Name: लेखक स्पॉटलाइट: स्वचालित एपर्चर मापन के साथ स्टोमेटाल रिसर्च को आगे बढ़ाना
Uploaded: 2024-02-09T13:55:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Author Spotlight: Advancing Stomatal Research with Automated Aperture Measurement at JoVE.com

हम अनुसंधान परियोजना के सभी सदस्यों को धन्यवाद देते हैं, 'प्लांट-माइक्रोब होलोबियंट की असेंबली के माध्यम से पौधे अनुकूली लक्षणों का सह-निर्माण', फलदायी चर्चाओं के लिए। इस काम को ट्रांसफॉर्मेटिव रिसर्च एरिया (21H05151 और 21H05149 से A.M. और 21H05152 से Y.T.) के लिए ग्रांट-इन-एड और चुनौतीपूर्ण खोजपूर्ण अनुसंधान के लिए अनुदान सहायता (22K19178 से A. M.) द्वारा समर्थित किया गया था।

1. बढ़ते पौधे
<ol><li>सुप्तावस्था को तोड़ने के लिए, विआयनीकृत पानी में ए. थालियाना (कर्नल -0) बीजों को फिर से निलंबित करें और उन्हें अंधेरे में 4 दिनों के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर इनसेते हैं।</li>
	<li>मिट्टी...

Arabidopsis में बैक्टीरियल आक्रमण के लिए स्वचालित रंध्र प्रतिक्रिया माप

<ol>
	<li>Shimono, M., Higaki, T., Kaku, H., Shibuya, N., Hasezawa, S., Day, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+evaluation+of+stomatal+cytoskeletal+patterns+during+the+activation+of+immune+signaling+in+Arabidopsis+thaliana.">Quantitative evaluation of stomatal cytoskeletal patterns during the activation of immune signaling in Arabidopsis thaliana.</a> PLoS One. 11, e0159291 (2016).</li><li>Bourdais, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+quantitative+imaging+to+investigate+regulators+of+membrane+trafficking+in+Arabidopsis+stomatal+closure.">The use of quantitative imaging to investigate regulators of membrane trafficking in Arabidopsis stomatal closure.</a> Traffic. 20 (2), 168-180 (2019).</li><li>Higaki, T., Kutsuna, N., Hasezawa, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CARTA-based+semi-automatic+detection+of+stomatal+regions+on+an+Arabidopsis+cotyledon+surface.">CARTA-based semi-automatic detection of stomatal regions on an Arabidopsis cotyledon surface.</a> Plant Morphology. 26 (1), 9-12 (2014).</li><li>Eisele, J. F., F&#228;&#223;ler, F., B&#252;rgel, F., Chaban, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+and+simple+method+for+microscopy-based+stomata+analyses.">A rapid and simple method for microscopy-based stomata analyses.</a> PLoS One. 11, e0164576 (2016).</li><li>Chitraker, R., Melotto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+stomatal+response+to+live+bacterial+cells+using+whole+leaf+imaging.">Assessing stomatal response to live bacterial cells using whole leaf imaging.</a> Journal of Visualized Experiments. 44, 2185 (2010).</li><li>Sai, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=StomaAI:+an+efficient+and+user-friendly+tool+for+measurement+of+stomatal+pores+and+density+using+deep+computer+vision.">StomaAI: an efficient and user-friendly tool for measurement of stomatal pores and density using deep computer vision.</a> New Phytologist. 238 (2), 904-915 (2023).</li><li>Takagi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Image-based+quantification+of+Arabidopsis+thaliana+stomatal+aperture+from+leaf+images.">Image-based quantification of Arabidopsis thaliana stomatal aperture from leaf images.</a> Plant and Cell Physiology. pcad018, (2023).</li><li>Melotto, M., Zhang, L., Oblessuc, P. R., He, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stomatal+defense+a+decade+later.">Stomatal defense a decade later.</a> Plant Physiology. 174 (2), 561-571 (2017).</li><li>Melotto, M., Underwood, W., Koczan, J., Nomura, K., He, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant+stomata+function+in+innate+immunity+against+bacterial+invasion.">Plant stomata function in innate immunity against bacterial invasion.</a> Cell. 126 (5), 969-980 (2006).</li><li>Zeng, W., He, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+prominent+role+of+the+flagellin+receptor+FLAGELLIN-SENSING2+in+mediating+stomatal+response+to+Pseudomonas+syringae+pv+tomato+DC3000+in+Arabidopsis.">A prominent role of the flagellin receptor FLAGELLIN-SENSING2 in mediating stomatal response to Pseudomonas syringae pv tomato DC3000 in Arabidopsis.</a> Plant Physiology. 153 (3), 1188-1198 (2010).</li><li>Zheng, X. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coronatine+promotes+Pseudomonas+syringae+virulence+in+plants+by+activating+a+signaling+cascade+that+inhibits+salicylic+acid+accumulation.">Coronatine promotes Pseudomonas syringae virulence in plants by activating a signaling cascade that inhibits salicylic acid accumulation.</a> Cell Host and Microbe. 11 (6), 587-596 (2012).</li><li>Raffeiner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Xanthomonas+type-III+effector+XopS+stabilizes+CaWRKY40a+to+regulate+defense+responses+and+stomatal+immunity+in+pepper+(Capsicum+annuum).">The Xanthomonas type-III effector XopS stabilizes CaWRKY40a to regulate defense responses and stomatal immunity in pepper (Capsicum annuum).</a> The Plant Cell. 34 (5), 1684-1708 (2022).</li><li>Munemasa, S., Hauser, F., Park, J., Waadt, R., Brandt, B., Schroeder, J. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+abscisic+acid-mediated+control+of+stomatal+aperture.">Mechanisms of abscisic acid-mediated control of stomatal aperture.</a> Current Opinion in Plant Biology. 28, 154-162 (2015).</li><li>F&#246;rster, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wounding-induced+stomatal+closure+requires+jasmonate-mediated+activation+of+GORK+K++channels+by+a+Ca2++sensor-kinase+CBL1-CIPK5+complex.">Wounding-induced stomatal closure requires jasmonate-mediated activation of GORK K+ channels by a Ca2+ sensor-kinase CBL1-CIPK5 complex.</a> Developmental Cell. 48 (1), 87-99 (2018).</li><li>Cheng, Y. T., Zhang, L., He, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant-microbe+interactions+facing+environmental+challenge.">Plant-microbe interactions facing environmental challenge.</a> Cell Host and Microbe. 26 (2), 183-192 (2019).</li></ol>

