Los autores agradecen a la Dra. Karine Loulier por el acceso a la línea de ratones transgénicos MAGIC-Markers. Los autores también agradecen a la instalación central de animales RAM-Neuro y a la instalación de imágenes MRI, miembro de la infraestructura nacional France-BioImaging apoyada por la Agencia Nacional de Investigación de Francia (ANR-10-INBS-04, "Inversiones para el futuro"). Esta investigación contó con el apoyo del programa ATIP-Avenir, el Inserm, la Región de Occitania, la Universidad de Montpellier, la Agencia Nacional de Investigación de Francia (ANR-21-CE17-0061), la Fondation pour la Recherche Médicale (FRM Regenerative Medicine, REP202110014140) y la Fundación Groupama.

Todos los experimentos fueron aprobados por la Junta Nacional de Experimentos con Animales.
1. Preparativos
<ol><li>Prepare una solución anestésica de ketamina-xilacina para la anestesia. Inyectar ketamina a 80 mg/kg y xilacina a 10 mg/kg diluyendo 200 μL de ketamina (100 mg/mL) y 125 μL de xilacina (20 mg/mL) en 2.175 mL de NaCl estéril al 0,9%.</li>
	<li>Preparar 0,02 mg/ml de solución de buprenorfina como solución analgésica añadiendo 100 μl de buprenorfina 0,3 mg/ml a 1.400 ml de NaCl estéril al 0,9%.</li>
	<li>Prepare la solución de tinción fluorescente.<ol><li>Utilice una báscula fina para pesar 10 mg de sal de fluoresceína y dilúyala en 10 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS) para obtener una solución de fluoresceína al 0,1%.</li>
		<li>Proteja la solución de la luz y agítela durante 5 min. Utilice una jeringa de 10 ml y un filtro de jeringa de 0,2 μm para filtrar la solución. NOTA: La solución fluorescente debe protegerse de la luz y puede almacenarse a +4 °C durante 5 días.</li>
	</ol></li>
	<li>Preparación del ratón<ol><li>Pesar al ratón e inducir la anestesia realizando una inyección intraperitoneal de 10 μL/g de peso del ratón (MW) de la solución anestésica. Cuando el ratón deje de moverse, colóquelo sobre una placa calefactada (37 °C) y verifique que esté completamente anestesiado pellizcando los dedos de los pies.</li>
		<li>Aplicar una gota de lágrima artificial en el ojo sometido a la cirugía y una gota de gel ocular en el ojo contralateral.</li>
		<li>Una vez que el ratón no responda al pellizco, inyecte la analgesia (0,02 mg/ml de buprenorfina) a 5 μl/g de MW para proporcionar 0,1 mg/kg de buprenorfina por vía subcutánea en el cuello.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Abrasión de la córnea
<ol><li>Siga el paso 1.3 para preparar la solución de tinción fluorescente.</li>
	<li>Siga el paso 1.4 para preparar el mouse.</li>
	<li>Antes de realizar la abrasión, sumerja la rebaba ocular en EtOH al 70% y luego en PBS para limpiarla.</li>
	<li>Coloque el ratón en una placa calefactada (37 °C) en el lateral para acceder fácilmente al ojo sometido a la cirugía.<ol><li>Use un hisopo de algodón para absorber la lágrima artificial y cepille las pestañas sin tocar el ojo.</li>
		<li>Encienda la fresa ocular, abra el párpado del ratón con dos dedos y, al mismo tiempo, bloquee las vibrisas para evitar que se atasquen en la fresa.</li>
	</ol></li>
	<li>Localiza la pupila o el centro del ojo y aplica la rebaba ocular en la superficie del ojo, y haz movimientos circulares. Al mirar de cerca, se puede observar la superficie del epitelio eliminado. De lo contrario, realice aproximadamente 20 movimientos circulares sobre la córnea.</li>
	<li>Vuelva a colocar al ratón boca abajo y compruebe si el gel ocular sigue presente en el ojo contralateral.</li>
	<li>Aplique una gota de solución de tinción fluorescente sobre el ojo desgastado y espere 20 s. Absorber la gota con un pañuelo de papel sin tocar el ojo y enjuagarla con una gota de lágrima artificial. Absorbe la gota de la lágrima artificial con un pañuelo de papel e ilumina el ojo con la lámpara azul cobalto. NOTA: La abrasión tiene que tener una forma circular. Se requiere cierto entrenamiento para obtenerlo.</li>
	<li>Aplique una gota de gel ocular en el ojo desgastado y deje que el ratón se despierte en la almohadilla térmica. Cuando el ratón se mueva por sí solo, vuelve a colocarlo en su jaula.</li>
