huidmondjesopeningen aanzienlijk zal verminderen.

direct-observation-automated-measurement-stomatal-responses-to

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Direct Observation and Automated Measurement of Stomatal Responses to Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 in Arabidopsis thaliana

Stomata are microscopic pores found in the plant leaf epidermis. Regulation of stomatal aperture is pivotal not only for balancing carbon dioxide uptake for photosynthesis and transpirational water loss but also for restricting bacterial invasion. While plants close stomata upon recognition of microbes, pathogenic bacteria, such as Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 (Pto), reopen the closed stomata to gain access into the leaf interior. In conventional assays for assessing stomatal responses to bacterial invasion, leaf epidermal peels, leaf discs, or detached leaves are floated on bacterial suspension, and then stomata are observed under a microscope followed by manual measurement of stomatal aperture. However, these assays are cumbersome and may not reflect stomatal responses to natural bacterial invasion in a leaf attached to the plant. Recently, a portable imaging device was developed that can observe stomata by pinching a leaf without detaching it from the plant, together with a deep learning-based image analysis pipeline designed to automatically measure stomatal aperture from leaf images captured by the device. Here, building on these technical advances, a new method to assess stomatal responses to bacterial invasion in Arabidopsis thaliana is introduced. This method consists of three simple steps: spray inoculation of Pto mimicking natural infection processes, direct observation of stomata on a leaf of the Pto-inoculated plant using the portable imaging device, and automated measurement of stomatal aperture by the image analysis pipeline. This method was successfully used to demonstrate stomatal closure and reopening during Pto invasion under conditions that closely mimic the natural plant-bacteria interaction.

Here, we present a simple method for direct observation and automated measurement of stomatal responses to bacterial invasion in Arabidopsis thaliana. This method leverages a portable stomatal imaging device, together with an image analysis pipeline designed for leaf images captured by the device.

Induction of Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 Infection in Arabidopsis thaliana for Automated Stomatal Response Measurement

Inductie van Pseudomonas syringae pv. tomaat DC3000-infectie bij Arabidopsis thaliana voor geautomatiseerde stomatale responsmeting

Automated Measurement of Stomatal Response in Arabidopsis thaliana in Response to Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 Infection

Geautomatiseerde meting van stomatale respons in Arabidopsis thaliana in reactie op Pseudomonas syringae pv. tomaat DC3000-infectie