Name: Author Spotlight: Advancing Cancer Therapeutics Using Tumor Xenotransplantation in Zebrafish
Uploaded: 2024-07-12T12:40:00
Description: In vivo studies of tumor behavior are a staple of cancer research; however, the use of mice presents significant challenges in cost and time. Here, we ...

이 연구는 NIH 보조금 R37AI110985 및 P30CA006927, Commonwealth of Pennsylvania, Leukemia and Lymphoma Society 및 Bishop Fund의 지원을 받았습니다. 이 연구는 또한 세포 배양, 유세포 분석 및 실험실 동물 시설을 포함한 Fox Chase의 핵심 시설의 지원을 받았습니다. FCCC에서 제브라피시 및 미세주사 시설을 유지해 주신 Jennifer Rhodes 박사님께 감사드립니다.

제브라피시의 유지, 먹이 및 사육은 기술된 바와 같이 28.5°C의 표준 양식 조건 하에서 이루어졌다31. 모든 제브라피시 관련 실험은 이 온도에서 수행되었습니다. 그러나, 이종 이식 후, 동물은 IACUC(Institutional Animal Care and Use Committee)에서 승인한 절차에 따라 실험 기간 동안 34°C에서 배양했습니다.
1. 사육 (주입 3 일 전)
<ol><li>번식 일주일 전에 물?...

