Name: Autore in primo piano: Far progredire la ricerca stomatica con la misurazione automatizzata dell'apertura
Uploaded: 2024-02-09T13:55:00
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Ringraziamo tutti i membri del progetto di ricerca, "Co-creazione di tratti adattativi vegetali tramite assemblaggio di olobionte pianta-microbo", per le fruttuose discussioni. Questo lavoro è stato sostenuto da Grant-in-Aid for Transformative Research Areas (21H05151 e 21H05149 ad A.M. e 21H05152 a Y.T.) e Grant-in-Aid for Challenging Exploratory Research (22K19178 ad A. M.).

1. Piante in crescita
<ol><li>Per interrompere la dormienza, risospendere i semi di A. thaliana (Col-0) in acqua deionizzata e incubarli a 4 °C per 4 giorni al buio.</li>
	<li>Semina i semi sul terreno e coltiva in una camera dotata di luce fluorescente bianca. Mantenere le seguenti condizioni di crescita: temperatura di 22 °C, intensità luminosa di 6.000 lux (ca. 100 μmol/m2/s) per 10 ore e umidità relativa del 60%.</li>
	<li>Quando necessario, annaffia le piante con un fertil...

Misurazione automatizzata della risposta stomatica all'invasione batterica nell'Arabidopsis

<ol>
	<li>Shimono, M., Higaki, T., Kaku, H., Shibuya, N., Hasezawa, S., Day, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+evaluation+of+stomatal+cytoskeletal+patterns+during+the+activation+of+immune+signaling+in+Arabidopsis+thaliana.">Quantitative evaluation of stomatal cytoskeletal patterns during the activation of immune signaling in Arabidopsis thaliana.</a> PLoS One. 11, e0159291 (2016).</li><li>Bourdais, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+quantitative+imaging+to+investigate+regulators+of+membrane+trafficking+in+Arabidopsis+stomatal+closure.">The use of quantitative imaging to investigate regulators of membrane trafficking in Arabidopsis stomatal closure.</a> Traffic. 20 (2), 168-180 (2019).</li><li>Higaki, T., Kutsuna, N., Hasezawa, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CARTA-based+semi-automatic+detection+of+stomatal+regions+on+an+Arabidopsis+cotyledon+surface.">CARTA-based semi-automatic detection of stomatal regions on an Arabidopsis cotyledon surface.</a> Plant Morphology. 26 (1), 9-12 (2014).</li><li>Eisele, J. F., F&#228;&#223;ler, F., B&#252;rgel, F., Chaban, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+and+simple+method+for+microscopy-based+stomata+analyses.">A rapid and simple method for microscopy-based stomata analyses.</a> PLoS One. 11, e0164576 (2016).</li><li>Chitraker, R., Melotto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+stomatal+response+to+live+bacterial+cells+using+whole+leaf+imaging.">Assessing stomatal response to live bacterial cells using whole leaf imaging.</a> Journal of Visualized Experiments. 44, 2185 (2010).</li><li>Sai, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=StomaAI:+an+efficient+and+user-friendly+tool+for+measurement+of+stomatal+pores+and+density+using+deep+computer+vision.">StomaAI: an efficient and user-friendly tool for measurement of stomatal pores and density using deep computer vision.</a> New Phytologist. 238 (2), 904-915 (2023).</li><li>Takagi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Image-based+quantification+of+Arabidopsis+thaliana+stomatal+aperture+from+leaf+images.">Image-based quantification of Arabidopsis thaliana stomatal aperture from leaf images.</a> Plant and Cell Physiology. pcad018, (2023).</li><li>Melotto, M., Zhang, L., Oblessuc, P. R., He, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stomatal+defense+a+decade+later.">Stomatal defense a decade later.</a> Plant Physiology. 174 (2), 561-571 (2017).</li><li>Melotto, M., Underwood, W., Koczan, J., Nomura, K., He, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant+stomata+function+in+innate+immunity+against+bacterial+invasion.">Plant stomata function in innate immunity against bacterial invasion.</a> Cell. 126 (5), 969-980 (2006).</li><li>Zeng, W., He, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+prominent+role+of+the+flagellin+receptor+FLAGELLIN-SENSING2+in+mediating+stomatal+response+to+Pseudomonas+syringae+pv+tomato+DC3000+in+Arabidopsis.">A prominent role of the flagellin receptor FLAGELLIN-SENSING2 in mediating stomatal response to Pseudomonas syringae pv tomato DC3000 in Arabidopsis.</a> Plant Physiology. 153 (3), 1188-1198 (2010).</li><li>Zheng, X. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coronatine+promotes+Pseudomonas+syringae+virulence+in+plants+by+activating+a+signaling+cascade+that+inhibits+salicylic+acid+accumulation.">Coronatine promotes Pseudomonas syringae virulence in plants by activating a signaling cascade that inhibits salicylic acid accumulation.</a> Cell Host and Microbe. 11 (6), 587-596 (2012).</li><li>Raffeiner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Xanthomonas+type-III+effector+XopS+stabilizes+CaWRKY40a+to+regulate+defense+responses+and+stomatal+immunity+in+pepper+(Capsicum+annuum).">The Xanthomonas type-III effector XopS stabilizes CaWRKY40a to regulate defense responses and stomatal immunity in pepper (Capsicum annuum).</a> The Plant Cell. 34 (5), 1684-1708 (2022).</li><li>Munemasa, S., Hauser, F., Park, J., Waadt, R., Brandt, B., Schroeder, J. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+abscisic+acid-mediated+control+of+stomatal+aperture.">Mechanisms of abscisic acid-mediated control of stomatal aperture.</a> Current Opinion in Plant Biology. 28, 154-162 (2015).</li><li>F&#246;rster, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wounding-induced+stomatal+closure+requires+jasmonate-mediated+activation+of+GORK+K++channels+by+a+Ca2++sensor-kinase+CBL1-CIPK5+complex.">Wounding-induced stomatal closure requires jasmonate-mediated activation of GORK K+ channels by a Ca2+ sensor-kinase CBL1-CIPK5 complex.</a> Developmental Cell. 48 (1), 87-99 (2018).</li><li>Cheng, Y. T., Zhang, L., He, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant-microbe+interactions+facing+environmental+challenge.">Plant-microbe interactions facing environmental challenge.</a> Cell Host and Microbe. 26 (2), 183-192 (2019).</li></ol>