	<li>Comprobar el bienestar del animal durante los 2 días siguientes.</li>
	<li>Después del uso de la fresa ocular, use un tejido blando para eliminar las células epiteliales adheridas en la cabeza de la fresa y sumérjala en EtOH al 70% y luego PBS. NOTA: Una vez que se hayan eliminado las células epiteliales con el tejido blando, asegúrese de que no queden trozos de tejido atascados en la cabeza de la fresa.</li>
</ol>3. Axotomía de los nervios corneales
<ol><li>Siga el paso 1.4 para preparar el mouse.</li>
	<li>Coloque el ratón debajo de una lupa binocular en el costado para acceder al ojo que se va a someter a la cirugía. Coloque la parte inferior de una placa de Petri debajo de la cabeza del ratón para que el ojo quede horizontal. NOTA: Los siguientes pasos se realizarán mirando a través de la lupa binocular.</li>
	<li>Retire la lágrima artificial con un bastoncillo de algodón y retire las pestañas sin tocar el ojo.</li>
	<li>Coloque alicates curvos suaves debajo del ojo del animal para sacarlo de la órbita. Asegúrese de cerrar los alicates lo suficiente para que el ojo no pueda volver a la órbita una vez que se aplica presión, pero no excesivamente para evitar daños en el nervio óptico.</li>
	<li>Aplicar el punzón de biopsia de 2,5 mm verticalmente sobre el ojo sin presión para asegurar el contacto total del punzón con la superficie de la córnea. NOTA: Una vez que se aplica el punzón contra la córnea, la mano del experimentador puede interferir con el campo de visión.</li>
	<li>Luego, comience a aplicar presión y gire el punzón varias veces. NOTA: Dependiendo de la presión, el número de giros puede variar, pero generalmente es de alrededor de 5. Requiere entrenamiento para sentir la presión y el movimiento adecuados. Si se aplica demasiada presión, el ojo se rompe. En este caso, se puede observar que el líquido sale de la lesión y el ojo se ablanda. El animal tiene que ser sacrificado.</li>
	<li>Retire el punzón de biopsia. Debe haber un círculo visible en la córnea donde se aplicó la punción de biopsia. NOTA: Los siguientes pasos no requieren la lupa binocular.</li>
	<li>Compruebe si el ojo contralateral todavía tiene gel ocular y aplique un poco sobre el ojo axotomizado.</li>
	<li>Deje que el ratón se despierte en una almohadilla térmica (37 °C) y vuelva a colocarlo en su jaula cuando se mueva por sí solo.</li>
	<li>Comprobar el bienestar del animal durante los 2 días siguientes.</li>
</ol>4. Procesamiento de montaje completo de la córnea
<ol><li>Recogida y fijación de muestras.<ol><li>Pesar al ratón e inducir la anestesia realizando una inyección intraperitoneal de 10 μL/g de peso del ratón (MW) de la solución anestésica.</li>
		<li>Cuando el ratón deje de moverse y no tenga reflejos al pellizcarse los dedos de los pies, realice una luxación cervical.</li>
		<li>Saca el ojo de la órbita con dos dedos y enuclea el ojo cortando el nervio óptico con unas tijeras curvas.</li>
		<li>Coloque el ojo en un tubo de plástico de 2 ml que contenga PBS.</li>
		<li>Fije el ojo reemplazando el PBS con paraformaldehído al 4% y colocándolo en un agitador (30 rpm) a temperatura ambiente (RT) durante 20 min.</li>
		<li>Enjuague 3 veces durante 10 minutos con PBS a RT en una coctelera (30 rpm).</li>
	</ol></li>
	<li>Disección de la córnea<ol><li>Coloque una gota de PBS en un trozo de parafilm dentro de una placa de Petri.</li>
		<li>Coloque el ojo en esta gota de PBS.</li>
		<li>Coloque la placa de Petri debajo de la lupa binocular.</li>
		<li>Disecciona la córnea con tijeras de microdisección y fórceps. Cortar por encima del cuerpo ciliar para mantener el limbo.</li>
		<li>Retire el cristalino, el cuerpo ciliar y el iris con pinzas finas.</li>
		<li>Vuelva a colocar la córnea en un tubo de plástico de 2 ml.</li>
	</ol></li>
	<li>Protocolo de inmunofluorescencia<ol><li>Incubar la córnea en 2 ml de gelatina de piel de pescado al 2,5%, suero de cabra al 5% y detergente al 0,5% en PBS durante 1 h a RT en un agitador (30 rpm).</li>
		<li>Incubar la córnea en 150 μL de una solución de gelatina de piel de pescado al 2,5%, suero de cabra al 5% y detergente al 0,1% en PBS que contenga el anticuerpo primario diluido a 1/1000 (anticuerpo anti βIII tubulina) durante la noche a 4 °C en un agitador (30 rpm).</li>