Utilizing Larval Zebrafish for Efficient In Vivo Tumor Studies

<ol>
	<li>Sharma, G., Goyal, Y., Bhatia, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Handbook+of+Animal+Models+and+its+Uses+in+Cancer+Research.">Handbook of Animal Models and its Uses in Cancer Research.</a> Preclinical Animal Models of Cancer: Applications and Limitations. , (2022).</li><li>Singhal, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advancement+in+breast+cancer+research:+Insights+from+model+organisms-Mouse+models+to+zebrafish.">Recent advancement in breast cancer research: Insights from model organisms-Mouse models to zebrafish.</a> Cancers. 15 (11), 2961 (2023).</li><li>Liu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-derived+xenograft+models+in+cancer+therapy:+technologies+and+applications.">Patient-derived xenograft models in cancer therapy: technologies and applications.</a> Signal Transduction and Targeted Therapy. 8 (1), 160 (2023).</li><li>Fuochi, S., Galligioni, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disease+Animal+Models+for+Cancer+Research.">Disease Animal Models for Cancer Research.</a> Cancer Cell Culture: Methods and Protocols. , (2023).</li><li>Shaw, T. J., Senterman, M. K., Dawson, K., Crane, C. A., Vanderhyden, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+intraperitoneal,+orthotopic,+and+metastatic+xenograft+models+of+human+ovarian+cancer.">Characterization of intraperitoneal, orthotopic, and metastatic xenograft models of human ovarian cancer.</a> Mol Ther. 10 (6), 1032-1042 (2004).</li><li>Deroose, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multimodality+imaging+of+tumor+xenografts+and+metastases+in+mice+with+combined+small-animal+PET,+small-animal+CT,+and+bioluminescence+imaging.">Multimodality imaging of tumor xenografts and metastases in mice with combined small-animal PET, small-animal CT, and bioluminescence imaging.</a> J Nucl Med. 48 (2), 295-303 (2007).</li><li>Zeng, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation,+evolution,+interfering+factors,+applications,+and+challenges+of+patient-derived+xenograft+models+in+immunodeficient+mice.">Generation, evolution, interfering factors, applications, and challenges of patient-derived xenograft models in immunodeficient mice.</a> Cancer Cell Int. 23 (1), 120 (2023).</li><li>Adhish, M., Manjubala, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effectiveness+of+zebrafish+models+in+understanding+human+diseases-A+review+of+models.">Effectiveness of zebrafish models in understanding human diseases-A review of models.</a> Heliyon. 9 (3), e14557 (2023).</li><li>MacRae, C. A., Peterson, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+as+a+mainstream+model+for+in+vivo+systems+pharmacology+and+toxicology.">Zebrafish as a mainstream model for in vivo systems pharmacology and toxicology.</a> Ann Rev Pharmacol Toxicol. 63, 43-64 (2023).</li><li>Choe, S. -. K., Kim, C. -. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish:+A+powerful+model+for+genetics+and+genomics.">Zebrafish: A powerful model for genetics and genomics.</a> Int J Mol Sci. 24 (9), 8169 (2023).</li><li>White, R., Rose, K., Zon, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+cancer:+the+state+of+the+art+and+the+path+forward.">Zebrafish cancer: the state of the art and the path forward.</a> Nat Rev Cancer. 13 (9), 624-636 (2013).</li><li>Al-Hamaly, M. A., Turner, L. T., Rivera-Martinez, A., Rodriguez, A., Blackburn, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+cancer+avatars:+A+translational+platform+for+analyzing+tumor+heterogeneity+and+predicting+patient+outcomes.">Zebrafish cancer avatars: A translational platform for analyzing tumor heterogeneity and predicting patient outcomes.</a> Int J Mol Sci. 24 (3), 2288 (2023).</li><li>White, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transparent+adult+zebrafish+as+a+tool+for+in+vivo+transplantation+analysis.">Transparent adult zebrafish as a tool for in vivo transplantation analysis.</a> Cell Stem Cell. 2 (2), 183-189 (2008).</li><li>Hill, D., Chen, L., Snaar-Jagalska, E., Chaudhry, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+zebrafish+xenograft+assay+of+human+cancer+metastasis.">Embryonic zebrafish xenograft assay of human cancer metastasis.</a> F1000Res. 7, 1682 (2018).</li><li>Corkery, D. P., Dellaire, G., Berman, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leukaemia+xenotransplantation+in+zebrafish--chemotherapy+response+assay+in+vivo.">Leukaemia xenotransplantation in zebrafish--chemotherapy response assay in vivo.</a> Br J Haematol. 153 (6), 786-789 (2011).</li><li>Lin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+clinically+relevant+in+vivo+zebrafish+model+of+human+multiple+myeloma+to+study+preclinical+therapeutic+efficacy.">A clinically relevant in vivo zebrafish model of human multiple myeloma to study preclinical therapeutic efficacy.</a> Blood. 128 (2), 249-252 (2016).</li><li>Grissenberger, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-content+drug+screening+in+zebrafish+xenografts+reveals+high+efficacy+of+dual+MCL-1/BCL-XL+inhibition+against+Ewing+sarcoma.">High-content drug screening in zebrafish xenografts reveals high efficacy of dual MCL-1/BCL-XL inhibition against Ewing sarcoma.</a> Cancer Lett. 554, 216028 (2023).</li><li>Baxi, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish:+A+Versatile+Animal+Model+to+Study+Tumorigenesis+Process+and+Effective+Preclinical+Drug+Screening+for+Human+Cancer+Research.">Zebrafish: A Versatile Animal Model to Study Tumorigenesis Process and Effective Preclinical Drug Screening for Human Cancer Research.</a> Handbook of Animal Models and its Uses in Cancer Research. , (2022).</li><li>Li, X., Li, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+application+of+zebrafish+patient-derived+xenograft+tumor+models+in+the+development+of+antitumor+agents.">The application of zebrafish patient-derived xenograft tumor models in the development of antitumor agents.