Name: Forfatter i søkelyset: Fremme stomatal forskning med automatisert blenderåpningsmåling
Uploaded: 2024-02-09T13:55:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Author Spotlight: Advancing Stomatal Research with Automated Aperture Measurement at JoVE.com

Vi takker alle medlemmene i forskningsprosjektet 'Co-creation of plant adaptive traits via assembly of plant-microbe holobiont', for fruktbare diskusjoner. Dette arbeidet ble støttet av Grant-in-Aid for Transformative Research Areas (21H05151 og 21H05149 til AM og 21H05152 til YT) og Grant-in-Aid for utfordrende utforskende forskning (22K19178 til A. M.).

1. Voksende planter
<ol><li>For å bryte dvalen, resuspender A. thaliana (Col-0) frø i avionisert vann og inkuber dem ved 4 ° C i 4 dager i mørket.</li>
	<li>Så frøene på jorden og vokse i et kammer utstyrt med hvitt fluorescerende lys. Oppretthold følgende vekstbetingelser: temperatur på 22 °C, lysintensitet på 6000 lux (ca. 100 μmol/m2/s) i 10 timer og relativ fuktighet på 60 %.</li>
	<li>Når det trengs, vann plantene med flytende gjødsel. Avstå fra vanning fra 1 uk...

Automatisert stomatal responsmåling på bakteriell invasjon i Arabidopsis

<ol>
	<li>Shimono, M., Higaki, T., Kaku, H., Shibuya, N., Hasezawa, S., Day, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+evaluation+of+stomatal+cytoskeletal+patterns+during+the+activation+of+immune+signaling+in+Arabidopsis+thaliana.">Quantitative evaluation of stomatal cytoskeletal patterns during the activation of immune signaling in Arabidopsis thaliana.</a> PLoS One. 11, e0159291 (2016).</li><li>Bourdais, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+quantitative+imaging+to+investigate+regulators+of+membrane+trafficking+in+Arabidopsis+stomatal+closure.">The use of quantitative imaging to investigate regulators of membrane trafficking in Arabidopsis stomatal closure.</a> Traffic. 20 (2), 168-180 (2019).</li><li>Higaki, T., Kutsuna, N., Hasezawa, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CARTA-based+semi-automatic+detection+of+stomatal+regions+on+an+Arabidopsis+cotyledon+surface.">CARTA-based semi-automatic detection of stomatal regions on an Arabidopsis cotyledon surface.</a> Plant Morphology. 26 (1), 9-12 (2014).</li><li>Eisele, J. F., F&#228;&#223;ler, F., B&#252;rgel, F., Chaban, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+and+simple+method+for+microscopy-based+stomata+analyses.">A rapid and simple method for microscopy-based stomata analyses.</a> PLoS One. 11, e0164576 (2016).</li><li>Chitraker, R., Melotto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+stomatal+response+to+live+bacterial+cells+using+whole+leaf+imaging.">Assessing stomatal response to live bacterial cells using whole leaf imaging.</a> Journal of Visualized Experiments. 44, 2185 (2010).</li><li>Sai, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=StomaAI:+an+efficient+and+user-friendly+tool+for+measurement+of+stomatal+pores+and+density+using+deep+computer+vision.">StomaAI: an efficient and user-friendly tool for measurement of stomatal pores and density using deep computer vision.</a> New Phytologist. 238 (2), 904-915 (2023).</li><li>Takagi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Image-based+quantification+of+Arabidopsis+thaliana+stomatal+aperture+from+leaf+images.">Image-based quantification of Arabidopsis thaliana stomatal aperture from leaf images.</a> Plant and Cell Physiology. pcad018, (2023).</li><li>Melotto, M., Zhang, L., Oblessuc, P. R., He, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stomatal+defense+a+decade+later.">Stomatal defense a decade later.</a> Plant Physiology. 174 (2), 561-571 (2017).</li><li>Melotto, M., Underwood, W., Koczan, J., Nomura, K., He, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant+stomata+function+in+innate+immunity+against+bacterial+invasion.">Plant stomata function in innate immunity against bacterial invasion.</a> Cell. 126 (5), 969-980 (2006).</li><li>Zeng, W., He, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+prominent+role+of+the+flagellin+receptor+FLAGELLIN-SENSING2+in+mediating+stomatal+response+to+Pseudomonas+syringae+pv+tomato+DC3000+in+Arabidopsis.">A prominent role of the flagellin receptor FLAGELLIN-SENSING2 in mediating stomatal response to Pseudomonas syringae pv tomato DC3000 in Arabidopsis.</a> Plant Physiology. 153 (3), 1188-1198 (2010).</li><li>Zheng, X. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coronatine+promotes+Pseudomonas+syringae+virulence+in+plants+by+activating+a+signaling+cascade+that+inhibits+salicylic+acid+accumulation.">Coronatine promotes Pseudomonas syringae virulence in plants by activating a signaling cascade that inhibits salicylic acid accumulation.</a> Cell Host and Microbe. 11 (6), 587-596 (2012).</li><li>Raffeiner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Xanthomonas+type-III+effector+XopS+stabilizes+CaWRKY40a+to+regulate+defense+responses+and+stomatal+immunity+in+pepper+(Capsicum+annuum).">The Xanthomonas type-III effector XopS stabilizes CaWRKY40a to regulate defense responses and stomatal immunity in pepper (Capsicum annuum).</a> The Plant Cell. 34 (5), 1684-1708 (2022).</li><li>Munemasa, S., Hauser, F., Park, J., Waadt, R., Brandt, B., Schroeder, J. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+abscisic+acid-mediated+control+of+stomatal+aperture.">Mechanisms of abscisic acid-mediated control of stomatal aperture.</a> Current Opinion in Plant Biology. 28, 154-162 (2015).</li><li>F&#246;rster, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wounding-induced+stomatal+closure+requires+jasmonate-mediated+activation+of+GORK+K++channels+by+a+Ca2++sensor-kinase+CBL1-CIPK5+complex.">Wounding-induced stomatal closure requires jasmonate-mediated activation of GORK K+ channels by a Ca2+ sensor-kinase CBL1-CIPK5 complex.</a> Developmental Cell. 48 (1), 87-99 (2018).</li><li>Cheng, Y. T., Zhang, L., He, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant-microbe+interactions+facing+environmental+challenge.">Plant-microbe interactions facing environmental challenge.</a> Cell Host and Microbe. 26 (2), 183-192 (2019).</li></ol>