Studi precedenti hanno utilizzato peeling epidermici, dischi fogliari o foglie staccate per studiare le risposte stomatiche alle invasioni batteriche 9,11,12. Al contrario, il metodo proposto in questo studio sfrutta il dispositivo portatile di imaging stomatico per osservare direttamente gli stomi su una foglia attaccata alla pianta dopo l'inoculazione spray di Pto, imitando le condizioni naturali di invasione batteric...

Gli stomi sono pori microscopici circondati da un paio di cellule di guardia sulla superficie delle foglie e di altre parti aeree delle piante. In ambienti in continua evoluzione, la regolazione dell'apertura stomatica è fondamentale per le piante per controllare l'assorbimento di anidride carbonica necessario per la fotosintesi a scapito della perdita d'acqua attraverso la traspirazione. Pertanto, la quantificazione dell'apertura stomatica è stata fondamentale per comprendere l'adattamento ambientale delle piante. Tuttavia, la quantificazione dell'apertura stomatica è intrinsecamente dispendiosa in termini di tempo e ingombrante in quanto richiede il lavoro umano per individuare e misurare i pori stomatici in un'immagine fogliare catturata da un microscopio. Per aggirare queste limitazioni, sono stati sviluppati vari metodi per facilitare la quantificazione dell'apertura stomatica in Arabidopsis thaliana, una pianta modello ampiamente utilizzata per studiare la biologia stomatica 1,2,3,4,5,6. Ad esempio, un porometro può essere utilizzato per misurare il tasso di traspirazione come metrica della conduttanza stomatica. Tuttavia, questo metodo non fornisce informazioni dirette sul numero stomatico e sull'apertura che determinano la conduttanza stomatica. Alcuni studi hanno utilizzato tecniche di microscopia confocale che evidenziano i pori stomatici utilizzando un marcatore di actina fluorescente, un colorante fluorescente o l'autofluorescenza della parete cellulare 1,2,3,4,5. Sebbene questi approcci facilitino il rilevamento degli stomi, il costo sia del funzionamento di una struttura di microscopia confocale che della preparazione dei campioni di microscopia può essere un ostacolo all'applicazione di routine. In un lavoro pionieristico di Sai et al., è stato sviluppato un modello di rete neurale profonda per misurare automaticamente l'apertura stomatica da immagini microscopiche in campo chiaro di peeling epidermici di A. thaliana 6. Tuttavia, questa innovazione non esenta i ricercatori dal compito di preparare un peeling epidermico per l'osservazione microscopica. Recentemente, questo ostacolo è stato superato sviluppando un dispositivo di imaging portatile in grado di osservare gli stomi pizzicando una foglia di A. thaliana, insieme a una pipeline di analisi delle immagini basata sul deep learning che misura automaticamente l'apertura stomatica dalle immagini delle foglie catturate dal dispositivo7.
Gli stomi contribuiscono all'immunità innata delle piante contro i patogeni batterici. La chiave di questa risposta immunitaria è la chiusura stomatica che limita l'ingresso dei batteri attraverso il poro microscopico all'interno della foglia, dove i patogeni batterici proliferano e causano malattie8. La chiusura stomatica è indotta dal riconoscimento di pattern molecolari associati a microbi (MAMP), molecole immunogeniche spesso comuni a una classe di microbi, da parte dei recettori di riconoscimento dei pattern localizzati sulla membrana plasmatica (PRR)9. Un epitopo di 22 amminoacidi della flagellina batterica noto come flg22 è un tipico MAMP che induce la chiusura stomatica attraverso il suo riconoscimento da parte del PRR FLS210. Come contromisura, patogeni batterici come Pseudomonas syringae pv. pomodoro DC3000 (presa di forza) e Xanthomonas campestris pv. Le vesciche hanno sviluppato meccanismi di virulenza per riaprire gli stomi 9,11,12. Queste risposte stomatiche ai patogeni batterici sono state convenzionalmente analizzate in saggi in cui le bucce epidermiche delle foglie, i dischi fogliari o le foglie staccate vengono fatti galleggiare su una sospensione batterica, quindi gli stomi vengono osservati al microscopio seguiti dalla misurazione manuale dell'apertura stomatica. Tuttavia, questi saggi sono ingombranti e potrebbero non riflettere le risposte stomatiche all'invasione batterica naturale che si verificano in una foglia attaccata alla pianta.