		<li>Enjuague 3 veces durante 1 h con detergente al 0,1% en PBS a RT en un agitador (30 rpm).</li>
		<li>Incubar la córnea en la misma solución que en el paso 4.3.2, que contiene el anticuerpo secundario diluido a 1/500 durante la noche a 4 °C en un agitador (30 rpm).</li>
		<li>Enjuague 3 veces durante 1 h con PBS a RT en una coctelera (30 rpm).</li>
		<li>Incubar la córnea durante 10 min con 150 μL de intercalador de ADN diluido a 1/5000 a RT en un agitador (30 rpm).</li>
		<li>Enjuague 2 veces durante 5 minutos con PBS.</li>
	</ol></li>
	<li>Montaje de la córnea<ol><li>Coloque la córnea en un portaobjetos, con el epitelio orientado hacia el portaobjetos, y use un bisturí para crear cuatro secciones sin llegar al centro. NOTA: Haz las secciones opuestas entre sí para formar una forma de flor.</li>
		<li>Coloque el endotelio de la córnea hacia el portaobjetos y retire el PBS alrededor de la córnea con un pañuelo de papel. NOTA: No retire el PBS debajo de la córnea; de lo contrario, pueden aparecer burbujas de aire. Si es así, agregue PBS a la córnea y retire la burbuja de aire. A continuación, reinicie desde el paso 4.3.2.</li>
		<li>Agregue pasta de modelo en las cuatro esquinas de un cubreobjetos rectangular. NOTA: La pasta modelo eleva el cubreobjetos ya que la córnea es un tejido grueso.</li>
		<li>Deje caer 50 μL de un medio de montaje sobre la córnea y coloque con cuidado el cubreobjetos por encima para evitar la formación de burbujas.</li>
		<li>Sella el cubreobjetos con esmalte de uñas.</li>
	</ol></li>
	<li>Imagenológico<ol><li>Coloque el portaobjetos bajo un microscopio epifluorescente.</li>
		<li>Defina el tamaño del mosaico y la profundidad de la imagen e inicie la adquisición.</li>
		<li>Aplique un programa de desenfoque y deconvolución en la imagen adquirida. NOTA: El paso 4.6.3 es una opción seleccionada en el software de adquisición (Large Volume Computational Clearing [LVCC])</li>
	</ol></li>
</ol>5. Ablación localizada con láser de los nervios corneales
<ol><li>Encienda el microscopio multifotónico vertical y el láser combinado con un oscilador óptico paramétrico. Active la platina calentada del microscopio (37 °C) y ajuste los láseres a 850 nm y 1100 nm, correspondientes a las longitudes de onda requeridas para el modelo de ratón.</li>
	<li>Utilice un medidor de potencia para ajustar la potencia de los láseres simultáneamente a unos 20 mW.</li>
	<li>Siga el paso 1.4 para preparar el ratón y aplique gel ocular en ambos ojos. NOTA: El animal utilizado para este protocolo debe ser de una línea de ratón transgénico (ratón transgénico MAGIC-Marker21) que exprese un fluoróforo endógeno en las fibras nerviosas corneales.</li>
	<li>Instale el animal en un soporte para la cabeza. Gira el animal 90° para que el ojo de interés mire hacia el techo.</li>
	<li>Amarre las vibrisas del animal para despejar el área de los ojos. Amarre el cuerpo del animal para disminuir el movimiento de la cabeza inducido por la respiración.</li>
	<li>Coloque un cubreobjetos circular en el ojo por encima del gel ocular. El cubreobjetos tiene que ser horizontal. No dude en mover la cabeza del animal para que el cubreobjetos quede correctamente colocado.</li>
	<li>Agregue una gota de PBS sobre el cubreobjetos. Coloque al animal en la platina del microscopio con cuidado y coloque la torreta del objetivo a la distancia correcta.</li>
	<li>Utilice el objetivo acuoso de 20x y la epifluorescencia para localizar el ojo y la inervación a través del ocular.</li>
	<li>Activa los láseres y define la profundidad que hay que iluminar.</li>
	<li>Adquiera imágenes de 1024 x 1024 (píxeles) a una velocidad de adquisición del 70 % al 85 % de la velocidad máxima de escaneo.</li>
	<li>Una vez adquirida la imagen, se retira al animal del microscopio y se le quitan el cubreobjetos y las correas. Retire al animal del soporte para la cabeza, agregue más gel ocular si es necesario y deje que se despierte en una jaula sobre un plato caliente. NOTA: La destrucción de la inervación se puede observar 1 semana después de la toma de imágenes. Este protocolo se puede repetir una vez a la semana durante varias semanas para aumentar el daño causado por los láseres.</li>