Tidligere studier brukte epidermal peeling, bladskiver eller frittliggende blader for å undersøke stomatale responser på bakterielle invasjoner 9,11,12. I motsetning til dette utnytter metoden foreslått i denne studien den bærbare stomatale bildebehandlingsenheten for direkte å observere stomata på et blad festet til planten etter sprayinokulering av Pto, som etterligner naturlige forhold for bakteriell invasjon....

Stomata er mikroskopiske porer omgitt av et par vaktceller på overflaten av blader og andre luftdeler av planter. Under stadig skiftende miljøer er regulering av stomatalåpningen sentral for planter å kontrollere karbondioksidopptaket som kreves for fotosyntese på bekostning av vanntap via transpirasjon. Dermed har kvantifisering av stomatal blenderåpning vært medvirkende til å forstå plantens miljøtilpasning. Imidlertid er kvantifisering av stomatal blenderåpning iboende tidkrevende og tungvint, da det krever menneskelig arbeidskraft å oppdage og måle stomatale porer i et bladbilde fanget av et mikroskop. For å omgå disse begrensningene har ulike metoder blitt utviklet for å lette kvantifiseringen av stomatal blenderåpning i Arabidopsis thaliana, en modellplante som i stor grad brukes til å studere stomatal biologi 1,2,3,4,5,6. For eksempel kan et porometer brukes til å måle transpirasjonshastighet som en metrisk av stomatal konduktans. Denne metoden gir imidlertid ikke direkte informasjon om stomatalnummer og blenderåpning som bestemmer stomatal konduktans. Noen studier har brukt konfokale mikroskopiteknikker som fremhever stomatale porer ved hjelp av en fluorescerende aktinmarkør, et fluorescerende fargestoff eller celleveggautofluorescens 1,2,3,4,5. Selv om disse tilnærmingene letter påvisning av stomata, kan kostnadene ved både drift av et konfokalmikroskopianlegg og utarbeidelse av mikroskopiprøver være et hinder for rutinemessig anvendelse. I et banebrytende arbeid av Sai et al. ble det utviklet en dyp nevral nettverksmodell for automatisk å måle stomatal blenderåpning fra lysfeltmikroskopiske bilder av A. thaliana epidermal peeling6. Likevel fritar denne innovasjonen ikke forskere fra oppgaven med å forberede en epidermal peeling for mikroskopisk observasjon. Nylig ble denne hindringen overvunnet ved å utvikle en bærbar bildebehandlingsenhet som kan observere stomata ved å klemme et blad av A. thaliana, sammen med en dyplæringsbasert bildeanalyserørledning som automatisk måler stomatal blenderåpning fra bladbilder tatt av enheten7.
Stomata bidrar til plantemedfødt immunitet mot bakterielle patogener. Nøkkelen til denne immunresponsen er stomatal lukning som begrenser bakteriell inngang gjennom den mikroskopiske poren inn i bladets indre, hvor bakterielle patogener sprer seg og forårsaker sykdommer8. Stomatal lukning induseres ved anerkjennelse av mikrobeassosierte molekylære mønstre (MAMPs), immunogene molekyler som ofte er felles for en klasse mikrober, av plasmamembranlokaliserte mønstergjenkjenningsreseptorer (PRR)9. En 22 aminosyre epitop av bakteriell flagellin kjent som flg22 er en typisk MAMP som induserer stomatal lukning gjennom anerkjennelse av PRR FLS210. Som et mottiltak, bakterielle patogener som Pseudomonas syringae pv. tomat DC3000 (Pto) og Xanthomonas campestris pv. Vesicatoria har utviklet virulensmekanismer for å gjenåpne stomata 9,11,12. Disse stomatale responsene på bakterielle patogener har blitt konvensjonelt analysert i analyser der enten bladepidermale peelinger, bladskiver eller frittliggende blader flyter på bakteriell suspensjon, og deretter observeres stomata under et mikroskop etterfulgt av manuell måling av stomatal blenderåpning. Imidlertid er disse analysene tungvint og kan ikke gjenspeile stomatale responser på naturlig bakteriell invasjon som oppstår i et blad festet til planten.
