Name: Autor im Rampenlicht: Förderung der Stomataforschung mit automatisierter Aperturmessung
Uploaded: 2024-02-09T13:55:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Author Spotlight: Advancing Stomatal Research with Automated Aperture Measurement at JoVE.com

Wir danken allen Mitgliedern des Forschungsprojekts "Co-creation of plant adaptive traits via assembly of plant-microbe holobiont" für fruchtbare Diskussionen. Diese Arbeit wurde durch Grant-in-Aid for Transformative Research Areas (21H05151 und 21H05149 to A.M. und 21H05152 to Y.T.) und Grant-in-Aid for Challenging Exploratory Research (22K19178 to A. M.) unterstützt.

1. Pflanzen anbauen
<ol><li>Um die Ruhephase zu unterbrechen, suspendieren Sie die Samen von A. thaliana (Col-0) in deionisiertem Wasser und inkubieren Sie sie 4 Tage lang bei 4 °C im Dunkeln.</li>
	<li>Säen Sie die Samen in die Erde und wachsen Sie in einer Kammer, die mit weißem Leuchtstoffröhrenlicht ausgestattet ist. Halten Sie folgende Wachstumsbedingungen aufrecht: Temperatur von 22 °C, Lichtintensität von 6.000 Lux (ca. 100 μmol/m2/s) für 10 h und relative Luftfeuchti...

Automatisierte Messung der stomatären Reaktion auf bakterielle Invasion in Arabidopsis

<ol>
	<li>Shimono, M., Higaki, T., Kaku, H., Shibuya, N., Hasezawa, S., Day, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+evaluation+of+stomatal+cytoskeletal+patterns+during+the+activation+of+immune+signaling+in+Arabidopsis+thaliana.">Quantitative evaluation of stomatal cytoskeletal patterns during the activation of immune signaling in Arabidopsis thaliana.</a> PLoS One. 11, e0159291 (2016).</li><li>Bourdais, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+quantitative+imaging+to+investigate+regulators+of+membrane+trafficking+in+Arabidopsis+stomatal+closure.">The use of quantitative imaging to investigate regulators of membrane trafficking in Arabidopsis stomatal closure.</a> Traffic. 20 (2), 168-180 (2019).</li><li>Higaki, T., Kutsuna, N., Hasezawa, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CARTA-based+semi-automatic+detection+of+stomatal+regions+on+an+Arabidopsis+cotyledon+surface.">CARTA-based semi-automatic detection of stomatal regions on an Arabidopsis cotyledon surface.</a> Plant Morphology. 26 (1), 9-12 (2014).</li><li>Eisele, J. F., F&#228;&#223;ler, F., B&#252;rgel, F., Chaban, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+and+simple+method+for+microscopy-based+stomata+analyses.">A rapid and simple method for microscopy-based stomata analyses.</a> PLoS One. 11, e0164576 (2016).</li><li>Chitraker, R., Melotto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+stomatal+response+to+live+bacterial+cells+using+whole+leaf+imaging.">Assessing stomatal response to live bacterial cells using whole leaf imaging.</a> Journal of Visualized Experiments. 44, 2185 (2010).</li><li>Sai, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=StomaAI:+an+efficient+and+user-friendly+tool+for+measurement+of+stomatal+pores+and+density+using+deep+computer+vision.">StomaAI: an efficient and user-friendly tool for measurement of stomatal pores and density using deep computer vision.</a> New Phytologist. 238 (2), 904-915 (2023).</li><li>Takagi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Image-based+quantification+of+Arabidopsis+thaliana+stomatal+aperture+from+leaf+images.">Image-based quantification of Arabidopsis thaliana stomatal aperture from leaf images.</a> Plant and Cell Physiology. pcad018, (2023).</li><li>Melotto, M., Zhang, L., Oblessuc, P. R., He, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stomatal+defense+a+decade+later.">Stomatal defense a decade later.</a> Plant Physiology. 174 (2), 561-571 (2017).</li><li>Melotto, M., Underwood, W., Koczan, J., Nomura, K., He, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant+stomata+function+in+innate+immunity+against+bacterial+invasion.">Plant stomata function in innate immunity against bacterial invasion.</a> Cell. 126 (5), 969-980 (2006).</li><li>Zeng, W., He, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+prominent+role+of+the+flagellin+receptor+FLAGELLIN-SENSING2+in+mediating+stomatal+response+to+Pseudomonas+syringae+pv+tomato+DC3000+in+Arabidopsis.">A prominent role of the flagellin receptor FLAGELLIN-SENSING2 in mediating stomatal response to Pseudomonas syringae pv tomato DC3000 in Arabidopsis.</a> Plant Physiology. 153 (3), 1188-1198 (2010).</li><li>Zheng, X. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coronatine+promotes+Pseudomonas+syringae+virulence+in+plants+by+activating+a+signaling+cascade+that+inhibits+salicylic+acid+accumulation.">Coronatine promotes Pseudomonas syringae virulence in plants by activating a signaling cascade that inhibits salicylic acid accumulation.</a> Cell Host and Microbe. 11 (6), 587-596 (2012).</li><li>Raffeiner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Xanthomonas+type-III+effector+XopS+stabilizes+CaWRKY40a+to+regulate+defense+responses+and+stomatal+immunity+in+pepper+(Capsicum+annuum).">The Xanthomonas type-III effector XopS stabilizes CaWRKY40a to regulate defense responses and stomatal immunity in pepper (Capsicum annuum).</a> The Plant Cell. 34 (5), 1684-1708 (2022).</li><li>Munemasa, S., Hauser, F., Park, J., Waadt, R., Brandt, B., Schroeder, J. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+abscisic+acid-mediated+control+of+stomatal+aperture.">Mechanisms of abscisic acid-mediated control of stomatal aperture.</a> Current Opinion in Plant Biology. 28, 154-162 (2015).</li><li>F&#246;rster, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wounding-induced+stomatal+closure+requires+jasmonate-mediated+activation+of+GORK+K++channels+by+a+Ca2++sensor-kinase+CBL1-CIPK5+complex.">Wounding-induced stomatal closure requires jasmonate-mediated activation of GORK K+ channels by a Ca2+ sensor-kinase CBL1-CIPK5 complex.</a> Developmental Cell. 48 (1), 87-99 (2018).</li><li>Cheng, Y. T., Zhang, L., He, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant-microbe+interactions+facing+environmental+challenge.">Plant-microbe interactions facing environmental challenge.</a> Cell Host and Microbe. 26 (2), 183-192 (2019).</li></ol>