</a> Med Res Rev. 43 (1), 212-236 (2023).</li><li>Yin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+patient-derived+xenograft+model+as+a+preclinical+platform+for+uveal+melanoma+drug+discovery.">Zebrafish patient-derived xenograft model as a preclinical platform for uveal melanoma drug discovery.</a> Pharmaceuticals. 16 (4), 598 (2023).</li><li>Nakayama, J., Makinoshima, H., Gong, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+drug+screening+to+identify+anti-metastatic+drugs+in+Twist1a-ER(T2)+transgenic+zebrafish.">In vivo drug screening to identify anti-metastatic drugs in Twist1a-ER(T2) transgenic zebrafish.</a> Bio Protoc. 13 (10), e4673-e4673 (2023).</li><li>Lam, S., Chua, H., Gong, Z., Lam, T., Sin, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+maturation+of+the+immune+system+in+zebrafish,+Danio+rerio:+a+gene+expression+profiling,+in+situ+hybridization+and+immunological+study.">Development and maturation of the immune system in zebrafish, Danio rerio: a gene expression profiling, in situ hybridization and immunological study.</a> Dev Comp Immunol. 28 (1), 9-28 (2004).</li><li>Nicoli, S., Presta, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zebrafish/tumor+xenograft+angiogenesis+assay.">The zebrafish/tumor xenograft angiogenesis assay.</a> Nat Protoc. 2 (11), 2918-2923 (2007).</li><li>Casey, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transplantation+of+zebrafish+pediatric+brain+tumors+into+immune-competent+hosts+for+long-term+study+of+tumor+cell+behavior+and+drug+response.">Transplantation of zebrafish pediatric brain tumors into immune-competent hosts for long-term study of tumor cell behavior and drug response.</a> J Vis Exp. (123), e55712 (2017).</li><li>Soh, G. H., K&#246;gler, A. C., M&#252;ller, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+and+effective+transplantation+device+for+zebrafish+embryos.">A simple and effective transplantation device for zebrafish embryos.</a> J Vis Exp. (174), e62767 (2021).</li><li>Martinez-Lopez, M., P&#243;voa, V., Fior, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+zebrafish+larval+xenografts+and+tumor+behavior+analysis.">Generation of zebrafish larval xenografts and tumor behavior analysis.</a> J Vis Exp. (172), e62373 (2021).</li><li>Ren, J., Liu, S., Cui, C., Ten Dijke, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Invasive+behavior+of+human+breast+cancer+cells+in+embryonic+zebrafish.">Invasive behavior of human breast cancer cells in embryonic zebrafish.</a> J Vis Exp. (122), e55459 (2017).</li><li>Zhao, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+xenograft+model+in+zebrafish+for+high-resolution+investigating+dynamics+of+neovascularization+in+tumors.">A novel xenograft model in zebrafish for high-resolution investigating dynamics of neovascularization in tumors.</a> PloS One. 6 (7), e21768 (2011).</li><li>Cabezas-S&#225;inz, P., Pensado-L&#243;pez, A., S&#225;inz Jr, B., S&#225;nchez, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+cancer+using+zebrafish+xenografts:+drawbacks+for+mimicking+the+human+microenvironment.">Modeling cancer using zebrafish xenografts: drawbacks for mimicking the human microenvironment.</a> Cells. 9 (9), 1978 (2020).</li><li>Haraoka, Y., Akieda, Y., Ishitani, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live-imaging+analyses+using+small+fish+models+reveal+new+mechanisms+that+regulate+primary+tumorigenesis.">Live-imaging analyses using small fish models reveal new mechanisms that regulate primary tumorigenesis.</a> Yakugaku Zasshi. 139 (5), 733-741 (2019).</li><li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Zebrafish Book. A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Danio rerio). , (2000).</li><li>Rao, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inactivation+of+ribosomal+protein+L22+promotes+transformation+by+induction+of+the+stemness+factor,+Lin28B.">Inactivation of ribosomal protein L22 promotes transformation by induction of the stemness factor, Lin28B.</a> Blood. 120 (18), 3764-3773 (2012).</li><li>Goel, M. K., Khanna, P., Kishore, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+survival+analysis:+Kaplan-Meier+estimate.">Understanding survival analysis: Kaplan-Meier estimate.</a> Int J Ayurveda Res. 1 (4), 274-278 (2010).</li><li>Usai, A., Di Franco, G., Gabellini, C., Morelli, L., Raffa, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+zebrafish+patient-derived+xenografts+from+pancreatic+cancer+for+chemosensitivity+testing.">Establishment of zebrafish patient-derived xenografts from pancreatic cancer for chemosensitivity testing.</a> J Vis Exp. (195), e63744 (2023).</li><li>Murali Shankar, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preclinical+assessment+of+CAR-NK+cell-mediated+killing+efficacy+and+pharmacokinetics+in+a+rapid+zebrafish+xenograft+model+of+metastatic+breast+cancer.">Preclinical assessment of CAR-NK cell-mediated killing efficacy and pharmacokinetics in a rapid zebrafish xenograft model of metastatic breast cancer.</a> Front Immunol. 14, 1254821 (2023).</li><li>Takahi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xenograft+of+human+pluripotent+stem+cell-derived+cardiac+lineage+cells+on+zebrafish+embryo+heart.">Xenograft of human pluripotent stem cell-derived cardiac lineage cells on zebrafish embryo heart.</a> Biochem Biophys Res Commun. 674, 190-198 (2023).</li><li>Rudner, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shared+acquired+genomic+changes+in+zebrafish+and+human+T-ALL.">Shared acquired genomic changes in zebrafish and human T-ALL.</a> Oncogene. 30 (41), 4289-4296 (2011).</li><li>Regan, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+sequencing+of+long-term+label-retaining+colon+cancer+stem+cells+identifies+novel+regulators+of+quiescence.">RNA sequencing of long-term label-retaining colon cancer stem cells identifies novel regulators of quiescence.</a> iScience. 24 (6), 102618 (2021).</li></ol>

