Name: Författare i fokus: Främja forskning om klyvöppningar med automatiserad bländarmätning
Uploaded: 2024-02-09T13:55:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Author Spotlight: Advancing Stomatal Research with Automated Aperture Measurement at JoVE.com

Vi tackar alla medlemmar i forskningsprojektet "Co-creation of plant adaptive traits via assembly of plant-microbe holobiont" för givande diskussioner. Detta arbete stöddes av Grant-in-Aid for Transformative Research Areas (21H05151 och 21H05149 till A.M. och 21H05152 till Y.T.) och Grant-in-Aid for Challenging Exploratory Research (22K19178 till A.M.).

1. Odla växter
<ol><li>För att bryta vilan, återsuspendera A. thaliana (Col-0) frön i avjoniserat vatten och inkubera dem vid 4 °C i 4 dagar i mörker.</li>
	<li>Så fröna på jorden och odla i en kammare utrustad med vitt fluorescerande ljus. Bibehåll följande tillväxtförhållanden: temperatur på 22 °C, ljusintensitet på 6 000 lux (ca 100 μmol/m2/s) i 10 timmar och relativ luftfuktighet på 60 %.</li>
	<li>Vid behov, vattna växterna med ett flytande gödningsmedel. A...

Automatiserad mätning av klyvöppningar vid bakterieinvasion i Arabidopsis

<ol>
	<li>Shimono, M., Higaki, T., Kaku, H., Shibuya, N., Hasezawa, S., Day, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+evaluation+of+stomatal+cytoskeletal+patterns+during+the+activation+of+immune+signaling+in+Arabidopsis+thaliana.">Quantitative evaluation of stomatal cytoskeletal patterns during the activation of immune signaling in Arabidopsis thaliana.</a> PLoS One. 11, e0159291 (2016).</li><li>Bourdais, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+quantitative+imaging+to+investigate+regulators+of+membrane+trafficking+in+Arabidopsis+stomatal+closure.">The use of quantitative imaging to investigate regulators of membrane trafficking in Arabidopsis stomatal closure.</a> Traffic. 20 (2), 168-180 (2019).</li><li>Higaki, T., Kutsuna, N., Hasezawa, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CARTA-based+semi-automatic+detection+of+stomatal+regions+on+an+Arabidopsis+cotyledon+surface.">CARTA-based semi-automatic detection of stomatal regions on an Arabidopsis cotyledon surface.</a> Plant Morphology. 26 (1), 9-12 (2014).</li><li>Eisele, J. F., F&#228;&#223;ler, F., B&#252;rgel, F., Chaban, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+and+simple+method+for+microscopy-based+stomata+analyses.">A rapid and simple method for microscopy-based stomata analyses.</a> PLoS One. 11, e0164576 (2016).</li><li>Chitraker, R., Melotto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+stomatal+response+to+live+bacterial+cells+using+whole+leaf+imaging.">Assessing stomatal response to live bacterial cells using whole leaf imaging.</a> Journal of Visualized Experiments. 44, 2185 (2010).</li><li>Sai, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=StomaAI:+an+efficient+and+user-friendly+tool+for+measurement+of+stomatal+pores+and+density+using+deep+computer+vision.">StomaAI: an efficient and user-friendly tool for measurement of stomatal pores and density using deep computer vision.</a> New Phytologist. 238 (2), 904-915 (2023).</li><li>Takagi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Image-based+quantification+of+Arabidopsis+thaliana+stomatal+aperture+from+leaf+images.">Image-based quantification of Arabidopsis thaliana stomatal aperture from leaf images.</a> Plant and Cell Physiology. pcad018, (2023).</li><li>Melotto, M., Zhang, L., Oblessuc, P. R., He, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stomatal+defense+a+decade+later.">Stomatal defense a decade later.</a> Plant Physiology. 174 (2), 561-571 (2017).</li><li>Melotto, M., Underwood, W., Koczan, J., Nomura, K., He, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant+stomata+function+in+innate+immunity+against+bacterial+invasion.">Plant stomata function in innate immunity against bacterial invasion.</a> Cell. 126 (5), 969-980 (2006).</li><li>Zeng, W., He, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+prominent+role+of+the+flagellin+receptor+FLAGELLIN-SENSING2+in+mediating+stomatal+response+to+Pseudomonas+syringae+pv+tomato+DC3000+in+Arabidopsis.">A prominent role of the flagellin receptor FLAGELLIN-SENSING2 in mediating stomatal response to Pseudomonas syringae pv tomato DC3000 in Arabidopsis.</a> Plant Physiology. 153 (3), 1188-1198 (2010).</li><li>Zheng, X. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coronatine+promotes+Pseudomonas+syringae+virulence+in+plants+by+activating+a+signaling+cascade+that+inhibits+salicylic+acid+accumulation.">Coronatine promotes Pseudomonas syringae virulence in plants by activating a signaling cascade that inhibits salicylic acid accumulation.</a> Cell Host and Microbe. 11 (6), 587-596 (2012).</li><li>Raffeiner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Xanthomonas+type-III+effector+XopS+stabilizes+CaWRKY40a+to+regulate+defense+responses+and+stomatal+immunity+in+pepper+(Capsicum+annuum).">The Xanthomonas type-III effector XopS stabilizes CaWRKY40a to regulate defense responses and stomatal immunity in pepper (Capsicum annuum).</a> The Plant Cell. 34 (5), 1684-1708 (2022).</li><li>Munemasa, S., Hauser, F., Park, J., Waadt, R., Brandt, B., Schroeder, J. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+abscisic+acid-mediated+control+of+stomatal+aperture.">Mechanisms of abscisic acid-mediated control of stomatal aperture.</a> Current Opinion in Plant Biology. 28, 154-162 (2015).</li><li>F&#246;rster, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wounding-induced+stomatal+closure+requires+jasmonate-mediated+activation+of+GORK+K++channels+by+a+Ca2++sensor-kinase+CBL1-CIPK5+complex.">Wounding-induced stomatal closure requires jasmonate-mediated activation of GORK K+ channels by a Ca2+ sensor-kinase CBL1-CIPK5 complex.</a> Developmental Cell. 48 (1), 87-99 (2018).</li><li>Cheng, Y. T., Zhang, L., He, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant-microbe+interactions+facing+environmental+challenge.">Plant-microbe interactions facing environmental challenge.</a> Cell Host and Microbe. 26 (2), 183-192 (2019).</li></ol>