Qui, viene presentato un metodo semplice per studiare la chiusura e la riapertura stomatica durante l'invasione della presa di forza in condizioni che imitano da vicino l'interazione naturale pianta-batterio. Questo metodo sfrutta il dispositivo di imaging portatile per l'osservazione diretta degli stomi di A. thaliana su una foglia attaccata alla pianta inoculata con Pto, insieme alla pipeline di analisi delle immagini per la misurazione automatizzata dell'apertura stomatica.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Nakarai tesque</td>
			<td>01028-85</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Airbrush kits</td>
			<td>ANEST IWATA</td>
			<td>MX2900</td>
			<td>Accessory kits for SPRINT JET</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotron</td>
			<td>Nippon Medical &#38; Chemical Instruments</td>
			<td>LPH-411S</td>
			<td>Plant Growth Chamber with white fluorescent light</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Wako</td>
			<td>072-00626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Half tray</td>
			<td>Sakata</td>
			<td>72000113</td>
			<td>A set of tray and lid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hyponex</td>
			<td>Hyponex</td>
			<td>No catalogue number available</td>
			<td>Dilute the solution of Hyponex at a ratio of 1:2000 in deionized water for watering plants</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image J</td>
			<td>Natinal Institute of Health</td>
			<td>Download at https://imagej.nih.gov/ij/download.html</td>
			<td>Used for manual measurement of stomatal aperture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2HPO4</td>
			<td>Wako</td>
			<td>164-04295</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Wako</td>
			<td>163-03545</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KOH</td>
			<td>Wako</td>
			<td>168-21815</td>
			<td>For MES-KOH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MES</td>
			<td>Wako</td>
			<td>343-01621</td>
			<td>For MES-KOH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Portable stomatal imaging device</td>
			<td>Phytometrics</td>
			<td>Order at https://www.phytometrics.jp/</td>
			<td>Takagi et al.(2023) doi: 10.1093/pcp/pcad018.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rifampicin</td>
			<td>Wako</td>
			<td>185-01003</td>
			<td>Dissolve in DMSO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silwet-L77</td>
			<td>Bio medical science</td>
			<td>BMS-SL7755</td>
			<td>silicone surfactant used in spray inoculation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPRINT JET</td>
			<td>ANEST IWATA</td>
			<td>IS-800</td>
			<td>Airbrush used for spray inoculation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperMix A</td>
			<td>Sakata seed</td>
			<td>72000083</td>
			<td>Mix with Vermiculite G20 in equal proportions for preparing soil</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone</td>
			<td>Nakarai tesque</td>
			<td>35640-95</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vermiculite G20</td>
			<td>Nittai</td>
			<td>No catalogue number available</td>
			<td>Mix with Super Mix A in equal proportions for preparing soil</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>White fluorescent light</td>
			<td>NEC</td>
			<td>FHF32EX-N-HX-S</td>
			<td>Used for Biotron</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