पिछले अध्ययनों में एपिडर्मल छिलके, पत्ती डिस्क, या अलग पत्तियों का इस्तेमाल बैक्टीरिया के आक्रमणों 9,11,12 के लिए रंध्र प्रतिक्रियाओं की जांच करने के लिए किया गया था। इ?...

स्टोमेटा सूक्ष्म छिद्र होते हैं जो पत्तियों की सतह और पौधों के अन्य हवाई भागों पर गार्ड कोशिकाओं की एक जोड़ी से घिरे होते हैं। कभी-बदलते परिवेश के तहत, वाष्पोत्सर्जन के माध्यम से पानी के नुकसान की कीमत पर प्रकाश संश्लेषण के लिए आवश्यक कार्बन डाइऑक्साइड तेज को नियंत्रित करने के लिए पौधों के लिए स्टोमेटाल एपर्चर का विनियमन केंद्रीय है। इस प्रकार, स्टोमेटा एपर्चर का परिमाणीकरण पौधे के पर्यावरण अनुकूलन को समझने के लिए महत्वपूर्ण रहा है। हालांकि, स्टोमेटा एपर्चर की मात्रा निर्धारित करना स्वाभाविक रूप से समय लेने वाली और बोझिल है क्योंकि माइक्रोस्कोप द्वारा कैप्चर की गई पत्ती की छवि में स्टोमेटा छिद्रों को स्पॉट करने और मापने के लिए मानव श्रम की आवश्यकता होती है। इन सीमाओं को दरकिनार करने के लिए, Arabidopsis Thaaliana में stomatal एपर्चर की मात्रा का ठहराव की सुविधा के लिए विभिन्न तरीकों का विकास किया गया है, एक मॉडल संयंत्र बड़े पैमाने पर stomatal जीव विज्ञान 1,2,3,4,5,6 का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया. उदाहरण के लिए, एक पोरोमीटर का उपयोग वाष्पोत्सर्जन दर को मापने के लिए स्टोमेटा चालकता के मीट्रिक के रूप में किया जा सकता है। हालांकि, यह विधि स्टोमेटा संख्या और एपर्चर पर प्रत्यक्ष जानकारी प्रदान नहीं करती है जो स्टोमेटा चालकता निर्धारित करती है। कुछ अध्ययनों ने फ्लोरोसेंट एक्टिन मार्कर, एक फ्लोरोसेंट डाई, या सेल दीवार ऑटोफ्लोरेसेंस 1,2,3,4,5का उपयोग करके स्टोमेटाल छिद्रों को उजागर करने वाली कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी तकनीकों का उपयोग किया है। जबकि ये दृष्टिकोण रंध्र का पता लगाने की सुविधा प्रदान करते हैं, दोनों की लागत एक फोकल माइक्रोस्कोपी सुविधा के संचालन और माइक्रोस्कोपी नमूने तैयार करने के लिए नियमित आवेदन के लिए एक बाधा हो सकती है। साई एट अल द्वारा एक जमीन तोड़ने काम में, एक गहरी तंत्रिका नेटवर्क मॉडल स्वचालित रूप से ए thaliana एपिडर्मल peels6 के उज्ज्वल क्षेत्र सूक्ष्म छवियों से stomatal एपर्चर को मापने के लिए विकसित किया गया था. फिर भी, यह नवाचार शोधकर्ताओं को सूक्ष्म अवलोकन के लिए एपिडर्मल छील तैयार करने के कार्य से छूट नहीं देता है। हाल ही में, इस बाधा को एक पोर्टेबल इमेजिंग डिवाइस विकसित करके दूर किया गया था जो ए थालियाना के एक पत्ते को चुटकी बजाकर रंध्र का निरीक्षण कर सकता है, साथ में एक गहरी सीखने-आधारित छवि विश्लेषण पाइपलाइन के साथ जो डिवाइस7 द्वारा कैप्चर की गई पत्ती छवियों से स्टोमेटा एपर्चर को स्वचालित रूप से मापता है।