Tidigare studier använde epidermal peeling, bladskivor eller lossnade blad för att undersöka klyvöppningarnas svar på bakterieinvasioner 9,11,12. Däremot utnyttjar den metod som föreslås i denna studie den bärbara klyvöppningen för att direkt observera klyvöppningar på ett blad som är fäst vid växten efter sprayinokulering av PTO, vilket efterliknar naturliga förhållanden för bakterieinvasion. Dessuto...

Klyvöppningar är mikroskopiska porer omgivna av ett par skyddsceller på ytan av blad och andra luftiga delar av växter. I ständigt föränderliga miljöer är reglering av klyvöppningarna central för att växter ska kunna kontrollera det koldioxidupptag som krävs för fotosyntesen på bekostnad av vattenförlust via transpiration. Kvantifiering av klyvöppningen har därför varit avgörande för att förstå växternas miljöanpassning. Att kvantifiera klyvöppningen är dock i sig tidskrävande och besvärligt eftersom det kräver mänskligt arbete för att upptäcka och mäta klyvöppningarnas porer i en bladbild som fångats av ett mikroskop. För att kringgå dessa begränsningar har olika metoder utvecklats för att underlätta kvantifieringen av klyvöppningar i Arabidopsis thaliana, en modellväxt som i stor utsträckning används för att studera klyvöppningarnas biologi 1,2,3,4,5,6. Till exempel kan en porometer användas för att mäta transpirationshastigheten som ett mått på klyvöppningarnas konduktans. Denna metod ger dock ingen direkt information om klyvöppningarnas antal och bländare som bestämmer klyvöppningarnas konduktans. Vissa studier har använt konfokalmikroskopitekniker som belyser klyvöppningar med hjälp av en fluorescerande aktinmarkör, ett fluorescerande färgämne eller cellväggsautofluorescens 1,2,3,4,5. Även om dessa metoder underlättar detektion av klyvöppningar, kan kostnaden för att både driva en konfokalmikroskopianläggning och förbereda mikroskopiprover vara ett hinder för rutinmässig tillämpning. I ett banbrytande arbete av Sai et al. utvecklades en modell för djupa neurala nätverk för att automatiskt mäta klyvöppningar från ljusfältsmikroskopiska bilder av A. thaliana epidermal peeling6. Ändå befriar denna innovation inte forskare från uppgiften att förbereda en epidermal peeling för mikroskopisk observation. Nyligen övervanns detta hinder genom att utveckla en bärbar bildenhet som kan observera klyvöppningar genom att nypa ett blad av A. thaliana, tillsammans med en djupinlärningsbaserad bildanalyspipeline som automatiskt mäter klyvöppningar från bladbilder som tagits av enheten7.
Klyvöppningar bidrar till växtens medfödda immunitet mot bakteriella patogener. Nyckeln till detta immunsvar är klyvöppningar som begränsar bakteriens inträde genom den mikroskopiska poren in i bladets inre, där bakteriella patogener förökar sig och orsakar sjukdomar8. Klyvöppningar induceras vid igenkänning av mikrobassocierade molekylära mönster (MAMP), immunogena molekyler som ofta är gemensamma för en klass av mikrober, av plasmamembranlokaliserade mönsterigenkänningsreceptorer (PRR)9. En epitop med 22 aminosyror av bakterieflagellin som kallas flg22 är en typisk MAMP som inducerar klyvöppningar genom att den känns igen av PRR FLS210. Som en motåtgärd, bakteriella patogener som Pseudomonas syringae pv. tomat DC3000 (PTO) och Xanthomonas campestris pv. Vesitoria har utvecklat virulensmekanismer för att öppna klyvöppningar 9,11,12. Dessa klyvöppningar mot bakteriella patogener har konventionellt analyserats i analyser där antingen bladepidermal peeling, bladskivor eller lossnade blad flyter på bakteriell suspension, och sedan observeras klyvöppningar under ett mikroskop följt av manuell mätning av klyvöppningen. Dessa analyser är dock besvärliga och kanske inte återspeglar klyvöppningar på naturlig bakterieinvasion som uppstår i ett blad som är fäst vid växten.