Frühere Studien verwendeten epidermale Schalen, Blattscheiben oder abgelöste Blätter, um stomatale Reaktionen auf bakterielle Invasionen zu untersuchen 9,11,12. Im Gegensatz dazu nutzt die in dieser Studie vorgeschlagene Methode das tragbare stomatale Bildgebungsgerät, um Stomata auf einem an der Pflanze befestigten Blatt nach der Sprühimpfung von Pto direkt zu beobachten und die natürlichen Bedingungen der bakter...

Spaltöffnungen sind mikroskopisch kleine Poren, die von einem Paar Schließzellen auf der Oberfläche von Blättern und anderen oberirdischen Pflanzenteilen umgeben sind. In sich ständig verändernden Umgebungen ist die Regulierung der Stomataöffnung für Pflanzen von zentraler Bedeutung, um die für die Photosynthese erforderliche Kohlendioxidaufnahme auf Kosten des Wasserverlusts durch Transpiration zu steuern. Daher war die Quantifizierung der Stomataöffnung entscheidend für das Verständnis der Anpassung an die Pflanzenumwelt. Die Quantifizierung der Stomataöffnung ist jedoch von Natur aus zeitaufwändig und umständlich, da menschliche Arbeit erforderlich ist, um Stomataporen in einem Blattbild zu erkennen und zu messen, das mit einem Mikroskop aufgenommen wurde. Um diese Einschränkungen zu umgehen, wurden verschiedene Methoden entwickelt, um die Quantifizierung der Stomataöffnung in Arabidopsis thaliana zu erleichtern, einer Modellpflanze, die häufig zur Untersuchung der Stomatabiologie verwendet wird 1,2,3,4,5,6. Beispielsweise kann ein Porometer verwendet werden, um die Transpirationsrate als Metrik für die stomatäre Leitfähigkeit zu messen. Diese Methode liefert jedoch keine direkten Informationen über die Stomatazahl und die Öffnung, die den stomatären Leitwert bestimmen. In einigen Studien wurden konfokale Mikroskopietechniken verwendet, bei denen Stomataporen mit einem fluoreszierenden Aktinmarker, einem Fluoreszenzfarbstoff oder einer Zellwandautofluoreszenz hervorgehoben wurden 1,2,3,4,5. Während diese Ansätze den Nachweis von Spaltöffnungen erleichtern, können die Kosten sowohl für den Betrieb einer konfokalen Mikroskopieanlage als auch für die Vorbereitung von Mikroskopieproben ein Hindernis für die Routineanwendung darstellen. In einer bahnbrechenden Arbeit von Sai et al. wurde ein tiefes neuronales Netzwerkmodell entwickelt, um die stomatale Öffnung aus hellfeldmikroskopischen Bildern von A. thaliana-Epidermisschalen automatisch zu messen6. Diese Innovation entbindet die Forscher jedoch nicht von der Aufgabe, ein epidermales Peeling für die mikroskopische Beobachtung vorzubereiten. Kürzlich wurde dieses Hindernis durch die Entwicklung eines tragbaren Bildgebungsgeräts überwunden, das Stomata durch Einklemmen eines Blattes von A. thaliana beobachten kann, zusammen mit einer Deep-Learning-basierten Bildanalyse-Pipeline, die automatisch die Stomataöffnung aus Blattbildern misst, die mit dem Gerät aufgenommen wurden7.
Spaltöffnungen tragen zur angeborenen Immunität der Pflanze gegen bakterielle Krankheitserreger bei. Der Schlüssel zu dieser Immunantwort ist der Stomataverschluss, der den Eintritt von Bakterien durch die mikroskopisch kleine Pore in das Blattinnere einschränkt, wo sich bakterielle Krankheitserreger vermehren und Krankheiten verursachen8. Der Stomataverschluss wird bei der Erkennung von mikrobenassoziierten molekularen Mustern (MAMPs), immunogenen Molekülen, die häufig einer Klasse von Mikroben gemeinsam sind, durch Plasmamembran-lokalisierte Mustererkennungsrezeptoren (PRRs) induziert9. Ein 22-Aminosäuren-Epitop des bakteriellen Flagellins, bekannt als flg22, ist ein typisches MAMP, das durch seine Erkennung durch das PRR FLS210 einen Stomataverschluss induziert. Als Gegenmaßnahme können bakterielle Krankheitserreger wie Pseudomonas syringae pv. Tomate DC3000 (Zapfwelle) und Xanthomonas campestris pv. Vesitorien haben Virulenzmechanismen entwickelt, um Stomata wieder zu öffnen 9,11,12. Diese stomatalen Reaktionen auf bakterielle Krankheitserreger wurden konventionell in Assays analysiert, bei denen entweder epidermale Blattschalen, Blattscheiben oder abgelöste Blätter auf der Bakteriensuspension schwimmen und dann die Spaltöffnungen unter einem Mikroskop beobachtet werden, gefolgt von einer manuellen Messung der Stomataöffnung. Diese Assays sind jedoch umständlich und spiegeln möglicherweise nicht die stomatalen Reaktionen auf die natürliche bakterielle Invasion wider, die in einem an der Pflanze befestigten Blatt auftreten.