제브라피시 이종 이식은 마우스 연구에 대한 빠르고 강력하며 비용 효율적인 대안으로 부상했습니다12. 제브라피시 이종 이식에 대한 몇 가지 접근 방식이 보고되었지만, 우리의 적응은 상당한 개선을 가져왔습니다. 절차와 관련된 매개변수를 표준화하는 것 외에도 이러한 개선은 특히 종양 주입을 수행할 수 있는 속도를 가속화하는 데 중점을 두어 연구 그룹당 동물 수를 늘리?...

생체 내에서 유전자 변형 또는 약물 치료에 반응하는 종양의 거동 분석은 암 연구의 필수 요소입니다 1,2,3,4. 이러한 연구는 대부분 면역력이 저하된 마우스(Mus musculus) 모델5의 사용을 포함한다. 그러나 마우스에 대한 이종 이식 연구는 제한된 용량, 연장된 기간, 상당한 비용 및 내부 종양의 진행을 모니터링하기 위한 정교한 이미징 장비의 요구 사항을 포함하여 여러 측면에서 제한적입니다 6,7. 이와는 대조적으로, 제브라피시 모델(Danio rerio)은 더 큰 용량, 더 짧은 기간, 더 낮은 비용, 그리고 투명성으로 인해 질병 진행에 대한 간단한 모니터링을 가능하게 한다 8,9.
제브라피쉬는 자궁 외에서 발달하고 번식력이 높은 잘 발달된 척추동물 모델 시스템으로, 개별 암컷은 100개 이상의 배아를 생산한다10. 또한 제브라피시 배아는 투명하여 리포터와 같은 형광 관련 기술을 사용하여 발달 과정을 쉽게 시각화할 수 있습니다. 마지막으로, 중요한 발달 과정의 보존은 이식된 악성 세포의 행동을 포함한 많은 유형의 연구에 이상적인 모델이 됩니다11,12. 야생형 제브라피시 배아는 멜라닌 세포를 발달시켜 생후 2주가 되면 광학적으로 불투명하게 만들지만, 이는 캐스퍼 배아의 생성에 의해 극복되었습니다(RoyA9; MITFAW2), 평생 동안 투명하게 유지됩니다13. 그들의 광학적 특성 때문에, 캐스퍼 제브라피쉬는 이식된 종양 세포의 이상적인 수용체이다 14,15,16. 종양 세포를 제브라피쉬에 이종이식하는 것은 지난 2년 동안 중요성을 얻었습니다 17,18,19,20,21. 제브라피시 배아는 선천성 면역을 가지고 있습니다. 그러나 유충 단계에서는 적응 면역이 부족하여 기능적으로 면역력이 저하되어 이식된 종양 이종이식의 효과적인 숙주 역할을 할 수 있습니다22.
제브라피시 배아뿐만 아니라 성체의 종양 생착을 위한 프로토콜이 개발되었으며, 여러 가지 다른 변수를 고려했습니다 23,24,25,26,27. 이들은 제브라피쉬의 수많은 종양 침착 부위를 조사했으며, 여기에는 난황, 유리관 주위 공간 및 심장에 주입하는 것과 다양한 발달 단계가 포함된다16,28. 제브라피시 이종이식의 경우 제브라피시 사육은 일반적으로 28°C에서 이루어지는 반면 포유류 세포는 37°C에서 성장하기 때문에 양식의 주변 온도도 중요합니다. 결과적으로, 어류가 견딜 수 있으면서도 종양 성장을 지원하는 절충 온도를 사용해야 하며, 34°C는 두 가지 목표를 모두 달성하는 것으로 보인다29. 이종 이식 후 종양의 행동 및 진행을 분석하는 것은 또 다른 주요 초점 영역이며, 여기에는 생존 분석뿐만 아니라 다양한 이미징 양식의 사용이 포함됩니다30. 제브라피시 모델의 주요 장점 중 하나는 종양 행동에 대한 생체 내 연구에 엄청난 통계적 힘을 제공하기 위해 많은 수의 연구 동물을 사용할 수 있다는 것입니다. 그러나 이전 접근 방식은 주입을 위한 지루한 장착 절차가 필요하기 때문에 이러한 잠재력을 심각하게 제한했습니다.
여기에서는 투명한 캐스퍼 제브라피시 라인을 사용하여 높은 처리량과 주입 품질을 모니터링할 수 있는 간단하고 빠른 배아 선별 방법의 개발을 통해 이러한 한계를 해결합니다. 이것은 수정 후 2일(dpf)에 캐스퍼 제브라피시 배아의 난황낭에 이종이식편을 주입하는 것을 수반합니다. 우리는 종양 행동 분석의 일환으로 이종 이식 후 배아의 생존을 관찰합니다. 또한 이종 이식 후 단일 세포 현탁액을 만들고 유세포 분석법으로 분석하여 질병 부담을 평가하는 방법을 보여줍니다(그림 1).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1-phenyl 2-thiourea (PTU)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7629</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 micron cell strainer</td>
			<td>Corning&#160;</td>
			<td>CLS431751-50EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>90 mm Petri dish</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>S43565</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Apex bioresearch</td>
			<td>20-102GP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC APC anti-mouse CD45.2 Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>109814</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSymphony A5 Cell Analyzer</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>BD FACSymphony A5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>calibration capillaries</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>P1424-1PAK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell tracker CM-dil dye</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C7001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collageanse IV</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17104019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont forceps number 55</td>
			<td>Fine science tools</td>
			<td>11255-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Corning&#160;</td>
			<td>35-015-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>model SMZ1500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass capillaries (Borosilicate)</td>
			<td>World precision instruments</td>
			<td>1B100-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>Corning&#160;</td>
			<td>21-023-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Helix NP Blue</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>425305</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Instant Ocean Sea Salt</td>
			<td>Instant ocean</td>
			<td>SS15-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>model SMZ1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methylene blue</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M9140-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microloader (long tips for laoding cells)</td>
			<td>eppendorf</td>
			<td>930001007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P1000 micropipette puller</td>
			<td>Sutter instruments</td>
			<td>model P-97</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PM 1000 cell microinjector</td>
			<td>MicroData Instruments, Inc. (MDI)</td>
			<td>PM1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricaine methanesulphate (Ethyl 3- aminobenzoate methanesulphate)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E10521-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.5%), no phenol red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15400054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zebrafish adult irradiated diet (dry feed)</td>
			<td>Zeigler</td>
			<td>388763</td>
			<td></td>
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a simple, rapid, and effective method for tumor xenotransplantation analysis in transparent zebrafish embryos

