Name: تسليط الضوء على المؤلف: الشبكات العصبية المعيارية لتحليل وظائف الدماغ
Uploaded: 2024-06-07T13:10:00
Duration: 1 min 12 s
Description: Neuronal cultures have been a reference experimental model for several decades. However, 3D cell arrangement, spatial constraints on neurite outgrowth, ...

يقر M.G. بالدعم المالي من برنامج إطار عمل H2020 التابع للاتحاد الأوروبي من خلال مجلس الابتكار الأوروبي (مشروع IN-FET ، GA n. 862882 ، مشروع Arbor-IO ، FLAG-ERA ومشروع الدماغ البشري ، ID 650003) ومن SISSA (منطقة علم الأعصاب). تعترف G.N. بالدعم المالي من وزارة الجامعات والبحوث الإيطالية (MUR) من خلال منحة Dipartimenti di Eccellenza 2018-2022 (مجال الرياضيات). نشكر M. Gigante و B. Pastore و M. Grandolfo على مساعدتهم في الطباعة ثلاثية الأبعاد 3D ، وزراعة الخلايا ، والتصوير الحي ، وكذلك Drs. P. Massobrio و P. Heppenstall و L. Ballerini و Di Clemente و HC Schultheiss على المناقشات. لم يكن للممولين أي دور في تصميم الدراسة أو جمع البيانات وتحليلها أو قرار النشر أو إعداد المخطوطة.