Hier wird eine einfache Methode vorgestellt, um den Verschluss und die Wiedereröffnung von Stomata während der Zapfwelleninvasion unter Bedingungen zu untersuchen, die die natürliche Pflanzen-Bakterien-Interaktion genau nachahmen. Diese Methode nutzt das tragbare Bildgebungsgerät für die direkte Beobachtung von A. thaliana-Stomata auf einem Blatt, das an der mit Pto inokulierten Pflanze befestigt ist, zusammen mit der Bildanalyse-Pipeline zur automatisierten Messung der Stomata-Öffnung.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Nakarai tesque</td>
			<td>01028-85</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Airbrush kits</td>
			<td>ANEST IWATA</td>
			<td>MX2900</td>
			<td>Accessory kits for SPRINT JET</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotron</td>
			<td>Nippon Medical &#38; Chemical Instruments</td>
			<td>LPH-411S</td>
			<td>Plant Growth Chamber with white fluorescent light</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Wako</td>
			<td>072-00626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Half tray</td>
			<td>Sakata</td>
			<td>72000113</td>
			<td>A set of tray and lid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hyponex</td>
			<td>Hyponex</td>
			<td>No catalogue number available</td>
			<td>Dilute the solution of Hyponex at a ratio of 1:2000 in deionized water for watering plants</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image J</td>
			<td>Natinal Institute of Health</td>
			<td>Download at https://imagej.nih.gov/ij/download.html</td>
			<td>Used for manual measurement of stomatal aperture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2HPO4</td>
			<td>Wako</td>
			<td>164-04295</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Wako</td>
			<td>163-03545</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KOH</td>
			<td>Wako</td>
			<td>168-21815</td>
			<td>For MES-KOH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MES</td>
			<td>Wako</td>
			<td>343-01621</td>
			<td>For MES-KOH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Portable stomatal imaging device</td>
			<td>Phytometrics</td>
			<td>Order at https://www.phytometrics.jp/</td>
			<td>Takagi et al.(2023) doi: 10.1093/pcp/pcad018.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rifampicin</td>
			<td>Wako</td>
			<td>185-01003</td>
			<td>Dissolve in DMSO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silwet-L77</td>
			<td>Bio medical science</td>
			<td>BMS-SL7755</td>
			<td>silicone surfactant used in spray inoculation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPRINT JET</td>
			<td>ANEST IWATA</td>
			<td>IS-800</td>
			<td>Airbrush used for spray inoculation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperMix A</td>
			<td>Sakata seed</td>
			<td>72000083</td>
			<td>Mix with Vermiculite G20 in equal proportions for preparing soil</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone</td>
			<td>Nakarai tesque</td>
			<td>35640-95</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vermiculite G20</td>
			<td>Nittai</td>
			<td>No catalogue number available</td>
			<td>Mix with Super Mix A in equal proportions for preparing soil</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>White fluorescent light</td>
			<td>NEC</td>
			<td>FHF32EX-N-HX-S</td>
			<td>Used for Biotron</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