रंध्र जीवाणु रोगजनकों के खिलाफ पौधे की जन्मजात प्रतिरक्षा में योगदान करते हैं। इस प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया की कुंजी स्टोमेटाल क्लोजर है जो पत्ती के इंटीरियर में सूक्ष्म छिद्र के माध्यम से बैक्टीरिया के प्रवेश को प्रतिबंधित करता है, जहां जीवाणु रोगजनकों का प्रसार होता है और बीमारियों का कारणबनता है। स्टोमेटाल क्लोजर माइक्रोब से जुड़े आणविक पैटर्न (एमएएमपी), इम्युनोजेनिक अणुओं की मान्यता पर प्रेरित होता है जो अक्सर प्लाज्मा झिल्ली-स्थानीयकृत पैटर्न मान्यता रिसेप्टर्स (पीआरआर)9द्वारा रोगाणुओं के एक वर्ग के लिए आम होते हैं। बैक्टीरियल फ्लैगेलिन का एक 22 एमिनो एसिड एपिटोप जिसे flg22 के रूप में जाना जाता है, एक विशिष्ट एमएएमपी है जो पीआरआर एफएलएस 210 द्वारा इसकी मान्यता के माध्यम से स्टोमेटाल क्लोजर को प्रेरित करता है। एक प्रतिवाद के रूप में, जीवाणु रोगजनकों जैसे स्यूडोमोनास सिरिंज पीवी। टमाटर DC3000 (Pto) और Xanthomonas campestris pv। वेसिकाटोरिया ने रंध्र 9,11,12 को फिर से खोलने के लिए विषाणु तंत्र विकसित किया है। बैक्टीरियल रोगजनकों के लिए इन रंध्र प्रतिक्रियाओं का पारंपरिक रूप से परख में विश्लेषण किया गया है जिसमें या तो पत्ती एपिडर्मल छिलके, पत्ती डिस्क, या अलग पत्तियों को बैक्टीरिया निलंबन पर तैराया जाता है, और फिर स्टोमेटा को माइक्रोस्कोप के नीचे देखा जाता है, जिसके बाद स्टोमेटा एपर्चर का मैनुअल माप होता है। हालांकि, ये परख बोझिल हैं और पौधे से जुड़ी पत्ती में होने वाले प्राकृतिक जीवाणु आक्रमण के लिए स्टोमेटाल प्रतिक्रियाओं को प्रतिबिंबित नहीं कर सकते हैं।
यहां, पीटीओ आक्रमण के दौरान स्टोमेटाल बंद होने और फिर से खोलने की जांच करने के लिए एक सरल विधि प्रस्तुत की जाती है, जो प्राकृतिक पौधे-बैक्टीरिया की बातचीत की बारीकी से नकल करती है। यह विधि पीटीओ के साथ टीका लगाए गए पौधे से जुड़ी पत्ती पर ए. थालियाना रंध्र के प्रत्यक्ष अवलोकन के लिए पोर्टेबल इमेजिंग डिवाइस का लाभ उठाती है, साथ में स्टोमेटा एपर्चर के स्वचालित माप के लिए छवि विश्लेषण पाइपलाइन के साथ।