Här presenteras en enkel metod för att undersöka klyvöppningar och återöppningar under PTO-invasion under förhållanden som nära efterliknar den naturliga interaktionen mellan växter och bakterier. Denna metod utnyttjar den bärbara avbildningsenheten för direkt observation av A. thaliana klyvöppningar på ett blad som är fäst vid växten inokulerad med PTO, tillsammans med bildanalyspipelinen för automatiserad mätning av klyvöppningar.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Nakarai tesque</td>
			<td>01028-85</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Airbrush kits</td>
			<td>ANEST IWATA</td>
			<td>MX2900</td>
			<td>Accessory kits for SPRINT JET</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotron</td>
			<td>Nippon Medical &#38; Chemical Instruments</td>
			<td>LPH-411S</td>
			<td>Plant Growth Chamber with white fluorescent light</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Wako</td>
			<td>072-00626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Half tray</td>
			<td>Sakata</td>
			<td>72000113</td>
			<td>A set of tray and lid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hyponex</td>
			<td>Hyponex</td>
			<td>No catalogue number available</td>
			<td>Dilute the solution of Hyponex at a ratio of 1:2000 in deionized water for watering plants</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image J</td>
			<td>Natinal Institute of Health</td>
			<td>Download at https://imagej.nih.gov/ij/download.html</td>
			<td>Used for manual measurement of stomatal aperture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2HPO4</td>
			<td>Wako</td>
			<td>164-04295</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Wako</td>
			<td>163-03545</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KOH</td>
			<td>Wako</td>
			<td>168-21815</td>
			<td>For MES-KOH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MES</td>
			<td>Wako</td>
			<td>343-01621</td>
			<td>For MES-KOH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Portable stomatal imaging device</td>
			<td>Phytometrics</td>
			<td>Order at https://www.phytometrics.jp/</td>
			<td>Takagi et al.(2023) doi: 10.1093/pcp/pcad018.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rifampicin</td>
			<td>Wako</td>
			<td>185-01003</td>
			<td>Dissolve in DMSO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silwet-L77</td>
			<td>Bio medical science</td>
			<td>BMS-SL7755</td>
			<td>silicone surfactant used in spray inoculation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPRINT JET</td>
			<td>ANEST IWATA</td>
			<td>IS-800</td>
			<td>Airbrush used for spray inoculation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperMix A</td>
			<td>Sakata seed</td>
			<td>72000083</td>
			<td>Mix with Vermiculite G20 in equal proportions for preparing soil</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone</td>
			<td>Nakarai tesque</td>
			<td>35640-95</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vermiculite G20</td>
			<td>Nittai</td>
			<td>No catalogue number available</td>
			<td>Mix with Super Mix A in equal proportions for preparing soil</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>White fluorescent light</td>
			<td>NEC</td>
			<td>FHF32EX-N-HX-S</td>
			<td>Used for Biotron</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