Her presenteres en enkel metode for å undersøke stomatal lukking og gjenåpning under Pto-invasjonen under den betingelsen som etterligner den naturlige plante-bakterie-interaksjonen. Denne metoden utnytter den bærbare bildebehandlingsenheten for direkte observasjon av A. thaliana stomata på et blad festet til planten inokulert med Pto, sammen med bildeanalyserørledningen for automatisert måling av stomatal blenderåpning.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Nakarai tesque</td>
			<td>01028-85</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Airbrush kits</td>
			<td>ANEST IWATA</td>
			<td>MX2900</td>
			<td>Accessory kits for SPRINT JET</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotron</td>
			<td>Nippon Medical &#38; Chemical Instruments</td>
			<td>LPH-411S</td>
			<td>Plant Growth Chamber with white fluorescent light</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Wako</td>
			<td>072-00626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Half tray</td>
			<td>Sakata</td>
			<td>72000113</td>
			<td>A set of tray and lid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hyponex</td>
			<td>Hyponex</td>
			<td>No catalogue number available</td>
			<td>Dilute the solution of Hyponex at a ratio of 1:2000 in deionized water for watering plants</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image J</td>
			<td>Natinal Institute of Health</td>
			<td>Download at https://imagej.nih.gov/ij/download.html</td>
			<td>Used for manual measurement of stomatal aperture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2HPO4</td>
			<td>Wako</td>
			<td>164-04295</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Wako</td>
			<td>163-03545</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KOH</td>
			<td>Wako</td>
			<td>168-21815</td>
			<td>For MES-KOH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MES</td>
			<td>Wako</td>
			<td>343-01621</td>
			<td>For MES-KOH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Portable stomatal imaging device</td>
			<td>Phytometrics</td>
			<td>Order at https://www.phytometrics.jp/</td>
			<td>Takagi et al.(2023) doi: 10.1093/pcp/pcad018.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rifampicin</td>
			<td>Wako</td>
			<td>185-01003</td>
			<td>Dissolve in DMSO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silwet-L77</td>
			<td>Bio medical science</td>
			<td>BMS-SL7755</td>
			<td>silicone surfactant used in spray inoculation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPRINT JET</td>
			<td>ANEST IWATA</td>
			<td>IS-800</td>
			<td>Airbrush used for spray inoculation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperMix A</td>
			<td>Sakata seed</td>
			<td>72000083</td>
			<td>Mix with Vermiculite G20 in equal proportions for preparing soil</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone</td>
			<td>Nakarai tesque</td>
			<td>35640-95</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vermiculite G20</td>
			<td>Nittai</td>
			<td>No catalogue number available</td>
			<td>Mix with Super Mix A in equal proportions for preparing soil</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>White fluorescent light</td>
			<td>NEC</td>
			<td>FHF32EX-N-HX-S</td>
			<td>Used for Biotron</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