تطبيقات الطباعة 3D لأجهزة زراعة الخلايا العصبية على نطاق صغير

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

على الرغم من كونه عمره عقودا ، إلا أن تطبيق تقنية 2PP في قولبة النسخ المتماثلة القائمة على PDMS على نطاق ميكرومتر هو تطور حديث43,44. وفي هذا السياق، تناقش أدناه سلسلة من النقاط لمساعدة المستخدمين على استنساخ هذا العمل بفعالية.
لتصميم نموذج 3D ، تأكد من أن النموذج لا يحتوي على ثقوب أو تقاطعات ذاتية. قم بامتياز تنسيق الملف الثنائي عند الحفظ بتنسيق STL ، لحجم ملفه الأصغر من ترميز ASCII. هذا مفيد بشكل خاص للتصميمات ذات الأشكال الهندسية المعقدة وللكائنات ذات العرض المليلتر. استخدام ملفات STL الثنائية يعني أيضا انخفاض تحميل وحدة المعالجة المركزية، في وقت لاحق في عملية إعداد الجزء الميكانيكي ليتم طباعتها 3D. يتم تمثيل الأبعاد المادية للميزات داخل ملف STL في وحدات بلا أبعاد. أثناء المعالجة اللاحقة لملف STL ، يتم تفسير الوحدات على أنها ميكرومتر. لذلك ، يوصى باعتماد وحدة الاهتمام مقدما ، أي ميكرومتر ، عند إعداد الملف. يتم تحديد دقة النموذج المطبوع من خلال عدد الأسطح التي تقترب من المثلثات الفسيفسائية. بالنسبة لعدد غير كاف من الأسطح ، ستظهر خشونة سطح غير مرغوب فيها. ومع ذلك ، فإن استهداف الدقة العالية بشكل مفرط من قبل عدد كبير جدا من الأسطح يأتي على حساب تحميل حسابي مرتفع ، مما يتسبب في بطء معالجة الملفات.
للطباعة ثلاثية الأبعاد ، أثناء الطباعة ، يتم تشكيل الكائن المادي ثلاثي الأبعاد باستخدام مسح galvo السريع في المستوى x-y وحركة بيزو في الاتجاه z. هذا يركز شعاع ليزر الفيمتو ثانية داخل أي فوكسل 3D معين. ومع ذلك ، عندما تكون هياكل الطباعة أكبر من نطاقات التغطية المكانية ل galvo و piezo ، يجب تقسيم الكائن برمجيا إلى كتل. في حين أن هذا مطلب للأجزاء المطبوعة بحجم المليمتر ، فإن التقاطعات بين الكتل مرتبطة بخطوط خياطة (غير كاملة). يعد التحسين الدقيق لعدد الكتل ووضع خطوط الخياطة في اتجاهات x و y و z أمرا بالغ الأهمية لتجنب تعطيل الميزات الهندسية الحرجة للكائن النهائي بخطوط خياطة. قد تتشكل الفقاعات في واجهة الطباعة لأسباب مختلفة (على سبيل المثال ، شوائب الركائز المقاومة للضوء وعدم التجانس) ، وتؤثر سلبا على جودة وسلامة الهيكل المطبوع. علاوة على ذلك ، يمكن أن تؤدي طاقة الليزر العالية إلى زيادة حدوثها. سيؤدي تقليل طاقة الليزر ، عند أدنى طبقة من الجزء المطبوع ، إلى تقليل فرص تكوين الفقاعة. كبديل لطباعة الجزء بأكمله كهيكل صلب ، يمكن النظر في طريقة الصدفة والسقالة. يتضمن طباعة السطح الخارجي للجزء (الغلاف) فقط بالإضافة إلى عناصر المنشور الثلاثي بداخله. يتم فصل هذه العناصر بواسطة طبقات أفقية (سقالة) ، تحمل الراتنج غير المبلمر في جيوب صغيرة. تعمل هذه الطريقة على تقصير وقت الطباعة بشكل كبير ، وهو مناسب بشكل خاص للهياكل بحجم المليمتر. ومع ذلك ، نظرا لبقاء راتنج غير مبلمر ، فإن التعرض للأشعة فوق البنفسجية بعد الطباعة أمر ضروري لضمان الاستقرار الميكانيكي الكامل ، على الرغم من أنه يجب تنفيذ هذه الخطوة برفق لتجنب أي تشوه في الجزء المطبوع. يعتمد وقت ما بعد المعالجة على الراتنج المختار وسمك الجزء وطاقة الأشعة فوق البنفسجية40. للحصول على أفضل النتائج ، يوصى بإجراء تجربة أولية لتقدير الوقت اللازم للمعالجة الكاملة العمق ، باستخدام قطرة من مقاومة الضوء وتقييم قطعها المقطعي ، بعد التعرض للأشعة فوق البنفسجية. تتراوح فترة المعالجة المعتادة بين 5 إلى 20 دقيقة.
بالنسبة لقولبة النسخ المتماثلة PDMS ، قد يكون التصنيع النظيف لجهاز PDMS بميزات مقياس ميكرومتر ، مع عدم وجود مرافق غرفة نظيفة ، أمرا صعبا: يمكن أن تتواجد الجسيمات الدقيقة المحمولة بالهواء على السطح شديد الالتصاق لنظام PDMS وتعيق الختم بين الجهاز والركيزة ، أو تسد قسم القنوات الدقيقة الفردية. إن تنفيذ خطوات البروتوكول تحت غطاء التدفق الصفحي وحماية سطح PDMS باستمرار باستخدام الأيزوبروبانول يقلل بشكل كبير من مخاطر التلوث. تؤثر درجة حرارة المعالجة ومدتها بشكل مباشر على الربط المتقاطع PDMS والخصائص الفيزيائية الناتجة. على وجه الخصوص ، يعد التصاق PDMS المعالج عاملا حاسما. من ناحية ، يلزم وجود ختم محكم بين جهاز PDMS ، والسطح المستخدم لزراعة الخلايا العصبية (على سبيل المثال ، غطاء زجاجي أو MEA) ، لتقييد مرور الخلايا العصبية بشكل فعال. من ناحية أخرى ، يجب أن يتم توصيل جهاز PDMS بالسطح بشكل عكسي ، بحيث لا تتلف الطبقة العازلة الحساسة MEAs بعد إزالة الجهاز. بينما يحدث انكماش PDMS أثناء المعالجة ويمكن تصحيحه عن طريق إعادة قياس القالب مقدما ، بالنسبة لدرجات الحرارة وفترات المعالجة المشار إليها هنا ، سيكون الانكماش أقل من 2٪ 42 ولن يؤثر بشكل كبير على أجهزة PDMS أحادية الطبقة. بشكل عام ، اتبع بدقة قيم درجة حرارة المعالجة ومدتها الموصى بها ، للحصول على أفضل النتائج.