direct observation and automated measurement of stomatal responses to pseudomonas syringae pv. tomato dc3000 in arabidopsis thaliana

Spaltöffnungen sind mikroskopisch kleine Poren in der Epidermis der Pflanzenblätter. Die Regulierung der stomatalen Öffnung ist nicht nur für den Ausgleich der Kohlendioxidaufnahme für die Photosynthese und den transpirativen Wasserverlust von entscheidender Bedeutung, sondern auch für die Begrenzung der bakteriellen Invasion. Während Pflanzen bei der Erkennung von Mikroben Spaltöffnungen schließen, können pathogene Bakterien wie Pseudomonas syringae pv. Tomate DC3000 (Zapfwelle), öffnen Sie die geschlossenen Spaltöffnungen wieder, um Zugang zum Flügelinneren zu erhalten. Bei herkömmlichen Assays zur Beurteilung der Stomatareaktionen auf eine bakterielle Invasion werden Blattepidermisschalen, Blattscheiben oder abgelöste Blätter auf Bakteriensuspension geschwommen, und dann werden die Spaltöffnungen unter einem Mikroskop beobachtet, gefolgt von einer manuellen Messung der Stomataöffnung. Diese Assays sind jedoch umständlich und spiegeln möglicherweise nicht die stomatalen Reaktionen auf die natürliche bakterielle Invasion in einem an der Pflanze befestigten Blatt wider. Kürzlich wurde ein tragbares Bildgebungsgerät entwickelt, das Stomata beobachten kann, indem es ein Blatt einklemmt, ohne es von der Pflanze zu lösen, zusammen mit einer Deep-Learning-basierten Bildanalyse-Pipeline, die entwickelt wurde, um die Stomataöffnung aus den vom Gerät aufgenommenen Blattbildern automatisch zu messen. Aufbauend auf diesen technischen Fortschritten wird hier eine neue Methode zur Bewertung der stomatären Reaktionen auf die bakterielle Invasion in Arabidopsis thaliana vorgestellt. Diese Methode besteht aus drei einfachen Schritten: Sprühinokulation von Pto, die natürliche Infektionsprozesse nachahmt, direkte Beobachtung von Spaltöffnungen auf einem Blatt der Pto-inokulierten Pflanze mit dem tragbaren Bildgebungsgerät und automatisierte Messung der Stomataöffnung durch die Bildanalysepipeline. Diese Methode wurde erfolgreich eingesetzt, um den Verschluss und die Wiedereröffnung von Stomata während der Zapfwelleninvasion unter Bedingungen zu demonstrieren, die die natürliche Pflanzen-Bakterien-Interaktion genau nachahmen.