direct observation and automated measurement of stomatal responses to pseudomonas syringae pv. tomato dc3000 in arabidopsis thaliana

Stomata er mikroskopiske porer som finnes i plantebladepidermis. Regulering av stomatal blenderåpning er avgjørende ikke bare for å balansere karbondioksidopptak for fotosyntese og transpirasjonelt vanntap, men også for å begrense bakteriell invasjon. Mens planter lukker stomata ved anerkjennelse av mikrober, patogene bakterier, som Pseudomonas syringae pv. tomat DC3000 (Pto), åpne den lukkede spalteåpningen igjen for å få tilgang til bladets indre. I konvensjonelle analyser for å vurdere stomatale responser på bakteriell invasjon, blir bladepidermale peelinger, bladskiver eller frittliggende blader flytende på bakteriell suspensjon, og deretter observeres stomata under et mikroskop etterfulgt av manuell måling av stomatal blenderåpning. Imidlertid er disse analysene tungvint og kan ikke gjenspeile stomatale responser på naturlig bakteriell invasjon i et blad festet til planten. Nylig ble det utviklet en bærbar bildebehandlingsenhet som kan observere stomata ved å klemme et blad uten å løsne det fra planten, sammen med en dyplæringsbasert bildeanalyserørledning designet for automatisk å måle stomatal blenderåpning fra bladbilder tatt av enheten. Her, basert på disse tekniske fremskrittene, introduseres en ny metode for å vurdere stomatale responser på bakteriell invasjon i Arabidopsis thaliana. Denne metoden består av tre enkle trinn: sprayinokulering av Pto som etterligner naturlige infeksjonsprosesser, direkte observasjon av stomata på et blad av Pto-inokulert plante ved hjelp av den bærbare bildebehandlingsenheten, og automatisert måling av stomatal blenderåpning av bildeanalyserørledningen. Denne metoden ble vellykket brukt til å demonstrere stomatal nedleggelse og gjenåpning under Pto-invasjonen under forhold som tett etterligner den naturlige plante-bakterie-interaksjonen.