نظرة عامة على مزايا وقيود الطريقة تم اقتراح تقنية تعتمد على الكتابة بالليزر المباشر 2 فوتون للتصنيع السريع للأجهزة البوليمرية الصغيرة الحجم للدراسة التجريبية للشبكات العصبية المعيارية. على عكس الطباعة الحجرية الضوئية اللينة ، لا يتطلب النهج المقترح مستوى عال من الخبرة الفنية ، بشرط أن يكون إعداد الطباعة الوظيفية 2PP 3D متاحا وعمليا. ومن اللافت للنظر أن هذه الطريقة تمكن من الانتقال من نموذج 3D المصمم من قبل CAD إلى جهاز PDMS وظيفي في غضون يوم واحد ، وبالتالي توفير مسار مباشر وفعال من المفهوم إلى الإدراك الملموس. على وجه التحديد ، فإن اختيار وضع الطباعة بالصدفة والسقالة يقلل بشكل كبير من الوقت اللازم لإنشاء القالب ، حيث تتم طباعة جزء صغير فقط من حجمه. تضمن المعالجة اللاحقة بالأشعة فوق البنفسجية للمكون المطبوع استقراره الميكانيكي ومتانته ، كما تم التحقق منه هنا على مدار 50 دورة صب باستخدام PDMS.
بالمقارنة مع الطرق التقليدية ، تتميز الطباعة 2PP 3D بميزة واضحة ، والتي تكون أكثر وضوحا عندما يتعلق الأمر بتصنيع القوالب ذات نسبة العرض إلى الارتفاع الكبيرة ، ومتطلبات الدقة الصعبة ، والهندسة ثلاثية الأبعاد المعقدة. إن إنتاج القوالب الرئيسية باستخدام الطباعة الحجرية القياسية للأشعة فوق البنفسجية مقيد بسمك مقاوم يبلغ حوالي 200 ميكرومتر. مطلوب تسلسلات معقدة من دورات الطلاء المغزلي والتعرض35 ، أو LIGA المكلفة (الطباعة الحجرية ، والطلاء الكهربائي ، والقولبة) ، أو عمليات النقش الأيوني التفاعلي العميق (DRIE)36 لتحقيق نسب ارتفاع وعرض إلى ارتفاع أكبر. في تناقض حاد ، كما هو موضح في العمل الرائد ل Kumi et al. في 201037 ، توفر تقنية 2PP نطاقا غير محدود بشكل أساسي لنسبة العرض إلى الارتفاع للأجزاء المطبوعة ، والتي تمتد من دون ميكرومتر إلى ملليمتر. هنا ، تم توضيح عملية التصنيع الدقيق للقالب مع اختلاف كبير في ارتفاع أجزائه ، والتي تتميز بتمييز يزيد عن 100 ضعف بين ارتفاع القنوات الدقيقة (5 ميكرومتر والحد الأقصى لارتفاع القالب (545 ميكرومتر ؛ انظر الشكل 2).
أيضا ، يمكن تحقيق استبانة الميكرومتر الفرعي بسهولة باتباع مواصفات البروتوكول الموضحة. وبالمقارنة ، فإن تحقيق دقة محسنة للقالب من خلال الطباعة الحجرية الضوئية للأشعة فوق البنفسجية يتطلب استثمار رأس المال. يتم تسعير الأقنعة ذات الدقة الأفضل ، باستخدام ترسب الكروم على الكوارتز بدقة اسمية تبلغ 600 نانومتر ، بعدة أوامر من حيث الحجم أعلى من أقنعة الشفافية العلوية المطبوعة بالليزر ، والتي تمتلك دقة 250 ميكرومتر35 ، ومع ذلك انظر عمل Pirlo et al.41. لكي تكون قابلة للتطبيق للاستخدام الداخلي ، يجب أن تكون الطريقة المختارة فعالة من حيث التكلفة. بالنسبة للعديد من المختبرات البيولوجية ، فإن التكلفة الإجمالية المرتبطة بالطباعة الحجرية الضوئية اللينة التقليدية أو الكتابة بالليزر المباشر تمثل حاجزا. في حين أنه من الممكن جعل كلتا التقنيتين أكثر سهولة من خلال شراء وتجميع المكونات الأساسية ، فإن هذا النهج يتطلب خبرة إضافية ولا يزال يتطلب استثمارا ملحوظا. في هذا السياق ، هناك نقطة أساسية يجب مراعاتها وهي الطيف الأوسع للتطبيقات التي يمكن تحقيقها من خلال الكتابة بالليزر المباشر. على عكس الطباعة الحجرية الضوئية اللينة التقليدية ، التي تقتصر في المقام الأول على التصنيع الدقيق للقوالب ، فإن الطباعة 2PP 3D تعرض تنوعا ملحوظا. تمتد تطبيقاته المحتملة من الموائع الدقيقة والبصريات الدقيقة إلى الضوئيات المتكاملة والميكانيكا الدقيقة. وهذا يجعل الاستثمار في هذه التكنولوجيا جذابا كمرفق مشترك لمجالات علمية متعددة ومتنوعة. على سبيل المثال ، المنهجية القائمة على 2PP المصممة في هذا البروتوكول هي نتيجة تعاون متعدد التخصصات بين أقسام علم الأعصاب والرياضيات داخل مؤسستنا. بالإضافة إلى ذلك ، يعد تطوير مقاومة الضوء مجالا نشطا للبحث ، ويمكن أن يوسع نطاق تطبيقات الطباعة 2PP 3D. ومن الأمثلة على ذلك إدخال راتنج IP-PDMS مؤخرا. من خلال البلمرة في هياكل ذات خصائص مثل PDMS38 ، يفتح هذا الراتنج إمكانية التصنيع الدقيق المباشر للمكونات المتوافقة حيويا التي لها سطح معقد أو تحتوي على مساحات مجوفة. تقف هذه التعقيدات كحواجز أمام تحقيق نتائج مماثلة من خلال إجراءات صب النسخ المتماثلة التقليدية.
كدليل على هذه الطريقة ، تم تقديم أدلة تشير إلى تطوير اتصال أحادي الاتجاه بين وحدتين في شبكة عصبية معيارية. كان للقالب الصغير ، الذي تم تصنيعه بواسطة تقنية 2PP ، قدرة تحمل كافية للخضوع لصب PDMS متعدد ، ولديه الدقة المطلوبة على نطاق صغير. وفي الختام، فإن نطاق تطبيق البروتوكول الموصوف في هذا العمل يتجاوز الحالة الموضحة. مع انتشار الوصول إلى تقنية الطباعة 2PP بشكل متزايد ، سينخفض الاستثمار الأولي المطلوب لتنفيذها بينما سيتوسع نطاق تطبيقاتها المحتملة.