direct observation and automated measurement of stomatal responses to pseudomonas syringae pv. tomato dc3000 in arabidopsis thaliana

Klyvöppningar är mikroskopiska porer som finns i växtens bladepidermis. Reglering av klyvöppningar är avgörande inte bara för att balansera koldioxidupptaget för fotosyntes och transpirrationell vattenförlust utan också för att begränsa bakterieinvasionen. Medan växter stänger klyvöppningar vid igenkänning av mikrober, patogena bakterier, såsom Pseudomonas syringae pv. tomat DC3000 (PTO), öppna de stängda klyvöppningarna igen för att komma åt bladets inre. I konventionella analyser för att bedöma klyvöppningarnas svar på bakterieinvasion flyter bladepidermal peeling, bladskivor eller lossnade blad på bakteriell suspension, och sedan observeras klyvöppningar under ett mikroskop följt av manuell mätning av klyvöppningen. Dessa analyser är dock besvärliga och kanske inte återspeglar klyvöppningarnas reaktioner på naturlig bakterieinvasion i ett blad som är fäst vid växten. Nyligen utvecklades en bärbar bildenhet som kan observera klyvöppningar genom att nypa ett blad utan att lossa det från växten, tillsammans med en djupinlärningsbaserad bildanalyspipeline som är utformad för att automatiskt mäta klyvöppningar från bladbilder som fångats av enheten. Här, med utgångspunkt i dessa tekniska framsteg, introduceras en ny metod för att bedöma klyvöppningarnas svar på bakterieinvasion i Arabidopsis thaliana . Denna metod består av tre enkla steg: sprayinokulering av Pto som efterliknar naturliga infektionsprocesser, direkt observation av klyvöppningar på ett blad av den PTO-inokulerade växten med hjälp av den bärbara avbildningsenheten och automatiserad mätning av klyvöppningar med hjälp av bildanalyspipelinen. Denna metod användes framgångsrikt för att demonstrera klyvöppningar och återöppning under PTO-invasion under förhållanden som nära efterliknar den naturliga interaktionen mellan växter och bakterier.