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Nakarai tesque</td>
			<td>01028-85</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Airbrush kits</td>
			<td>ANEST IWATA</td>
			<td>MX2900</td>
			<td>Accessory kits for SPRINT JET</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotron</td>
			<td>Nippon Medical &#38; Chemical Instruments</td>
			<td>LPH-411S</td>
			<td>Plant Growth Chamber with white fluorescent light</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Wako</td>
			<td>072-00626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Half tray</td>
			<td>Sakata</td>
			<td>72000113</td>
			<td>A set of tray and lid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hyponex</td>
			<td>Hyponex</td>
			<td>No catalogue number available</td>
			<td>Dilute the solution of Hyponex at a ratio of 1:2000 in deionized water for watering plants</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image J</td>
			<td>Natinal Institute of Health</td>
			<td>Download at https://imagej.nih.gov/ij/download.html</td>
			<td>Used for manual measurement of stomatal aperture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2HPO4</td>
			<td>Wako</td>
			<td>164-04295</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Wako</td>
			<td>163-03545</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KOH</td>
			<td>Wako</td>
			<td>168-21815</td>
			<td>For MES-KOH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MES</td>
			<td>Wako</td>
			<td>343-01621</td>
			<td>For MES-KOH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Portable stomatal imaging device</td>
			<td>Phytometrics</td>
			<td>Order at https://www.phytometrics.jp/</td>
			<td>Takagi et al.(2023) doi: 10.1093/pcp/pcad018.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rifampicin</td>
			<td>Wako</td>
			<td>185-01003</td>
			<td>Dissolve in DMSO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silwet-L77</td>
			<td>Bio medical science</td>
			<td>BMS-SL7755</td>
			<td>silicone surfactant used in spray inoculation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPRINT JET</td>
			<td>ANEST IWATA</td>
			<td>IS-800</td>
			<td>Airbrush used for spray inoculation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperMix A</td>
			<td>Sakata seed</td>
			<td>72000083</td>
			<td>Mix with Vermiculite G20 in equal proportions for preparing soil</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone</td>
			<td>Nakarai tesque</td>
			<td>35640-95</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vermiculite G20</td>
			<td>Nittai</td>
			<td>No catalogue number available</td>
			<td>Mix with Super Mix A in equal proportions for preparing soil</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>White fluorescent light</td>
			<td>NEC</td>
			<td>FHF32EX-N-HX-S</td>
			<td>Used for Biotron</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

direct observation and automated measurement of stomatal responses to pseudomonas syringae pv. tomato dc3000 in arabidopsis thaliana