يمثل التحقيق في النشاط العصبي في الكائنات الحية التي تتصرف العديد من التحديات. على سبيل المثال ، الوصول المادي إلى أنسجة المخ محدود بالحاجة إلى الحفاظ على سلامتها ، لذلك يتم النظر في المناطق السطحية للدماغ بسهولة أكبر. غالبا ما يكون عزل أهداف محددة داخل الأنسجة السليمة مهمة شاقة وأحيانا مستحيلة. على الرغم من أن الثقافات العصبية المتجانسة المنفصلة توفر وصولا سهلا إلى الخصائص الجزيئية والكيميائية الحيوية والفيزيائية الحيوية للمكونات الخلوية الفردية (الفرعية) للدائرة العصبية ، إلا أن الاتصال الواقعي والتنظيم التشريحي للدماغ السليم مفقود. ألهمت هذه القيود الأساسية الجهود البحثية لتحقيق حل وسط ، حيث يتم تجنب التعقيد في الجسم الحي بينما يمكن بناء الهيكل في المختبر ، وهو عند الطلب1،2،3،4،5،6،7،8،9. على وجه الخصوص ، كانت الثقافات العصبية المعيارية موضوع بحث مكثف على مدى العقود الماضية ، بهدف معالجة الأسئلة الرئيسية لفسيولوجيا الدماغ كما هو موضح أدناه.
التنظيم: تظهر الدراسات في الجسم الحي أن الدماغ منظم تشريحيا في طبقات ذات أنواع خلايا دقيقة ومصفوفات من الإسقاطات. كشفت المقايسات الوظيفية عن تنظيم الشبكات العصبية في مجموعات ووحدات العقد ، مع مخططات اتصال دقيقة10,11. ومع ذلك ، لا يمكن دراسة دور الاتصال وزخارف الدوائر الدقيقة بشكل كاف في الجسم الحي بسبب العدد الهائل من نقاط الاشتباك العصبي المعنية ، فضلا عن التأثيرات المتشابكة للتطور واللدونة المعتمدة على النشاط.
نقل الإشارة: في الثقافات في الجسم الحي أو العشوائي في المختبر ، من الصعب تقييم نقل الإشارة. يتطلب فحص التوصيل المحوري وجهد العمل على طوله توجيه نمو الخلايا العصبية عن طريق وظائف السطح أو الزخرفة الكيميائية ، مما يوفر نسبة إشارة إلى ضوضاء عالية في قراءات النشاط الكهربائيخارج الخلية 12.
الصلة الانتقالية: يتطلب فك رموز الدور الحصري للعناصر قبل مقابل ما بعد المشبكي عبر الحالات المرضية الوصول إلى هذه العناصر بشكل فردي. الثقافات المعيارية ذات الاتصال المقيد ، والتي تفصل بشكل فعال العناصر قبل وبعد المشبكي ، هي أدوات لا غنى عنها لتحقيق هذه الغاية13.
توجد عدة طرق للحصول على شكل من أشكال البنية في الثقافة العصبية. يمكن تصنيفها على نطاق واسع على أنها معالجة سطحية كيميائية وفيزيائية9. تعتمد الطرق السابقة 14,15 على ميل الخلايا العصبية للالتصاق ببعض المركبات الكيميائية (الحيوية). وهذا يتطلب ترسيب جزيئات لاصقة أو جذابة على سطح بدقة متناهية الصغر واتباع نمط مفصل. في حين أن هذا يسمح بتغطية جزئية لسطح الخلايا ، باتباع النمط المطلوب ، فإن الطرق الكيميائية محدودة بطبيعتها ولها معدل نجاح منخفض نسبيا في توجيه نمو الخلاياالعصبية 16. يتطلب التحكم الكامل في اتجاه المحور إنشاء تدرج مكاني للمواد الكيميائية المخصصة لتشكيل التوجيه المحوري17. تتضمن الطرق الأخيرة معالجة السطح المادي وتستخدم بشكل أكثر شيوعا لهيكلة الشبكات العصبية في المختبر. يتم تقييد الخلايا العصبية جسديا في المواقع المرغوبة من خلال الحدود الهندسية ، مثل الغرف المجهرية والجدران والقنوات وما إلى ذلك ، مما يشكل بوليمر متوافق حيويا مثل polydimethylsiloxane (PDMS) 3،5،6،7،18،19،20 يتم علاجه وتصلبه في جهاز الموائع الدقيقة. الطريقة الفعلية لتصنيع الموائع الدقيقة PDMS هي الطباعة الحجرية الضوئيةالناعمة 21 ، حيث يتم تصميم قناع ثنائي الأبعاد على نطاق صغير ويستخدم لحفر مادة قائمة على السيليكون بشكل انتقائي عند التعرض للأشعة فوق البنفسجية. باختصار ، يتم طلاء راتنج قابل للمعالجة بالأشعة فوق البنفسجية (أي مقاوم للضوء) على رقاقة سيليكون من خلال طلاء مغزلي ، يصل إلى ارتفاع معين تحدده لزوجته وسرعة دورانه. بعد ذلك ، يتم وضع القناع المنقوش فوق المقاوم للضوء وتعريضه للأشعة فوق البنفسجية. ستسمح المناطق الشفافة داخل القناع ، المقابلة للمناطق ذات الاهتمام ، للأشعة فوق البنفسجية بتحفيز التشابك الموضعي للجزيئات المقاومة للضوء. يتم غسل مناطق مقاومة الضوء غير المكشوفة باستخدام مذيب ، مما يؤدي إلى تكوين قالب رئيسي. يتم استخدام هذا بشكل متكرر لخبز المطاط الصناعي من الاختيار (أي PDMS) ، والذي يتم نقشه بعد ذلك بالأشكال الهندسية المطلوبة في العديد من النسخ المتماثلة حسب الرغبة. طريقة التصنيع هذه هي الطريقة الأكثر شيوعا لتصنيع أجهزة الموائع الدقيقة22. ربما تكون القيود الرئيسية للطباعة الحجرية الضوئية اللينة هي الشرط الأساسي للاستثمار الرأسمالي الملحوظ وعدم إلمام المختبرات البيولوجية بالتقنيات والخبرات المطلوبة. إن تحضير القناع وخطوات الطباعة الحجرية الضوئية الناعمة المطلوبة لتصميم أشكال هندسية معقدة متعددة الارتفاعات ذات نسبة عرض إلى ارتفاع عالية ليست تافهة23 وغالبا ما تتطلب الاستعانة بمصادر خارجية. على الرغم من اقتراح طرق بديلة ومنخفضة الميزانية ، إلا أنها لا تفي دائما بمتطلبات الدقة العالية للنماذج الأوليةالبيولوجية 24.
هنا ، يتم تقديم طريقة تصنيع بديلة ، تعتمد على بلمرة الفوتون (2PP) والتصنيع المضاف. إنه واضح ومباشر ولا يتطلب في حد ذاته خبرة متقدمة في التصنيع الدقيق والتصوير الضوئي. ظهر مجال البحث في التصنيع الدقيق 2PP في أواخر 9025 ، ومنذ ذلك الحين ، شهد نموا هائلا26. يمكن العثور على المزيد حول المبادئ الأساسية لهذه التقنية في مكان آخر26. باختصار ، من خلال تركيز نبضة ضوء الإثارة في الفضاء ثلاثي الأبعاد ، يستفيد 2PP من الاعتماد غير الخطي لامتصاص الفوتون المتعدد على الشدة. وهذا يمنح القدرة على الامتصاص المحصور ، مما يضمن الإثارة الدقيقة والانتقائية داخل المناطق المحلية للغاية. في جوهرها ، تخضع مادة مقاومة ضوئية ذات نغمة سلبية ، وهي مادة ذات قابلية ذوبان منخفضة عند التعرض للضوء ، لحزمة مركزة من نبضات ليزر الفيمتو ثانية في دورة عمل منخفضة27. وهذا يسمح بنبضات ذات كثافة عالية عند متوسط قوى منخفض ، مما يتيح البلمرة دون الإضرار بالمادة. يؤدي تفاعل المونومرات الجذرية المستحثة بالضوء إلى ظهور أوليغومرات جذرية ، مما يؤدي إلى البلمرة التي تمتد في جميع أنحاء المقاومة الضوئية حتى حجم مميز ، أي فوكسل ، الذي يعتمد حجمه على شدة ومدة نبضات الليزر28.
في هذا العمل ، يتم تقديم مكونين: أ) التصميم والتصنيع السريع لقالب مطبوع 3D ، قابل لإعادة الاستخدام عدة مرات لإنتاج أجهزة زراعة الخلايا العصبية البوليمرية التي يمكن التخلص منها (الشكل 1) ، و ب) اقترانها الميكانيكي على سطح ركائز زراعة الخلايا العصبية المستوية ، أو حتى صفائف الأقطاب الكهربائية الدقيقة المدمجة في الركيزة القادرة على تسجيلات متعددة المواقع للإشارات الكهربائية الحيوية.
يتم وصف التصميم بمساعدة الكمبيوتر لنموذج ميكانيكي ثلاثي الأبعاد بإيجاز شديد هنا ويرافقه الخطوات المؤدية إلى قالب مطبوع ثلاثي الأبعاد وتصنيع أجهزة PDMS مفصلة أيضا.
يمكن استخدام مجموعة متنوعة من تطبيقات برامج التصميم بمساعدة الكمبيوتر لإنشاء نموذج كائن 3D للبدء وإنتاج ملف STL للتحكم في عملية طباعة 2PP. ضمن جدول المواد ، يكون التطبيقان الأول والأخير المدرجان مجانيا أو مزودين بترخيص مجاني. يتطلب بناء نموذج 3D دائما إنشاء رسم 2D ، والذي يتم بثقه بعد ذلك في خطوات النمذجة اللاحقة. لإثبات هذا المفهوم ، يتم تمييز عملية تصميم برنامج 3D CAD العامة في قسم البروتوكول ، مما يؤدي إلى هيكل مصنوع من مكعبات متداخلة. للحصول على معلومات أكثر شمولا ، يتوفر عدد من البرامج التعليمية عبر الإنترنت وموارد التدريب المجانية ، كما هو موضح في جدول المواد.
ثم يتم ترجمة ملف STL الناتج إلى سلسلة من الأوامر ليتم تنفيذها بواسطة طابعة 3D (أي إجراء التقطيع). بالنسبة للطابعة 2PP 3D المحددة المستخدمة ، يتم استخدام برنامج DeScribe لاستيراد ملف STL وتحويله إلى تنسيق لغة الكتابة العامة (GWL) الخاص. يتوقف نجاح عملية الطباعة 2PP على معايير مختلفة ، لا سيما طاقة الليزر وسرعة المسح الضوئي والخياطة ومسافات تقطيع الفقس. يعتمد اختيار هذه المعلمات ، إلى جانب اختيار الهدف ومقاومة الضوء ، على أصغر ميزات التصميم ، بالإضافة إلى التطبيق المقصود. وبالتالي ، يصبح تحسين المعلمات ضروريا لتلبية متطلبات سيناريوهات التصميم المختلفة وحالات الاستخدام. لهذا العمل ، تم اعتبار الوصفة الموصى بها IP-S 25x ITO Shell (3D MF) كتكوين لمعلمات الطباعة. في النهاية ، تتم طباعة جزء مطبوع مستقر ميكانيكيا بالدقة اللازمة مع تقليل وقت الطباعة 3D.