종양 행동에 대한 생체 내 연구는 암 연구의 필수 요소입니다. 그러나 마우스의 사용은 비용과 시간면에서 상당한 문제를 야기합니다. 여기에서는 애벌레 제브라피시를 쥐 모델에 비해 취급 용이성, 저렴한 비용, 짧은 실험 기간 등 많은 장점이 있는 이식 모델로 제시합니다. 더욱이, 유충 단계에서 적응 면역 체계가 없기 때문에 면역 결핍 균주를 생성하고 사용할 필요가 없습니다. 제브라피시 배아에서 이종 이식을 위한 확립된 프로토콜이 존재하지만, 여기서는 더 빠른 전달을 위한 배아 병기 결정, 생존 분석 및 질병 부담을 평가하기 위한 유세포 분석의 사용과 관련된 개선된 방법을 제시합니다. 배아는 유충의 난황에 빠른 세포 주입을 용이하게 하고 주입된 세포 볼루스의 일관성을 모니터링하기 위해 세포 마킹을 촉진하기 위해 병기를 결정합니다. 주입 후, 배아 생존 분석은 주입 후 최대 7일(dpi)까지 평가됩니다. 마지막으로, 형광 단백질로 전달된 세포를 마킹하고 유세포 분석으로 분석하여 질병 부담을 평가합니다. 유세포 분석은 제브라피시 배아에서 세포 현탁액을 준비하는 표준화된 방법을 통해 가능하며, 이는 제브라피시 세포의 1차 배양을 확립하는 데에도 사용될 수 있습니다. 요약하면, 여기에 설명된 절차를 사용하면 연구 군당 더 많은 수의 동물을 대상으로 생체 내 종양 세포의 거동을 보다 신속하게 평가할 수 있으며 보다 비용 효율적인 방식으로 수행할 수 있습니다.