Stomata are microscopic pores surrounded by a pair of guard cells on the surface of leaves and other aerial parts of plants. Under ever-changing environments, regulation of the stomatal aperture is central for plants to control the carbon dioxide uptake required for photosynthesis at the expense of water loss via transpiration. Thus, quantification of the stomatal aperture has been instrumental to understanding plant environmental adaptation. However, quantifying the stomatal aperture is inherently time-consuming and cumbersome as it requires human labor to spot and measure stomatal pores in a leaf image captured by a microscope. To circumvent these limitations, various methods have been developed to facilitate the quantification of stomatal aperture in Arabidopsis thaliana, a model plant extensively used to study stomatal biology1,2,3,4,5,6. For instance, a porometer can be used to measure transpiration rate as a metric of stomatal conductance. However, this method does not provide direct information on the stomatal number and aperture that determine stomatal conductance. Some studies have used confocal microscopy techniques highlighting stomatal pores using a fluorescent actin marker, a fluorescent dye, or cell wall autofluorescence1,2,3,4,5. While these approaches facilitate the detection of stomata, the cost of both operating a confocal microscopy facility and preparing microscopy samples can be an obstacle to routine application. In a ground-breaking work by Sai et al., a deep neural network model was developed to automatically measure stomatal aperture from bright-field microscopic images of A. thaliana epidermal peels6. Yet, this innovation does not exempt researchers from the task of preparing an epidermal peel for microscopic observation. Recently, this obstacle was overcome by developing a portable imaging device that can observe stomata by pinching a leaf of A. thaliana, together with a deep learning-based image analysis pipeline that automatically measures stomatal aperture from leaf images captured by the device7.
Stomata contribute to plant innate immunity against bacterial pathogens. The key to this immune response is stomatal closure that restricts bacterial entry through the microscopic pore into the leaf interior, where bacterial pathogens proliferate and cause diseases8. Stomatal closure is induced upon recognition of microbe-associated molecular patterns (MAMPs), immunogenic molecules that are often common to a class of microbes, by plasma membrane-localized pattern recognition receptors (PRRs)9. A 22 amino acid epitope of bacterial flagellin known as flg22 is a typical MAMP that induces stomatal closure through its recognition by the PRR FLS210. As a countermeasure, bacterial pathogens such as Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 (Pto) and Xanthomonas campestris pv. vesicatoria have evolved virulence mechanisms to reopen stomata9,11,12. These stomatal responses to bacterial pathogens have been conventionally analyzed in assays in which either leaf epidermal peels, leaf discs, or detached leaves are floated on bacterial suspension, and then stomata are observed under a microscope followed by manual measurement of stomatal aperture. However, these assays are cumbersome and may not reflect stomatal responses to natural bacterial invasion that occur in a leaf attached to the plant.
Here, a simple method is presented to investigate stomatal closure and reopening during Pto invasion under the condition that closely mimics the natural plant-bacteria interaction. This method leverages the portable imaging device for direct observation of A. thaliana stomata on a leaf attached to the plant inoculated with Pto, together with the image analysis pipeline for automated measurement of stomatal aperture.

Författare i fokus: Främja forskning om klyvöppningar med automatiserad bländarmätning

Direkt observation och automatiserad mätning av klyvöppningar på Pseudomonas syringae pv. tomat DC3000 i Arabidopsis thaliana

Plantal stomata play central roles in adaptation to stress conditions, so we need to measure stomata aperture to understand how plants respond to biotic and abiotic stresses. However, stomata aperture measurement is time-consuming and cumbersome. To measure stomata aperture, we peel the epidermis and observe stomata under a microscope.Then we manually measure stomata aperture, which takes a long time even for very experienced researchers. We challenged these barriers and developed a tool and a technique that can automatically measure stomata aperture in intact Arabidopsis leaves. So we strongly believe that stomata measuring device and deep-learning algorithm that we developed will facilitate functional analysis of stomata responses to various biotic and abiotic stresses because these technical advances significantly reduce time and human labor required for stomata aperture measurement.