يتألف تصميم القالب وملف STL ذي الصلة ، الموضح في هذا العمل ، من إطار مربع لفصل مساحة زراعة الخلايا في جزأين: منطقة خارجية (أي يشار إليها باسم المصدر لاحقا) ومنطقة داخلية (أي يشار إليها باسم الهدف لاحقا). ترتبط هاتان الحجرتان من خلال مجموعات من القنوات الدقيقة ، تتميز كل منها بحدود حادة الزاوية ، مصممة خصيصا لإعاقة نمو الخلايا العصبية من الهدف إلى المصدر ، ولكن ليس العكس ، وبالتالي تعزيز الاتصال المشبكي الاتجاهي بين الخلايا العصبية التي تنمو في المنطقتين.
استخدمت الدراسات السابقة أشكال هندسية مختلفة من القنوات الدقيقة لتشجيع النمو الاتجاهي للخلايا العصبية. ومن الأمثلة على ذلك الأشكال المثلثة18 ، والهياكل الشائكة للقناة19 ، والقنوات المستدقة20. هنا ، يتم استخدام تصميم يتميز بحواجز زاوية حادة عبر حدود القناة الصغيرة ، والتي تتميز أيضا بمداخل غير متماثلة. تعمل هذه القنوات الدقيقة على إنشاء استمرارية بين الجزء الداخلي المغلق ، والمقصورة المستهدفة ، والمنطقة الخارجية ، حجرة المصدر. تم تصميم شكل القمع للجزء الأولي من القنوات الدقيقة ، من جانب المصدر ، لتعزيز تكوين الحزم المحورية ونموها على طول أقصر مسار ، أي خط مستقيم ، يربط المصدر بالهدف. المساحة المثلثة التي تتحقق من خلال مواجهة الزوايا الحادة لها حجم أكبر في الجانب المستهدف بهدف تأخير مسار الأعصاب بشكل فعال مع تفضيل التصوير السريع للحزم الناشئة من المصدر واحتلال المساحة المتاحة. إن اختيار 540 ميكرومتر لطول القنوات الدقيقة يرشح بشكل فعال النمو الشجيري الأقصر بشكل عام39. بالإضافة إلى ذلك ، يمنع ارتفاعها البالغ 5 ميكرومتر الخلية الجسدية من اختراق القنوات الدقيقة. بشكل عام ، أثبت هذا التكوين أنه يعزز الاتصال أحادي الاتجاه بين الوحدات الخارجية والمصدر والداخلية والوحدات المستهدفة ، ويتم تقديمه هنا كدليل على المبدأ من بين العديد من الخيارات البديلة.
في حين أن أجهزة PDMS ، المصنعة بواسطة قالب 2PP ، يمكن توصيلها بسطح ركائز زراعة الخلايا الشائعة ، مثل أغطية الزجاج أو أطباق بتري ، في هذا العمل تم استخدام صفائف الأقطاب الكهربائية الدقيقة المدمجة في الركيزة المتاحة تجاريا. لم يتم بذل أي جهد لتحسين تصميم 3D لتخطيط صفيف microelectrode ، وتم إجراء اقتران ميكانيكي تحت توجيه المجهر المجسم يهدف فقط إلى وضع الجهاز عبر الصفيف ، وترك بعض microelectrode مكشوفة في كلا الجانبين ، المصدر والهدف. وهذا يتيح التقييم الأولي للعواقب الوظيفية للاتصال المقيد في مزارع الخلايا العصبية.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-Propanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>650447</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BB cure compact polymerizer</td>
			<td>PCube Srl</td>
			<td></td>
			<td>Wavelengths 365-405 nm, Power 120W</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioMed Amber Resin 1 L</td>
			<td>formlabs</td>
			<td></td>
			<td>Resin used for mounting the 3D Printed mold to Petri dish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CAD application software SolidWorks</td>
			<td>Dassault Syst&#232;mes SolidWorks Corporation, US</td>
			<td></td>
			<td>Fusion 360 (Autodesk Inc., US), AutoCAD (Autodesk Inc., US), PTC Creo (PTC corp., US), SolidWorks (Dassault Syst&#232;mes SolidWorks corp., US) and Tinkercad (Autodesk Inc., US). 
			&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; -------------------------------------- 
			Tutorials: https://www.mycadsite.com/tutorials.html 
			Trainings: https://www.autodesk.com/training</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTracker Green CMFDA</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C7025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-AP5</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>#0106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deoxyribonuclease I</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D5025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DeScribe</td>
			<td>Nanoscribe GmbH &#38; Co.&#160;KG</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>di-Sodium hydrogen phosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>106585</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>15710049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks&#8242; Balanced Salts</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H2387</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H7523</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse Serum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H1138</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>in vitro MEA recording system MEA2000 mini</td>
			<td>Multichannel Systems GmBH, Reutlingen, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IP-S Photoresist</td>
			<td>Nanoscribe GmbH &#38; Co.&#160;KG</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kynurenic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>K3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine (200 mM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25030081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulfate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M2643</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEA recording application software (Experimenter)</td>
			<td>Multichannel Systems GmBH, Reutlingen, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minimum Essential Medium</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>51412C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoWrite</td>
			<td>Nanoscribe GmbH &#38; Co.&#160;KG</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ophthalmic stab Knife 15&#176;</td>
			<td>HESTIA Medical</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photonic Professional GT2 (PPGT2) 3D printer</td>
			<td>Nanoscribe GmbH &#38; Co.&#160;KG</td>
			<td>SN617</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma Cleaner</td>
			<td>HARRICK PLASMA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly(ethyleneimine) solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3143</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3911</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propylene glycol methyl ether acetate (PGMEA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>484431</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Repel-silane ES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>GE17133201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Soda lime ITO-coated substrates for 3D MF DiLL</td>
			<td>Nanoscribe GmbH &#38; Co.&#160;KG</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S6014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Substrate-integrated planar MEAs (120MEA100/30iR-ITO-gr)</td>
			<td>Multichannel Systems GmBH, Reutlingen, Germany</td>
			<td></td>
			<td>TiN electrodes, SiN isolator, 4 internal reference electrodes,120 recording electrodes, Electrode spacing 100 &#181;m,Electrode diameter 30 &#181;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYLGARD 184 Kit</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T1005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin inhibitor</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T9003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>vacuum pump Single phase asynchronous 2 poles&#160;</td>
			<td>CIMAMOTORI</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