स्टोमेटा सूक्ष्म छिद्र होते हैं जो पौधे की पत्ती एपिडर्मिस में पाए जाते हैं। स्टोमेटा एपर्चर का विनियमन न केवल प्रकाश संश्लेषण और वाष्पोत्सर्जन पानी के नुकसान के लिए कार्बन डाइऑक्साइड तेज को संतुलित करने के लिए बल्कि बैक्टीरिया के आक्रमण को प्रतिबंधित करने के लिए भी महत्वपूर्ण है। जबकि पौधे रोगाणुओं की पहचान पर रंध्र को बंद कर देते हैं, रोगजनक बैक्टीरिया, जैसे कि स्यूडोमोनास सिरिंज पीवी। टमाटर DC3000 (Pto), पत्ती के इंटीरियर में पहुंच प्राप्त करने के लिए बंद रंध्र को फिर से खोलें। बैक्टीरियल आक्रमण के लिए स्टोमेटाल प्रतिक्रियाओं का आकलन करने के लिए पारंपरिक assays में, पत्ती एपिडर्मल peels, पत्ती डिस्क, या अलग पत्तियों बैक्टीरियल निलंबन पर तैरता रहे हैं, और फिर रंध्र एक खुर्दबीन के नीचे stomatal एपर्चर के मैनुअल माप के बाद मनाया जाता है. हालांकि, ये परख बोझिल हैं और पौधे से जुड़ी पत्ती में प्राकृतिक जीवाणु आक्रमण के लिए स्टोमेटा प्रतिक्रियाओं को प्रतिबिंबित नहीं कर सकते हैं। हाल ही में, एक पोर्टेबल इमेजिंग डिवाइस विकसित किया गया था जो पौधे से अलग किए बिना एक पत्ती को पिंच करके रंध्र का निरीक्षण कर सकता है, साथ में एक गहरी सीखने-आधारित छवि विश्लेषण पाइपलाइन के साथ डिवाइस द्वारा कैप्चर की गई पत्ती छवियों से स्टोमेटा एपर्चर को स्वचालित रूप से मापने के लिए डिज़ाइन किया गया है। यहां, इन तकनीकी प्रगति पर निर्माण, अरबिडोप्सिस थालियाना में बैक्टीरिया के आक्रमण के लिए स्टोमेटाल प्रतिक्रियाओं का आकलन करने के लिए एक नई विधि पेश की गई है। इस विधि में तीन सरल चरण होते हैं: प्राकृतिक संक्रमण प्रक्रियाओं की नकल करने वाले पीटीओ का स्प्रे इनोक्यूलेशन, पोर्टेबल इमेजिंग डिवाइस का उपयोग करके पीटीओ-इनोक्यूलेटेड प्लांट के एक पत्ते पर रंध्र का प्रत्यक्ष अवलोकन, और छवि विश्लेषण पाइपलाइन द्वारा स्टोमेटा एपर्चर का स्वचालित माप। इस पद्धति का उपयोग सफलतापूर्वक प्राकृतिक पौधे-बैक्टीरिया बातचीत की बारीकी से नकल करने वाली परिस्थितियों में पीटीओ आक्रमण के दौरान स्टोमेटाल बंद करने और फिर से खोलने के लिए किया गया था।