Stomata are microscopic pores surrounded by a pair of guard cells on the surface of leaves and other aerial parts of plants. Under ever-changing environments, regulation of the stomatal aperture is central for plants to control the carbon dioxide uptake required for photosynthesis at the expense of water loss via transpiration. Thus, quantification of the stomatal aperture has been instrumental to understanding plant environmental adaptation. However, quantifying the stomatal aperture is inherently time-consuming and cumbersome as it requires human labor to spot and measure stomatal pores in a leaf image captured by a microscope. To circumvent these limitations, various methods have been developed to facilitate the quantification of stomatal aperture in Arabidopsis thaliana, a model plant extensively used to study stomatal biology1,2,3,4,5,6. For instance, a porometer can be used to measure transpiration rate as a metric of stomatal conductance. However, this method does not provide direct information on the stomatal number and aperture that determine stomatal conductance. Some studies have used confocal microscopy techniques highlighting stomatal pores using a fluorescent actin marker, a fluorescent dye, or cell wall autofluorescence1,2,3,4,5. While these approaches facilitate the detection of stomata, the cost of both operating a confocal microscopy facility and preparing microscopy samples can be an obstacle to routine application. In a ground-breaking work by Sai et al., a deep neural network model was developed to automatically measure stomatal aperture from bright-field microscopic images of A. thaliana epidermal peels6. Yet, this innovation does not exempt researchers from the task of preparing an epidermal peel for microscopic observation. Recently, this obstacle was overcome by developing a portable imaging device that can observe stomata by pinching a leaf of A. thaliana, together with a deep learning-based image analysis pipeline that automatically measures stomatal aperture from leaf images captured by the device7.
Stomata contribute to plant innate immunity against bacterial pathogens. The key to this immune response is stomatal closure that restricts bacterial entry through the microscopic pore into the leaf interior, where bacterial pathogens proliferate and cause diseases8. Stomatal closure is induced upon recognition of microbe-associated molecular patterns (MAMPs), immunogenic molecules that are often common to a class of microbes, by plasma membrane-localized pattern recognition receptors (PRRs)9. A 22 amino acid epitope of bacterial flagellin known as flg22 is a typical MAMP that induces stomatal closure through its recognition by the PRR FLS210. As a countermeasure, bacterial pathogens such as Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 (Pto) and Xanthomonas campestris pv. vesicatoria have evolved virulence mechanisms to reopen stomata9,11,12. These stomatal responses to bacterial pathogens have been conventionally analyzed in assays in which either leaf epidermal peels, leaf discs, or detached leaves are floated on bacterial suspension, and then stomata are observed under a microscope followed by manual measurement of stomatal aperture. However, these assays are cumbersome and may not reflect stomatal responses to natural bacterial invasion that occur in a leaf attached to the plant.
Here, a simple method is presented to investigate stomatal closure and reopening during Pto invasion under the condition that closely mimics the natural plant-bacteria interaction. This method leverages the portable imaging device for direct observation of A. thaliana stomata on a leaf attached to the plant inoculated with Pto, together with the image analysis pipeline for automated measurement of stomatal aperture.

Forfatter i søkelyset: Fremme stomatal forskning med automatisert blenderåpningsmåling

Direkte observasjon og automatisert måling av stomatal respons på Pseudomonas syringae pv. tomat DC3000 i Arabidopsis thaliana

Plantal stomata play central roles in adaptation to stress conditions, so we need to measure stomata aperture to understand how plants respond to biotic and abiotic stresses. However, stomata aperture measurement is time-consuming and cumbersome. To measure stomata aperture, we peel the epidermis and observe stomata under a microscope.Then we manually measure stomata aperture, which takes a long time even for very experienced researchers. We challenged these barriers and developed a tool and a technique that can automatically measure stomata aperture in intact Arabidopsis leaves. So we strongly believe that stomata measuring device and deep-learning algorithm that we developed will facilitate functional analysis of stomata responses to various biotic and abiotic stresses because these technical advances significantly reduce time and human labor required for stomata aperture measurement.