two-photon polymerization 3d-printing of micro-scale neuronal cell culture devices

كانت الثقافات العصبية نموذجا تجريبيا مرجعيا لعدة عقود. ومع ذلك ، فإن ترتيب الخلايا 3D ، والقيود المكانية على نمو الخلايا العصبية ، والاتصال المشبكي الواقعي مفقود. هذا الأخير يحد من دراسة البنية والوظيفة في سياق التقسيم ويقلل من أهمية الثقافات في علم الأعصاب. إن تقريب الترتيب التشريحي المنظم للاتصال المشبكي خارج الجسم الحي ليس بالأمر الهين ، على الرغم من كونه مفتاحا لظهور الإيقاعات ، واللدونة المشبكية ، وفي النهاية ، الفيزيولوجيا المرضية للدماغ. هنا ، يتم استخدام بلمرة الفوتون (2PP) كتقنية طباعة ثلاثية الأبعاد ، مما يتيح التصنيع السريع لأجهزة زراعة الخلايا البوليمرية باستخدام polydimethyl-siloxane (PDMS) على مقياس ميكرومتر. بالمقارنة مع تقنيات التشكيل المتماثلة التقليدية القائمة على التصوير الضوئي الدقيق ، تتيح الطباعة على نطاق صغير 2PP تحولا سريعا وبأسعار معقولة للنماذج الأولية. يوضح هذا البروتوكول تصميم وتصنيع أجهزة الموائع الدقيقة القائمة على PDMS والتي تهدف إلى زراعة الشبكات العصبية المعيارية. كدليل على المبدأ ، يتم تقديم جهاز من غرفتين لتقييد الاتصال جسديا. على وجه التحديد ، يفضل النمو المحوري غير المتماثل أثناء التطور خارج الجسم الحي ويسمح بتوجيهه من غرفة إلى أخرى. من أجل التحقيق في العواقب الوظيفية للتفاعلات المشبكية أحادية الاتجاه ، يتم اختيار صفائف الأقطاب الكهربائية الدقيقة التجارية لمراقبة النشاط الكهربائي الحيوي للوحدات العصبية المترابطة. هنا ، يتم توضيح طرق 1) تصنيع القوالب بدقة ميكرومتر و 2) إجراء تسجيلات خارج الخلية متعددة المواقع في المختبر في الثقافات العصبية القشرية للفئران. من خلال خفض التكاليف وإمكانية الوصول إلى الطباعة ثلاثية الأبعاد 2PP في المستقبل ، ستصبح هذه الطريقة أكثر أهمية عبر مختبرات الأبحاث في جميع أنحاء العالم. خاصة في مجال التكنولوجيا العصبية وتسجيل البيانات العصبية عالية الإنتاجية ، فإن سهولة وسرعة النماذج الأولية المبسطة في النماذج المختبرية ستحسن التحكم التجريبي والفهم النظري للأنظمة العصبية واسعة النطاق في الجسم الحي .