	<li>Cuando el animal se mueva por sí solo, vuelva a colocar la jaula en el establo y verifique su bienestar durante los siguientes 2 días.</li>
</ol>

Protocolos de daño de las fibras sensoriales corneales para estudios de regeneración de axones

<ol>
	<li>Marfurt, C. F., Cox, J., Deek, S., Dvorscak, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anatomy+of+the+human+corneal+innervation.">Anatomy of the human corneal innervation.</a> Exp Eye Res. 90 (4), 478-492 (2010).</li><li>Al-Aqaba, M. A., Dhillon, V. K., Mohammed, I., Said, D. G., Dua, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Corneal+nerves+in+health+and+disease.">Corneal nerves in health and disease.</a> Prog Retin Eye Res. 73, 100762 (2019).</li><li>Dua, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurotrophic+keratopathy.">Neurotrophic keratopathy.</a> Prog Retin Eye Res. 66, 107-131 (2018).</li><li>Bonini, S., Rama, P., Olzi, D., Lambiase, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurotrophic+keratitis.">Neurotrophic keratitis.</a> Eye. 17 (8), 989-995 (2003).</li><li>Barrientez, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Corneal+Injury:+Clinical+and+molecular+aspects.">Corneal Injury: Clinical and molecular aspects.</a> Exp Eye Res. 186, 107709 (2019).</li><li>Willmann, D., Fu, L., Melanson, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Corneal+Injury.">Corneal Injury.</a> StatPearls. , (2023).</li><li>Kalha, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bmi1++progenitor+cell+dynamics+in+murine+cornea+during+homeostasis+and+wound+healing.">Bmi1+ progenitor cell dynamics in murine cornea during homeostasis and wound healing.</a> Stem Cells. 36 (4), 562-573 (2018).</li><li>Park, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potential+roles+of+nitrate+and+nitrite+in+nitric+oxide+metabolism+in+the+eye.">Potential roles of nitrate and nitrite in nitric oxide metabolism in the eye.</a> Sci Rep. 10 (1), 13166 (2020).</li><li>Ikkala, K., Stratoulias, V., Michon, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unilateral+corneal+insult+in+Zebrafish+results+in+a+bilateral+cell+shape+and+identity+modification,+supporting+wound+closure.">Unilateral corneal insult in Zebrafish results in a bilateral cell shape and identity modification, supporting wound closure.</a> bioRxiv. , (2021).</li><li>Yang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Substance+P+promotes+diabetic+corneal+epithelial+wound+healing+through+molecular+mechanisms+mediated+via+the+Neurokinin-1+receptor.">Substance P promotes diabetic corneal epithelial wound healing through molecular mechanisms mediated via the Neurokinin-1 receptor.</a> Diabetes. 63 (12), 4262-4274 (2014).</li><li>Zhao, W., He, X., Liu, R., Ruan, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accelerating+corneal+wound+healing+using+exosome-mediated+targeting+of+NF-&#954;B+c-Rel.">Accelerating corneal wound healing using exosome-mediated targeting of NF-&#954;B c-Rel.</a> Inflamm Regen. 43 (1), 6 (2023).</li><li>Downie, L. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recovery+of+the+sub-basal+nerve+plexus+and+superficial+nerve+terminals+after+corneal+epithelial+injury+in+mice.">Recovery of the sub-basal nerve plexus and superficial nerve terminals after corneal epithelial injury in mice.</a> Exp Eye Res. 171, 92-100 (2018).</li><li>He, J., Pham, T. L., Kakazu, A. H., Bazan, H. E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Remodeling+of+substance+P+sensory+nerves+and+transient+receptor+potential+melastatin+8+(TRPM8)+cold+receptors+after+corneal+experimental+surgery.">Remodeling of substance P sensory nerves and transient receptor potential melastatin 8 (TRPM8) cold receptors after corneal experimental surgery.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 60 (7), 2449-2460 (2019).</li><li>Bandeira, F., Yusoff, N. Z., Yam, G. H. -. F., Mehta, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Corneal+reinnervation+following+refractive+surgery+treatments.">Corneal reinnervation following refractive surgery treatments.</a> Neural Regen Res. 14 (4), 557-565 (2019).