Analysis of the behavior of tumors in response to genetic alteration or drug treatment in vivo is an essential element of cancer research1,2,3,4. Such studies most often involve the use of immunocompromised mouse (Mus musculus) models5; however, xenotransplantation studies in mice are limited in many respects, including limited capacity, extended duration, significant expense, and the requirement for sophisticated imaging equipment to monitor the progression of internal tumors6,7. By contrast, the zebrafish model (Danio rerio) enables greater capacity, shorter duration, lower expense, and, due to their transparency, simple monitoring of disease progression8,9.
Zebrafish is a well-developed vertebrate model system with ex-utero development and high fecundity, with individual females producing more than 100 embryos10. Moreover, zebrafish embryos are transparent, enabling easy visualization of developmental processes using fluorescence-related techniques such as reporters. Finally, the conservation of critical developmental processes makes them an ideal model for many types of studies, including the behavior of transplanted malignant cells11,12. Wild-type zebrafish embryos develop melanocytes, which render them optically opaque by 2 weeks of age, but this has been overcome by the generation of casper embryos (roya9; mitfaw2), which remain transparent throughout life13. Because of their optical properties, casper zebrafish are ideal recipients of transplanted tumor cells14,15,16. Xenotransplantation of tumor cells into zebrafish has gained importance in the past 2 decades17,18,19,20,21. Zebrafish embryos have innate immunity; however, they lack adaptive immunity during their larval stage, rendering them functionally immunocompromised, which enables them to serve as effective hosts for transplanted tumor xenografts22.
Protocols have been developed for tumor engraftment in zebrafish embryos as well as adults that have considered a number of different variables23,24,25,26,27. These have explored numerous sites of tumor deposition in zebrafish, including injections in yolk, peri-vitelline space, and heart and at different developmental stages16,28. The ambient temperature of aquaculture for zebrafish xenografts is also important as zebrafish rearing typically occurs at 28 &#176;C, while mammalian cells grow at 37 &#176;C. Consequently, a compromise temperature must be employed that is tolerated by the fish yet supports tumor growth, and 34 &#176;C appears to achieve both goals29. Analysis of the behavior and progression of tumors following xenotransplantation is another major area of focus, and this involves the use of a variety of imaging modalities as well as survival analysis30. One of the major advantages of the zebrafish model is the availability of large numbers of study animals to provide immense statistical power to in vivo studies of tumor behavior; however, previous approaches have severely limited this potential because of the requirement of tedious mounting procedures for injections.
Here, we address this limitation through the development of a simple, rapid method with which to stage embryos that enables high throughput and monitoring of injection quality using the transparent casper zebrafish line. This entails the injection of xenografts into the yolk sac of the casper zebrafish embryos at 2 days post fertilization (dpf). We observe the survival of embryos following xenotransplantation as part of tumor behavior analysis. We further show the assessment of disease burden after xenotransplantation by making single cell suspensions and analyzing by flow cytometry (Figure 1).