direct observation and automated measurement of stomatal responses to pseudomonas syringae pv. tomato dc3000 in arabidopsis thaliana

Gli stomi sono pori microscopici che si trovano nell'epidermide fogliare della pianta. La regolazione dell'apertura stomatica è fondamentale non solo per bilanciare l'assorbimento di anidride carbonica per la fotosintesi e la perdita d'acqua traspirante, ma anche per limitare l'invasione batterica. Mentre le piante chiudono gli stomi al riconoscimento di microbi, i batteri patogeni, come Pseudomonas syringae pv. pomodoro DC3000 (Pto), riaprire gli stomi chiusi per accedere all'interno della foglia. Nei saggi convenzionali per la valutazione delle risposte stomatiche all'invasione batterica, i peeling epidermici delle foglie, i dischi fogliari o le foglie staccate vengono fatti galleggiare su una sospensione batterica, quindi gli stomi vengono osservati al microscopio seguiti dalla misurazione manuale dell'apertura stomatica. Tuttavia, questi saggi sono ingombranti e potrebbero non riflettere le risposte stomatiche all'invasione batterica naturale in una foglia attaccata alla pianta. Recentemente, è stato sviluppato un dispositivo di imaging portatile in grado di osservare gli stomi pizzicando una foglia senza staccarla dalla pianta, insieme a una pipeline di analisi delle immagini basata sul deep learning progettata per misurare automaticamente l'apertura stomatica dalle immagini delle foglie catturate dal dispositivo. Qui, sulla base di questi progressi tecnici, viene introdotto un nuovo metodo per valutare le risposte stomatiche all'invasione batterica in Arabidopsis thaliana . Questo metodo consiste in tre semplici fasi: inoculazione a spruzzo di Pto che imita i processi di infezione naturali, osservazione diretta degli stomi su una foglia della pianta inoculata con presa di forza utilizzando il dispositivo di imaging portatile e misurazione automatizzata dell'apertura stomatica tramite la pipeline di analisi delle immagini. Questo metodo è stato utilizzato con successo per dimostrare la chiusura e la riapertura stomatica durante l'invasione della presa di forza in condizioni che imitano da vicino l'interazione naturale pianta-batterio.