Investigating neuronal activity in behaving organisms presents several challenges. For instance, physical access to the brain tissue is limited by the need to maintain its integrity, so the brain&#39;s superficial regions are more easily considered. Isolating specific targets within the intact tissue is often a daunting task and sometimes impossible. Although dissociated homogeneous neuronal cultures offer convenient access to the molecular, biochemical, and biophysical properties of individual (sub)cellular components of a neural circuit, a realistic connectivity and anatomical organization of the intact brain is lost. These fundamental constraints inspired research efforts to achieve a middle ground, where in vivo complexity is avoided while the structure can be constructed in vitro, which is on demand1,2,3,4,5,6,7,8,9. In particular, modular neuronal cultures have been a subject of extensive research over the past decades, aiming to tackle key questions of brain physiology as described below.
Organization:&#160;In vivo studies show that the brain is structured anatomically in layers with precise cell types and arrays of projections. Functional assays revealed the organization of the neuronal networks in node assemblies and modules, with precise connectivity schemes10,11. The role of connectivity and microcircuit motifs cannot, however, be studied adequately in vivo due to the sheer number of synapses that are involved, as well as the interwoven effects of development and activity-dependent plasticity.
Signal transfer: In in vivo or random in vitro cultures, it is challenging to assess signal transfer. Examining the axonal conduction and action potential along its length requires guiding neurite outgrowth by surface functionalization or chemical patterning, providing a high signal-to-noise ratio in extracellular readouts of electrical activity12.
Translational relevance: Deciphering the exclusive role of pre- versus post-synaptic elements across pathological conditions requires having access to these elements individually. Modular cultures with constrained connectivity, effectively segregating the pre-and post-synaptic elements, are indispensable tools to this end13.
Several methods exist to obtain some form of structure in neuronal culture. They can be broadly categorized as chemical and physical surface manipulation9. The former methods14,15 rely on the propensity of neuronal cells to attach to certain (bio)chemical compounds. This requires depositing adhesive or attractive molecules on a surface with micro-scale precision and following a detailed pattern. While this allows a partial coverage of the surface of the cells, following the desired pattern, chemical methods are inherently limited and have a relatively low success rate in neurite growth guidance16. Full control over axon directionality requires establishing a spatial gradient of ad-hoc chemicals to shape axonal guidance17. The latter methods involve physical surface manipulation and are more commonly used to structure the neuronal networks in vitro. Neuronal cells are physically constrained at desired locations by geometrical confinements, such as microscopic chambers, walls, channels, etc., shaping a biocompatible polymer such as polydimethylsiloxane (PDMS)3,5,6,7,18,19,20 cured and solidified into a microfluidic device. The de facto method for PDMS microfluidic fabrication is soft photolithography21, where a two-dimensional mask is patterned at a micro-scale and employed to selectively etch a silicon-based material upon UV exposure. In a nutshell, a UV-curable resin (i.e., photoresist) is coated onto a silicon wafer through spin-coating, reaching a specific height determined by its viscosity and spinning speed. Then, the patterned mask is positioned over the photoresist and exposed to UV light. Transparent areas within the mask, corresponding to regions of interest, will let UV light induce localized crosslinking of the photoresist molecules. The areas of unexposed photoresist are washed away using a solvent, resulting in the formation of a master mold. This is repeatedly used to bake an elastomer of the choice (i.e., PDMS), which is then engraved with the desired geometries in as many replicas as desired. Such a manufacturing method is the most common method to fabricate microfluidic devices22. Perhaps the main limitations of soft photolithography are the prerequisite of notable capital investment and the unfamiliarity of biological labs with the required techniques and expertise. The preparation of the mask and the steps of soft photolithography required to design complex multiple-height high aspect ratio geometries are non-trivial23 and often require outsourcing. Even though alternative and low-budget methods have been proposed, they do not always satisfy the high precision requirements of biological prototyping24.
Here, an alternative manufacturing method is presented, relying on two-photon polymerization (2PP) and additive manufacturing. It is straightforward and does not require per se advanced microfabrication and microphotolitography expertise. The research field of 2PP micromanufacture emerged in the late 90&#39;s25, and since then, it has witnessed exponential growth26. More about the fundamental principles of this technique can be found elsewhere26. Briefly, by focusing the excitation light impulse in three-dimensional space, 2PP leverages the nonlinear dependence of multiphoton absorption on intensity. This grants the capability of confined absorption, ensuring precise and selective excitation within very localized regions. In essence, a negative-tone photoresist, a material with decreased solubility upon light exposure, is subjected to a focused beam of femtosecond laser pulses at a low duty-cycle27. This allows for impulses with high intensities at low average powers, enabling polymerization without harming the material. The interaction of photo-induced radical monomers gives rise to radical oligomers, initiating polymerization that extends throughout the photoresist up to a distinct volume, i.e., voxel, whose size depends on the intensity and duration of the laser pulses28.
In this work, two components are presented: A) the design and rapid fabrication of a 3D-printed mold, reusable many times to produce disposable polymeric neuronal cell culture devices (Figure 1), and B) their mechanical coupling onto the surface of planar neuronal cell culture substrates, or even of substrate-integrated microelectrode arrays capable of multisite recordings of bioelectric signals.
Computer Assisted Design of a 3D mechanical model is very briefly described here and accompanied by the steps leading to a 3D-printed mold and fabricating PDMS devices is also detailed.
A variety of computer-aided design software applications can be used to generate the starting 3D object model and produce a STL file to control the 2PP printing process. Within the Table of Materials, the first and the last applications listed are free-of-charge or provided with a free license. Constructing a 3D model always requires creating a 2D sketch, which is then extruded in subsequent modelling steps. To demonstrate this concept, a generic 3D CAD software design process is highlighted in protocol section, leading to a structure made of overlapping cubes. For more comprehensive information, a number of online tutorials and free training resources are available, as indicated in the Table of Materials.
The resulting STL file is then translated into a series of commands to be executed by the 3D-printer (i.e., slicing procedure). For the specific 2PP 3D-printer in use, the software DeScribe is used to import the STL file and convert it into the proprietary General Writing Language (GWL) format. The success of 2PP printing process hinges on various parameters, notably, laser power and its scan speed, stitching, and hatching-slicing distances. The choice of these parameters, along with the selection of objective and photoresist, depends on the design&#39;s smallest features, as well as the intended application. Thus, parameter optimization becomes essential to meet the requirements of different design scenarios and use cases. For this work, the recommended recipe IP-S 25x ITO Shell (3D MF) has been considered as a configuration for the printing parameters. Ultimately, a mechanically stable printed part is printed with the necessary resolution while minimizing its 3D-printing time.
The mold design and related STL file, demonstrated in this work, comprises a square frame to segregate the space of a cell culture in two compartments: an outer area (i.e., referred to as Source subsequently) and an inner area (i.e., referred to as Target subsequently). These two compartments are connected through sets of microchannels, each characterized by sharp-angle borders, designed to specifically hinder the growth of neurites from the Target to the Source, but not vice versa, and as such promote a directional synaptic connectivity between neurons growing on the two areas.
Earlier studies employed different geometries of microchannels to encourage the directional growth of neurites. Examples include triangular shapes18, channel barbed structures19, and tapering channels20. Here, a design featuring sharp angle barriers across the microchannel&#39;s borders is employed, characterized also by asymmetric entrances. These microchannels serve to establish continuity between an enclosed interior, the Target compartment, and the external area, the Source compartment. The funnel shape of the initial part of the microchannels, from the Source side, is designed to promote the formation of axonal bundles and their growth along the shortest, i.e., straight line, path connecting the Source to the Target. The triangular space realized by facing sharp angles have larger volume at the Target side to aim at effectively delaying neurites&#39; pathfinding while favoring the rapid shooting of bundles originating from the Source and occupation of the available space. The choice of 540 &#181;m for the length of the microchannels effectively filters out the generally shorter dendritic outgrowth39. In addition, their 5 &#181;m height prevents cell somata from penetrating through the microchannels. Overall, this configuration proved to promote unidirectional connectivity between the outer, Source, and inner, Target modules, and it is presented here as a proof-of-principle among the many alternative choices.
While the PDMS devices, fabricated by the 2PP mold, can be attached to the surface of common cell culture substrates, such as glass coverslips or Petri dishes, in this work commercially available substrate-integrated microelectrode arrays were used. No effort has been made to optimize the 3D design to the microelectrode array layout, and the mechanical coupling was performed under stereomicroscopy guidance aiming only at positioning the device across the array, leaving some microelectrode uncovered in both sides, the Source and the Target. This enables the preliminary assessment of the functional consequences of the constrained connectivity in neuronal cell cultures.