Author Spotlight: Advancing Cancer Therapeutics Using Tumor Xenotransplantation in Zebrafish

투명 제브라피시 배아에서 종양 이종 이식 분석을 위한 간단하고 빠르며 효과적인 방법

이종장기이식 그림 1에는 배아 생산부터 유세포 분석을 통한 생존 및 질병 부담 분석을 통한 질병 진행 평가에 이르기까지 전체 실험 및 분석에 대한 포괄적인 관점이 나와 있습니다. 이 접근법은 이종 이식의 재현성과 확장성을 향상시킬 뿐만 아니라 질병 부담을 평가하는 새로운 방법을 추가하는 몇 가지 개선 사항을 제공합니다. 이러한 실험의 성공 여부는...

우리는 간단하고 빠른 병기 결정 방법으로 최적화된 투명한 제브라피시 배아의 난황에 이종 이식을 위한 프로토콜을 설명합니다. 주입 후 분석에는 생존 및 유세포 분석을 통한 이종 이식 세포의 질병 부담 평가가 포함됩니다.

In vivo studies of tumor behavior are a staple of cancer research; however, the use of mice presents significant challenges in cost and time. Here, we ...

우리는 정상 및 악성 조혈의 조절에 대한 분자적 통찰력을 얻은 다음 이러한 통찰력을 활용하여 혈액암 치료를 위한 새로운 치료법을 개발하고자 합니다. 종양 이종이식은 유전자 변형 또는 치료가 종양 행동에 미치는 영향을 평가하는 데 없어서는 안 될 도구입니다. 그러나 생쥐 이종이식은 비용이 많이 들고 시간이 많이 걸리며 범위가 제한적입니다.종양 이종 이식에 제브라피시를 사용하면 이러한 모든 단점을 극복할 수 있습니다. 이 프로토콜에서는 처리량을 증가시키는 이종 이식을 위한 쉽고 빠른 장착 프로세스를 보여줍니다. 또한 세포 염색을 사용하여 접종물의 품질을 파악한 다음 유세포 분석을 사용하여 질병 부담을 평가하거나 정량화하여 종양 진행을 평가합니다.우리는 이 접근법을 사용하여 대다수의 인간 암을 유발하는 Ras/MAP 키나아제 캐스케이드의 기능을 차단하는 새로운 방법을 식별하고자 합니다. 그리고 우리는 Ras/MAP kinase cascade의 촉매 활성을 차단하는 것이 아니라 오히려 그것이 변형시키는 암을 유발하는 기질을 인산화하는 능력을 방지함으로써 그렇게 할 것입니다.