Stomata are microscopic pores surrounded by a pair of guard cells on the surface of leaves and other aerial parts of plants. Under ever-changing environments, regulation of the stomatal aperture is central for plants to control the carbon dioxide uptake required for photosynthesis at the expense of water loss via transpiration. Thus, quantification of the stomatal aperture has been instrumental to understanding plant environmental adaptation. However, quantifying the stomatal aperture is inherently time-consuming and cumbersome as it requires human labor to spot and measure stomatal pores in a leaf image captured by a microscope. To circumvent these limitations, various methods have been developed to facilitate the quantification of stomatal aperture in Arabidopsis thaliana, a model plant extensively used to study stomatal biology1,2,3,4,5,6. For instance, a porometer can be used to measure transpiration rate as a metric of stomatal conductance. However, this method does not provide direct information on the stomatal number and aperture that determine stomatal conductance. Some studies have used confocal microscopy techniques highlighting stomatal pores using a fluorescent actin marker, a fluorescent dye, or cell wall autofluorescence1,2,3,4,5. While these approaches facilitate the detection of stomata, the cost of both operating a confocal microscopy facility and preparing microscopy samples can be an obstacle to routine application. In a ground-breaking work by Sai et al., a deep neural network model was developed to automatically measure stomatal aperture from bright-field microscopic images of A. thaliana epidermal peels6. Yet, this innovation does not exempt researchers from the task of preparing an epidermal peel for microscopic observation. Recently, this obstacle was overcome by developing a portable imaging device that can observe stomata by pinching a leaf of A. thaliana, together with a deep learning-based image analysis pipeline that automatically measures stomatal aperture from leaf images captured by the device7.
Stomata contribute to plant innate immunity against bacterial pathogens. The key to this immune response is stomatal closure that restricts bacterial entry through the microscopic pore into the leaf interior, where bacterial pathogens proliferate and cause diseases8. Stomatal closure is induced upon recognition of microbe-associated molecular patterns (MAMPs), immunogenic molecules that are often common to a class of microbes, by plasma membrane-localized pattern recognition receptors (PRRs)9. A 22 amino acid epitope of bacterial flagellin known as flg22 is a typical MAMP that induces stomatal closure through its recognition by the PRR FLS210. As a countermeasure, bacterial pathogens such as Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 (Pto) and Xanthomonas campestris pv. vesicatoria have evolved virulence mechanisms to reopen stomata9,11,12. These stomatal responses to bacterial pathogens have been conventionally analyzed in assays in which either leaf epidermal peels, leaf discs, or detached leaves are floated on bacterial suspension, and then stomata are observed under a microscope followed by manual measurement of stomatal aperture. However, these assays are cumbersome and may not reflect stomatal responses to natural bacterial invasion that occur in a leaf attached to the plant.
Here, a simple method is presented to investigate stomatal closure and reopening during Pto invasion under the condition that closely mimics the natural plant-bacteria interaction. This method leverages the portable imaging device for direct observation of A. thaliana stomata on a leaf attached to the plant inoculated with Pto, together with the image analysis pipeline for automated measurement of stomatal aperture.

लेखक स्पॉटलाइट: स्वचालित एपर्चर मापन के साथ स्टोमेटाल रिसर्च को आगे बढ़ाना

स्यूडोमोनास सिरिंज पीवी के लिए स्टोमेटाल प्रतिक्रियाओं का प्रत्यक्ष अवलोकन और स्वचालित मापन। टमाटर DC3000 Arabidopsis thaliana में

Plantal stomata play central roles in adaptation to stress conditions, so we need to measure stomata aperture to understand how plants respond to biotic and abiotic stresses. However, stomata aperture measurement is time-consuming and cumbersome. To measure stomata aperture, we peel the epidermis and observe stomata under a microscope.Then we manually measure stomata aperture, which takes a long time even for very experienced researchers. We challenged these barriers and developed a tool and a technique that can automatically measure stomata aperture in intact Arabidopsis leaves. So we strongly believe that stomata measuring device and deep-learning algorithm that we developed will facilitate functional analysis of stomata responses to various biotic and abiotic stresses because these technical advances significantly reduce time and human labor required for stomata aperture measurement.

पीटीओ के स्प्रे टीकाकरण के बाद, टीका लगाए गए पौधों से जुड़ी पत्तियों पर रंध्र सीधे पोर्टेबल स्टोमेटा इमेजिंग डिवाइस द्वारा देखे गए थे। मैनुअल और स्वचालित माप का उपयोग करते हुए, लगभग 60 रंध्रों की लंब...

Watch this Scientific Journal Video about Author Spotlight: Advancing Stomatal Research with Automated Aperture Measurement at JoVE.com

यहां, हम अरबिडोप्सिस थालियाना में जीवाणु आक्रमण के लिए स्टोमेटाल प्रतिक्रियाओं के प्रत्यक्ष अवलोकन और स्वचालित माप के लिए एक सरल विधि प्रस्तुत करते हैं। यह विधि एक पोर्टेबल स्टोमेटा इमेजिंग डिवाइस का लाभ उठाती है, साथ में डिवाइस द्वारा कैप्चर की गई पत्ती छवियों के लिए डिज़ाइन की गई छवि विश्लेषण पाइपलाइन के साथ।

Stomata are microscopic pores found in the plant leaf epidermis. Regulation of stomatal aperture is pivotal not only for balancing carbon dioxide uptake ...