Etter sprayinokulering av Pto ble stomata på blader festet til de inokulerte plantene direkte observert av den bærbare stomatale bildebehandlingsenheten. Ved hjelp av manuelle og automatiserte målinger ble de samme bladbildene brukt til å beregne stomatal blenderåpning ved å ta forhold mellom bredde og lengde på ca. 60 stomata. Manuelle og automatiserte målinger indikerte konsekvent en reduksjon i stomatal blenderåpning i Pto-inokulerte planter sammenlignet med mock-inokulerte planter ved 1 tim...

Watch this Scientific Journal Video about Author Spotlight: Advancing Stomatal Research with Automated Aperture Measurement at JoVE.com

Her presenterer vi en enkel metode for direkte observasjon og automatisert måling av stomatale responser på bakteriell invasjon i Arabidopsis thaliana. Denne metoden utnytter en bærbar stomatal imaging enhet, sammen med en bildeanalyse rørledning designet for bladbilder tatt av enheten.

Stomata are microscopic pores found in the plant leaf epidermis. Regulation of stomatal aperture is pivotal not only for balancing carbon dioxide uptake ...

Plantal stomata spiller sentrale roller i tilpasning til stressforhold, så vi må måle stomata aperture for å forstå hvordan planter reagerer på biotiske og abiotiske påkjenninger. Måling av stomataåpning er imidlertid tidkrevende og tungvint. For å måle stomata blenderåpning, skreller vi epidermis og observerer stomata under et mikroskop.Deretter måler vi stomata blenderåpning manuelt, noe som tar lang tid selv for svært erfarne forskere. Vi utfordret disse barrierene og utviklet et verktøy og en teknikk som automatisk kan måle stomataåpning i intakte Arabidopsis-blader. Så vi har stor tro på at stomata måleenhet og dyp-læring algoritme som vi utviklet vil lette funksjonell analyse av stomata responser på ulike biotiske og abiotiske påkjenninger fordi disse tekniske fremskritt betydelig redusere tid og menneskelig arbeidskraft som kreves for stomata blenderåpning måling.

direct-observation-automated-measurement-stomatal-responses-to

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Direct Observation and Automated Measurement of Stomatal Responses to Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 in Arabidopsis thaliana

Stomata are microscopic pores found in the plant leaf epidermis. Regulation of stomatal aperture is pivotal not only for balancing carbon dioxide uptake for photosynthesis and transpirational water loss but also for restricting bacterial invasion. While plants close stomata upon recognition of microbes, pathogenic bacteria, such as Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 (Pto), reopen the closed stomata to gain access into the leaf interior. In conventional assays for assessing stomatal responses to bacterial invasion, leaf epidermal peels, leaf discs, or detached leaves are floated on bacterial suspension, and then stomata are observed under a microscope followed by manual measurement of stomatal aperture. However, these assays are cumbersome and may not reflect stomatal responses to natural bacterial invasion in a leaf attached to the plant. Recently, a portable imaging device was developed that can observe stomata by pinching a leaf without detaching it from the plant, together with a deep learning-based image analysis pipeline designed to automatically measure stomatal aperture from leaf images captured by the device. Here, building on these technical advances, a new method to assess stomatal responses to bacterial invasion in Arabidopsis thaliana is introduced. This method consists of three simple steps: spray inoculation of Pto mimicking natural infection processes, direct observation of stomata on a leaf of the Pto-inoculated plant using the portable imaging device, and automated measurement of stomatal aperture by the image analysis pipeline. This method was successfully used to demonstrate stomatal closure and reopening during Pto invasion under conditions that closely mimic the natural plant-bacteria interaction.

Here, we present a simple method for direct observation and automated measurement of stomatal responses to bacterial invasion in Arabidopsis thaliana. This method leverages a portable stomatal imaging device, together with an image analysis pipeline designed for leaf images captured by the device.

Induction of Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 Infection in Arabidopsis thaliana for Automated Stomatal Response Measurement

Induksjon av Pseudomonas syringae pv. tomat DC3000-infeksjon i Arabidopsis thaliana for automatisert stomatal responsmåling

Automated Measurement of Stomatal Response in Arabidopsis thaliana in Response to Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 Infection