تسليط الضوء على المؤلف: الشبكات العصبية المعيارية لتحليل وظائف الدماغ

ثنائي الفوتون البلمرة 3D الطباعة من أجهزة زراعة الخلايا العصبية على نطاق صغير

We are broadly interested in the relationship between structural and functions in the brain, particularly at the level of micro-circuits. We often employ reduced experimental preparations such as dissociated neuron cell culture because they are a precious model to investigate electrical activity, synaptic transmission, and overall, the emergence of collective states. The method we propose is ideal for rapid fabrication of microscale, polymeric devices.This can be immediately used for the experimental study of modular neural networks in a dish, and it do not requires a high level of technical expertise in soft photolithography. This method and our simple proof of concept allow the designing of modular neuronal networks where we can define the structure, and control the flow of biological signals. Drug screening and investigation of pathological conditions immediately benefit from these sophisticated in vitro neuronal networks.

تتيح الطباعة ثلاثية الأبعاد 3D على مقياس الميكرومتر النماذج الأولية السريعة للأجهزة البوليمرية لمزارع الخلايا العصبية. كدليل على المبدأ ، تم تقييد الروابط الهيكلية بين الخلايا العصبية من خلال إنشاء حواجز وقنوات تؤثر على نمو الخلايا العصبية ، في حين لوحظت العواقب الوظيفية لمثل هذا التلاعب من قبل الفيزيولوجيا الكهربية خارج الخلية.

Neuronal cultures have been a reference experimental model for several decades. However, 3D cell arrangement, spatial constraints on neurite outgrowth, ...

نحن مهتمون على نطاق واسع بالعلاقة بين الهيكلية والوظائف في الدماغ ، لا سيما على مستوى الدوائر الدقيقة. غالبا ما نستخدم مستحضرات تجريبية مخفضة مثل زراعة الخلايا العصبية المنفصلة لأنها نموذج ثمين لدراسة النشاط الكهربائي ، والانتقال المشبكي ، وبشكل عام ، ظهور الحالات الجماعية. الطريقة التي نقترحها مثالية للتصنيع السريع للأجهزة البوليمرية المجهرية.يمكن استخدام هذا على الفور للدراسة التجريبية للشبكات العصبية المعيارية في طبق ، ولا يتطلب مستوى عال من الخبرة الفنية في الطباعة الحجرية الضوئية الناعمة. تسمح هذه الطريقة وإثباتنا البسيط للمفهوم بتصميم شبكات عصبية معيارية حيث يمكننا تحديد البنية والتحكم في تدفق الإشارات البيولوجية. يستفيد فحص الأدوية والتحقيق في الحالات المرضية على الفور من هذه الشبكات العصبية المتطورة في المختبر.

two-photon-polymerization-3d-printing-micro-scale-neuronal-cell

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Two-Photon Polymerization 3D-Printing of Micro-scale Neuronal Cell Culture Devices

Neuronal cultures have been a reference experimental model for several decades. However, 3D cell arrangement, spatial constraints on neurite outgrowth, and realistic synaptic connectivity are missing. The latter limits the study of structure and function in the context of compartmentalization and diminishes the significance of cultures in neuroscience. Approximating ex vivo the structured anatomical arrangement of synaptic connectivity is not trivial, despite being key for the emergence of rhythms, synaptic plasticity, and ultimately, brain pathophysiology. Here, two-photon polymerization (2PP) is employed as a 3D printing technique, enabling the rapid fabrication of polymeric cell culture devices using polydimethyl-siloxane (PDMS) at the micrometer scale. Compared to conventional replica molding techniques based on microphotolitography, 2PP micro-scale printing enables rapid and affordable turnaround of prototypes. This protocol illustrates the design and fabrication of PDMS-based microfluidic devices aimed at culturing modular neuronal networks. As a proof-of-principle, a two-chamber device is presented to physically constrain connectivity. Specifically, an asymmetric axonal outgrowth during ex vivo development is favored and allowed to be directed from one chamber to the other. In order to probe the functional consequences of unidirectional synaptic interactions, commercial microelectrode arrays are chosen to monitor the bioelectrical activity of interconnected neuronal modules. Here, methods to 1) fabricate molds with micrometer precision and 2) perform in vitro multisite extracellular recordings in rat cortical neuronal cultures are illustrated. By decreasing costs and future widespread accessibility of 2PP 3D-printing, this method will become more and more relevant across research labs worldwide. Especially in neurotechnology and high-throughput neural data recording, the ease and rapidity of prototyping simplified in vitro models will improve experimental control and theoretical understanding of in vivo large-scale neural systems.

3D printing at the micrometer scale enables rapid prototyping of polymeric devices for neuronal cell cultures. As a proof-of-principle, structural connections between neurons were constrained by creating barriers and channels influencing neurite outgrowth, while the functional consequences of such manipulation were observed by extracellular electrophysiology.