Stomata are microscopic pores surrounded by a pair of guard cells on the surface of leaves and other aerial parts of plants. Under ever-changing environments, regulation of the stomatal aperture is central for plants to control the carbon dioxide uptake required for photosynthesis at the expense of water loss via transpiration. Thus, quantification of the stomatal aperture has been instrumental to understanding plant environmental adaptation. However, quantifying the stomatal aperture is inherently time-consuming and cumbersome as it requires human labor to spot and measure stomatal pores in a leaf image captured by a microscope. To circumvent these limitations, various methods have been developed to facilitate the quantification of stomatal aperture in Arabidopsis thaliana, a model plant extensively used to study stomatal biology1,2,3,4,5,6. For instance, a porometer can be used to measure transpiration rate as a metric of stomatal conductance. However, this method does not provide direct information on the stomatal number and aperture that determine stomatal conductance. Some studies have used confocal microscopy techniques highlighting stomatal pores using a fluorescent actin marker, a fluorescent dye, or cell wall autofluorescence1,2,3,4,5. While these approaches facilitate the detection of stomata, the cost of both operating a confocal microscopy facility and preparing microscopy samples can be an obstacle to routine application. In a ground-breaking work by Sai et al., a deep neural network model was developed to automatically measure stomatal aperture from bright-field microscopic images of A. thaliana epidermal peels6. Yet, this innovation does not exempt researchers from the task of preparing an epidermal peel for microscopic observation. Recently, this obstacle was overcome by developing a portable imaging device that can observe stomata by pinching a leaf of A. thaliana, together with a deep learning-based image analysis pipeline that automatically measures stomatal aperture from leaf images captured by the device7.
Stomata contribute to plant innate immunity against bacterial pathogens. The key to this immune response is stomatal closure that restricts bacterial entry through the microscopic pore into the leaf interior, where bacterial pathogens proliferate and cause diseases8. Stomatal closure is induced upon recognition of microbe-associated molecular patterns (MAMPs), immunogenic molecules that are often common to a class of microbes, by plasma membrane-localized pattern recognition receptors (PRRs)9. A 22 amino acid epitope of bacterial flagellin known as flg22 is a typical MAMP that induces stomatal closure through its recognition by the PRR FLS210. As a countermeasure, bacterial pathogens such as Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 (Pto) and Xanthomonas campestris pv. vesicatoria have evolved virulence mechanisms to reopen stomata9,11,12. These stomatal responses to bacterial pathogens have been conventionally analyzed in assays in which either leaf epidermal peels, leaf discs, or detached leaves are floated on bacterial suspension, and then stomata are observed under a microscope followed by manual measurement of stomatal aperture. However, these assays are cumbersome and may not reflect stomatal responses to natural bacterial invasion that occur in a leaf attached to the plant.
Here, a simple method is presented to investigate stomatal closure and reopening during Pto invasion under the condition that closely mimics the natural plant-bacteria interaction. This method leverages the portable imaging device for direct observation of A. thaliana stomata on a leaf attached to the plant inoculated with Pto, together with the image analysis pipeline for automated measurement of stomatal aperture.

Autor im Rampenlicht: Förderung der Stomataforschung mit automatisierter Aperturmessung

Direkte Beobachtung und automatisierte Messung der stomatalen Reaktionen auf Pseudomonas syringae pv. Tomate DC3000 in Arabidopsis thaliana

Plantal stomata play central roles in adaptation to stress conditions, so we need to measure stomata aperture to understand how plants respond to biotic and abiotic stresses. However, stomata aperture measurement is time-consuming and cumbersome. To measure stomata aperture, we peel the epidermis and observe stomata under a microscope.Then we manually measure stomata aperture, which takes a long time even for very experienced researchers. We challenged these barriers and developed a tool and a technique that can automatically measure stomata aperture in intact Arabidopsis leaves. So we strongly believe that stomata measuring device and deep-learning algorithm that we developed will facilitate functional analysis of stomata responses to various biotic and abiotic stresses because these technical advances significantly reduce time and human labor required for stomata aperture measurement.

Nach der Sprühinokulation von Pto wurden Stomata auf Blättern, die an den inokulierten Pflanzen befestigt waren, direkt mit dem tragbaren stomatalen Bildgebungsgerät beobachtet. Unter Verwendung manueller und automatisierter Messungen wurden dieselben Blattbilder verwendet, um die Stomataöffnung zu berechnen, indem das Verhältnis von Breite zu Länge von etwa 60 Spaltöffnungen genommen wurde. Manuelle und automatisierte Messungen zeigten durchweg eine Abnahme der Stomataöffnung bei Pto-geimpften Pflanzen ...