Stomata are microscopic pores surrounded by a pair of guard cells on the surface of leaves and other aerial parts of plants. Under ever-changing environments, regulation of the stomatal aperture is central for plants to control the carbon dioxide uptake required for photosynthesis at the expense of water loss via transpiration. Thus, quantification of the stomatal aperture has been instrumental to understanding plant environmental adaptation. However, quantifying the stomatal aperture is inherently time-consuming and cumbersome as it requires human labor to spot and measure stomatal pores in a leaf image captured by a microscope. To circumvent these limitations, various methods have been developed to facilitate the quantification of stomatal aperture in Arabidopsis thaliana, a model plant extensively used to study stomatal biology1,2,3,4,5,6. For instance, a porometer can be used to measure transpiration rate as a metric of stomatal conductance. However, this method does not provide direct information on the stomatal number and aperture that determine stomatal conductance. Some studies have used confocal microscopy techniques highlighting stomatal pores using a fluorescent actin marker, a fluorescent dye, or cell wall autofluorescence1,2,3,4,5. While these approaches facilitate the detection of stomata, the cost of both operating a confocal microscopy facility and preparing microscopy samples can be an obstacle to routine application. In a ground-breaking work by Sai et al., a deep neural network model was developed to automatically measure stomatal aperture from bright-field microscopic images of A. thaliana epidermal peels6. Yet, this innovation does not exempt researchers from the task of preparing an epidermal peel for microscopic observation. Recently, this obstacle was overcome by developing a portable imaging device that can observe stomata by pinching a leaf of A. thaliana, together with a deep learning-based image analysis pipeline that automatically measures stomatal aperture from leaf images captured by the device7.
Stomata contribute to plant innate immunity against bacterial pathogens. The key to this immune response is stomatal closure that restricts bacterial entry through the microscopic pore into the leaf interior, where bacterial pathogens proliferate and cause diseases8. Stomatal closure is induced upon recognition of microbe-associated molecular patterns (MAMPs), immunogenic molecules that are often common to a class of microbes, by plasma membrane-localized pattern recognition receptors (PRRs)9. A 22 amino acid epitope of bacterial flagellin known as flg22 is a typical MAMP that induces stomatal closure through its recognition by the PRR FLS210. As a countermeasure, bacterial pathogens such as Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 (Pto) and Xanthomonas campestris pv. vesicatoria have evolved virulence mechanisms to reopen stomata9,11,12. These stomatal responses to bacterial pathogens have been conventionally analyzed in assays in which either leaf epidermal peels, leaf discs, or detached leaves are floated on bacterial suspension, and then stomata are observed under a microscope followed by manual measurement of stomatal aperture. However, these assays are cumbersome and may not reflect stomatal responses to natural bacterial invasion that occur in a leaf attached to the plant.
Here, a simple method is presented to investigate stomatal closure and reopening during Pto invasion under the condition that closely mimics the natural plant-bacteria interaction. This method leverages the portable imaging device for direct observation of A. thaliana stomata on a leaf attached to the plant inoculated with Pto, together with the image analysis pipeline for automated measurement of stomatal aperture.

Autore in primo piano: Far progredire la ricerca stomatica con la misurazione automatizzata dell'apertura

Osservazione diretta e misurazione automatizzata delle risposte stomatiche a Pseudomonas syringae pv. pomodoro DC3000 in Arabidopsis thaliana

Plantal stomata play central roles in adaptation to stress conditions, so we need to measure stomata aperture to understand how plants respond to biotic and abiotic stresses. However, stomata aperture measurement is time-consuming and cumbersome. To measure stomata aperture, we peel the epidermis and observe stomata under a microscope.Then we manually measure stomata aperture, which takes a long time even for very experienced researchers. We challenged these barriers and developed a tool and a technique that can automatically measure stomata aperture in intact Arabidopsis leaves. So we strongly believe that stomata measuring device and deep-learning algorithm that we developed will facilitate functional analysis of stomata responses to various biotic and abiotic stresses because these technical advances significantly reduce time and human labor required for stomata aperture measurement.

Dopo l'inoculazione spray di Pto, gli stomi sulle foglie attaccate alle piante inoculate sono stati osservati direttamente dal dispositivo di imaging stomatico portatile. Utilizzando misurazioni manuali e automatizzate, le stesse immagini delle foglie sono state utilizzate per calcolare l'apertura stomatica prendendo rapporti tra larghezza e lunghezza di circa 60 stomi. Le misurazioni manuali e automatizzate hanno indicato costantemente una diminuzione dell'apertura stomatica nelle piante inoculate con presa...