Efter sprayinokulering av PTO:t observerades klyvöppningar på blad som satt fast på de inokulerade plantorna direkt av den bärbara klyvöppningen. Med hjälp av manuella och automatiserade mätningar användes samma bladbilder för att beräkna klyvöppningarnas öppning genom att ta förhållandet mellan bredd och längd på cirka 60 klyvöppningar. Manuella och automatiserade mätningar indikerade konsekvent en minskning av klyvöppningen hos Pto-inokulerade plantor jämfört med mockinokulerade p...

Watch this Scientific Journal Video about Author Spotlight: Advancing Stomatal Research with Automated Aperture Measurement at JoVE.com

Här presenterar vi en enkel metod för direkt observation och automatiserad mätning av klyvöppningarnas svar på bakterieinvasion i Arabidopsis thaliana. Denna metod utnyttjar en bärbar klyvöppning tillsammans med en bildanalyspipeline som är utformad för bladbilder som tas av enheten.

Stomata are microscopic pores found in the plant leaf epidermis. Regulation of stomatal aperture is pivotal not only for balancing carbon dioxide uptake ...

Plantala klyvöppningar spelar en central roll i anpassningen till stressförhållanden, så vi måste mäta klyvöppningen för att förstå hur växter reagerar på biotisk och abiotisk stress. Mätning av öppningar på klyvöppningar är dock tidskrävande och besvärligt. För att mäta klyvöppningen skalar vi epidermis och observerar klyvöppningar under ett mikroskop.Sedan mäter vi klyvöppningen manuellt, vilket tar lång tid även för mycket erfarna forskare. Vi utmanade dessa barriärer och utvecklade ett verktyg och en teknik som automatiskt kan mäta klyvöppningar i intakta Arabidopsis-blad. Så vi är övertygade om att klyvöppningar och djupinlärningsalgoritm som vi utvecklat kommer att underlätta funktionell analys av klyvöppningarnas svar på olika biotiska och abiotiska påfrestningar eftersom dessa tekniska framsteg avsevärt minskar den tid och det mänskliga arbete som krävs för mätning av klyvöppningar.

direct-observation-automated-measurement-stomatal-responses-to

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Direct Observation and Automated Measurement of Stomatal Responses to Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 in Arabidopsis thaliana

Stomata are microscopic pores found in the plant leaf epidermis. Regulation of stomatal aperture is pivotal not only for balancing carbon dioxide uptake for photosynthesis and transpirational water loss but also for restricting bacterial invasion. While plants close stomata upon recognition of microbes, pathogenic bacteria, such as Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 (Pto), reopen the closed stomata to gain access into the leaf interior. In conventional assays for assessing stomatal responses to bacterial invasion, leaf epidermal peels, leaf discs, or detached leaves are floated on bacterial suspension, and then stomata are observed under a microscope followed by manual measurement of stomatal aperture. However, these assays are cumbersome and may not reflect stomatal responses to natural bacterial invasion in a leaf attached to the plant. Recently, a portable imaging device was developed that can observe stomata by pinching a leaf without detaching it from the plant, together with a deep learning-based image analysis pipeline designed to automatically measure stomatal aperture from leaf images captured by the device. Here, building on these technical advances, a new method to assess stomatal responses to bacterial invasion in Arabidopsis thaliana is introduced. This method consists of three simple steps: spray inoculation of Pto mimicking natural infection processes, direct observation of stomata on a leaf of the Pto-inoculated plant using the portable imaging device, and automated measurement of stomatal aperture by the image analysis pipeline. This method was successfully used to demonstrate stomatal closure and reopening during Pto invasion under conditions that closely mimic the natural plant-bacteria interaction.

Here, we present a simple method for direct observation and automated measurement of stomatal responses to bacterial invasion in Arabidopsis thaliana. This method leverages a portable stomatal imaging device, together with an image analysis pipeline designed for leaf images captured by the device.

Induction of Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 Infection in Arabidopsis thaliana for Automated Stomatal Response Measurement

Induktion av Pseudomonas syringae pv. tomat DC3000-infektion i Arabidopsis thaliana för automatiserad mätning av klyvöppningar

Automated Measurement of Stomatal Response in Arabidopsis thaliana in Response to Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 Infection