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Hier stellen wir eine einfache Methode zur direkten Beobachtung und automatisierten Messung der stomatären Reaktionen auf bakterielle Invasion in Arabidopsis thaliana vor. Diese Methode nutzt ein tragbares stomatales Bildgebungsgerät zusammen mit einer Bildanalyse-Pipeline, die für vom Gerät aufgenommene Blattbilder ausgelegt ist.

Stomata are microscopic pores found in the plant leaf epidermis. Regulation of stomatal aperture is pivotal not only for balancing carbon dioxide uptake ...

Plantale Spaltöffnungen spielen eine zentrale Rolle bei der Anpassung an Stressbedingungen, daher müssen wir die Öffnung der Spaltöffnungen messen, um zu verstehen, wie Pflanzen auf biotischen und abiotischen Stress reagieren. Die Messung der Stomata-Öffnung ist jedoch zeitaufwändig und umständlich. Um die Öffnung der Stomata zu messen, schälen wir die Epidermis und betrachten die Spaltöffnungen unter einem Mikroskop.Dann messen wir manuell die Stomata-Öffnung, was selbst für sehr erfahrene Forscher sehr lange dauert. Wir haben diese Barrieren in Frage gestellt und ein Werkzeug und eine Technik entwickelt, mit der die Stomata-Öffnung in intakten Arabidopsis-Blättern automatisch gemessen werden kann. Wir sind daher fest davon überzeugt, dass das von uns entwickelte Stomata-Messgerät und der Deep-Learning-Algorithmus die funktionelle Analyse der Stomata-Reaktionen auf verschiedene biotische und abiotische Belastungen erleichtern werden, da diese technischen Fortschritte den Zeit- und Arbeitsaufwand für die Messung der Stomata-Öffnung erheblich reduzieren.

direct-observation-automated-measurement-stomatal-responses-to

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Direct Observation and Automated Measurement of Stomatal Responses to Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 in Arabidopsis thaliana

Stomata are microscopic pores found in the plant leaf epidermis. Regulation of stomatal aperture is pivotal not only for balancing carbon dioxide uptake for photosynthesis and transpirational water loss but also for restricting bacterial invasion. While plants close stomata upon recognition of microbes, pathogenic bacteria, such as Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 (Pto), reopen the closed stomata to gain access into the leaf interior. In conventional assays for assessing stomatal responses to bacterial invasion, leaf epidermal peels, leaf discs, or detached leaves are floated on bacterial suspension, and then stomata are observed under a microscope followed by manual measurement of stomatal aperture. However, these assays are cumbersome and may not reflect stomatal responses to natural bacterial invasion in a leaf attached to the plant. Recently, a portable imaging device was developed that can observe stomata by pinching a leaf without detaching it from the plant, together with a deep learning-based image analysis pipeline designed to automatically measure stomatal aperture from leaf images captured by the device. Here, building on these technical advances, a new method to assess stomatal responses to bacterial invasion in Arabidopsis thaliana is introduced. This method consists of three simple steps: spray inoculation of Pto mimicking natural infection processes, direct observation of stomata on a leaf of the Pto-inoculated plant using the portable imaging device, and automated measurement of stomatal aperture by the image analysis pipeline. This method was successfully used to demonstrate stomatal closure and reopening during Pto invasion under conditions that closely mimic the natural plant-bacteria interaction.

Here, we present a simple method for direct observation and automated measurement of stomatal responses to bacterial invasion in Arabidopsis thaliana. This method leverages a portable stomatal imaging device, together with an image analysis pipeline designed for leaf images captured by the device.

Forschung

Immunologie und Infektion

Induction of Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 Infection in Arabidopsis thaliana for Automated Stomatal Response Measurement

Induktion von Pseudomonas syringae pv. Tomate DC3000-Infektion in Arabidopsis thaliana zur automatisierten Messung des stomatalen Ansprechens

Automated Measurement of Stomatal Response in Arabidopsis thaliana in Response to Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 Infection

Automatisierte Messung des stomatalen Ansprechens bei Arabidopsis thaliana als Reaktion auf Pseudomonas syringae pv. Tomate DC3000-Infektion