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Qui, presentiamo un metodo semplice per l'osservazione diretta e la misurazione automatizzata delle risposte stomatiche all'invasione batterica in Arabidopsis thaliana. Questo metodo sfrutta un dispositivo di imaging stomatico portatile, insieme a una pipeline di analisi delle immagini progettata per le immagini delle foglie catturate dal dispositivo.

Stomata are microscopic pores found in the plant leaf epidermis. Regulation of stomatal aperture is pivotal not only for balancing carbon dioxide uptake ...

Gli stomi plantari svolgono un ruolo centrale nell'adattamento alle condizioni di stress, quindi dobbiamo misurare l'apertura degli stomi per capire come le piante rispondono agli stress biotici e abiotici. Tuttavia, la misurazione dell'apertura degli stomi è dispendiosa in termini di tempo e ingombrante. Per misurare l'apertura degli stomi, sbucciamo l'epidermide e osserviamo gli stomi al microscopio.Quindi misuriamo manualmente l'apertura degli stomi, il che richiede molto tempo anche per i ricercatori molto esperti. Abbiamo sfidato queste barriere e sviluppato uno strumento e una tecnica in grado di misurare automaticamente l'apertura degli stomi nelle foglie intatte di Arabidopsis. Quindi crediamo fermamente che il dispositivo di misurazione degli stomi e l'algoritmo di deep learning che abbiamo sviluppato faciliteranno l'analisi funzionale delle risposte degli stomi a vari stress biotici e abiotici perché questi progressi tecnici riducono significativamente il tempo e il lavoro umano necessari per la misurazione dell'apertura degli stomi.

direct-observation-automated-measurement-stomatal-responses-to

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Direct Observation and Automated Measurement of Stomatal Responses to Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 in Arabidopsis thaliana

Stomata are microscopic pores found in the plant leaf epidermis. Regulation of stomatal aperture is pivotal not only for balancing carbon dioxide uptake for photosynthesis and transpirational water loss but also for restricting bacterial invasion. While plants close stomata upon recognition of microbes, pathogenic bacteria, such as Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 (Pto), reopen the closed stomata to gain access into the leaf interior. In conventional assays for assessing stomatal responses to bacterial invasion, leaf epidermal peels, leaf discs, or detached leaves are floated on bacterial suspension, and then stomata are observed under a microscope followed by manual measurement of stomatal aperture. However, these assays are cumbersome and may not reflect stomatal responses to natural bacterial invasion in a leaf attached to the plant. Recently, a portable imaging device was developed that can observe stomata by pinching a leaf without detaching it from the plant, together with a deep learning-based image analysis pipeline designed to automatically measure stomatal aperture from leaf images captured by the device. Here, building on these technical advances, a new method to assess stomatal responses to bacterial invasion in Arabidopsis thaliana is introduced. This method consists of three simple steps: spray inoculation of Pto mimicking natural infection processes, direct observation of stomata on a leaf of the Pto-inoculated plant using the portable imaging device, and automated measurement of stomatal aperture by the image analysis pipeline. This method was successfully used to demonstrate stomatal closure and reopening during Pto invasion under conditions that closely mimic the natural plant-bacteria interaction.

Here, we present a simple method for direct observation and automated measurement of stomatal responses to bacterial invasion in Arabidopsis thaliana. This method leverages a portable stomatal imaging device, together with an image analysis pipeline designed for leaf images captured by the device.

Ricerca

Immunologia e infezioni

Induction of Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 Infection in Arabidopsis thaliana for Automated Stomatal Response Measurement

Induzione di Pseudomonas syringae pv. pomodoro Infezione DC3000 in Arabidopsis thaliana per la misurazione automatizzata della risposta stomatica

Automated Measurement of Stomatal Response in Arabidopsis thaliana in Response to Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 Infection

Misurazione automatizzata della risposta stomatica in Arabidopsis thaliana in risposta a Pseudomonas syringae pv. pomodoro Infezione DC3000