प्लांटल स्टोमेटा तनाव की स्थिति के अनुकूलन में केंद्रीय भूमिका निभाते हैं, इसलिए हमें यह समझने के लिए रंध्र एपर्चर को मापने की आवश्यकता है कि पौधे जैविक और अजैविक तनावों का जवाब कैसे देते हैं। हालांकि, रंध्र एपर्चर माप समय लेने वाली और बोझिल है। रंध्र एपर्चर को मापने के लिए, हम एपिडर्मिस को छीलते हैं और माइक्रोस्कोप के नीचे रंध्र का निरीक्षण करते हैं।फिर हम मैन्युअल रूप से स्टोमेटा एपर्चर को मापते हैं, जो बहुत अनुभवी शोधकर्ताओं के लिए भी लंबा समय लेता है। हमने इन बाधाओं को चुनौती दी और एक उपकरण और एक तकनीक विकसित की जो स्वचालित रूप से बरकरार अरबिडोप्सिस पत्तियों में रंध्र एपर्चर को माप सकती है। इसलिए हम दृढ़ता से मानते हैं कि स्टोमेटा मापने वाला उपकरण और डीप-लर्निंग एल्गोरिदम जो हमने विकसित किया है, विभिन्न जैविक और अजैविक तनावों के लिए रंध्र प्रतिक्रियाओं के कार्यात्मक विश्लेषण की सुविधा प्रदान करेगा क्योंकि ये तकनीकी प्रगति स्टोमेटा एपर्चर माप के लिए आवश्यक समय और मानव श्रम को काफी कम कर देती है।

direct-observation-automated-measurement-stomatal-responses-to

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Direct Observation and Automated Measurement of Stomatal Responses to Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 in Arabidopsis thaliana

Stomata are microscopic pores found in the plant leaf epidermis. Regulation of stomatal aperture is pivotal not only for balancing carbon dioxide uptake for photosynthesis and transpirational water loss but also for restricting bacterial invasion. While plants close stomata upon recognition of microbes, pathogenic bacteria, such as Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 (Pto), reopen the closed stomata to gain access into the leaf interior. In conventional assays for assessing stomatal responses to bacterial invasion, leaf epidermal peels, leaf discs, or detached leaves are floated on bacterial suspension, and then stomata are observed under a microscope followed by manual measurement of stomatal aperture. However, these assays are cumbersome and may not reflect stomatal responses to natural bacterial invasion in a leaf attached to the plant. Recently, a portable imaging device was developed that can observe stomata by pinching a leaf without detaching it from the plant, together with a deep learning-based image analysis pipeline designed to automatically measure stomatal aperture from leaf images captured by the device. Here, building on these technical advances, a new method to assess stomatal responses to bacterial invasion in Arabidopsis thaliana is introduced. This method consists of three simple steps: spray inoculation of Pto mimicking natural infection processes, direct observation of stomata on a leaf of the Pto-inoculated plant using the portable imaging device, and automated measurement of stomatal aperture by the image analysis pipeline. This method was successfully used to demonstrate stomatal closure and reopening during Pto invasion under conditions that closely mimic the natural plant-bacteria interaction.

Here, we present a simple method for direct observation and automated measurement of stomatal responses to bacterial invasion in Arabidopsis thaliana. This method leverages a portable stomatal imaging device, together with an image analysis pipeline designed for leaf images captured by the device.

Induction of Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 Infection in Arabidopsis thaliana for Automated Stomatal Response Measurement

स्यूडोमोनास सिरिंज का प्रेरण पी.वी. टमाटर DC3000 स्वचालित रंठल प्रतिक्रिया मापन के लिए Arabidopsis thaliana में संक्रमण

Automated Measurement of Stomatal Response in Arabidopsis thaliana in Response to Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 Infection