</li><li>Erie, J. C., McLaren, J. W., Hodge, D. O., Bourne, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recovery+of+corneal+subbasal+nerve+density+after+PRK+and+LASIK.">Recovery of corneal subbasal nerve density after PRK and LASIK.</a> Am J Ophthalmol. 140 (6), 1059-1064.e1 (2005).</li><li>Coleman, M. P., Freeman, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wallerian+degeneration,+WldS,+and+Nmnat.">Wallerian degeneration, WldS, and Nmnat.</a> Annu Rev Neurosci. 33, 245-267 (2010).</li><li>Arenas, E., Esquenazi, S., Anwar, M., Terry, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lamellar+corneal+transplantation.">Lamellar corneal transplantation.</a> Surv Ophthalmol. 57 (6), 510-529 (2012).</li><li>Niederer, R. L., Perumal, D., Sherwin, T., McGhee, C. N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Corneal+innervation+and+cellular+changes+after+corneal+transplantation:+An+in+vivo+confocal+microscopy+study.">Corneal innervation and cellular changes after corneal transplantation: An in vivo confocal microscopy study.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 48 (2), 621-626 (2007).</li><li>Icha, J., Weber, M., Waters, J. C., Norden, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phototoxicity+in+live+fluorescence+microscopy,+and+how+to+avoid+it.">Phototoxicity in live fluorescence microscopy, and how to avoid it.</a> BioEssays. 39 (8), 1700003 (2017).</li><li>Volatier, T., Schumacher, B., Cursiefen, C., Notara, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=UV+protection+in+the+cornea:+Failure+and+rescue.">UV protection in the cornea: Failure and rescue.</a> Biology. 11 (2), 278 (2022).</li><li>Loulier, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+cell+and+lineage+tracking+with+combinatorial+labels.">Multiplex cell and lineage tracking with combinatorial labels.</a> Neuron. 81 (3), 505-520 (2014).</li><li>Dana, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expert+consensus+on+the+identification,+diagnosis,+and+treatment+of+neurotrophic+keratopathy.">Expert consensus on the identification, diagnosis, and treatment of neurotrophic keratopathy.</a> BMC Ophthalmol. 21 (1), 327 (2021).</li><li>Matsumoto, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autologous+serum+application+in+the+treatment+of+neurotrophic+keratopathy.">Autologous serum application in the treatment of neurotrophic keratopathy.</a> Ophthalmology. 111 (6), 1115-1120 (2004).</li><li>Bonini, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phase+II+randomized,+double-masked,+vehicle-controlled+trial+of+recombinant+human+nerve+growth+factor+for+neurotrophic+keratitis.">Phase II randomized, double-masked, vehicle-controlled trial of recombinant human nerve growth factor for neurotrophic keratitis.</a> Ophthalmology. 125 (9), 1332-1343 (2018).</li><li>Aggarwal, S., Colon, C., Kheirkhah, A., Hamrah, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficacy+of+autologous+serum+tears+for+treatment+of+neuropathic+corneal+pain.">Efficacy of autologous serum tears for treatment of neuropathic corneal pain.</a> Ocul Surf. 17 (3), 532-539 (2019).</li><li>Singh, N. P., Said, D. G., Dua, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lamellar+keratoplasty+techniques.">Lamellar keratoplasty techniques.</a> Indian J Ophthalmol. 66 (9), 1239-1250 (2018).</li><li>Gautier, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AAV2/9-mediated+gene+transfer+into+murine+lacrimal+gland+leads+to+a+long-term+targeted+tear+film+modification.">AAV2/9-mediated gene transfer into murine lacrimal gland leads to a long-term targeted tear film modification.</a> Mol Ther Methods Clin Dev. 27, 1-16 (2022).</li></ol>

Los autores no tienen conflictos de intereses que revelar.

La queratitis neurotrófica se considera una enfermedad rara que afecta a 5 de cada 10.000 personas. Sin embargo, las personas que padecen NK debido a una lesión física como quemaduras químicas, o síndromes como la diabetes o la esclerosis múltiple no se incluyen en esas estadísticas3. Además, esta condición sigue estando significativamente infradiagnosticada22 y la prevalencia de la enfermedad está subestimada. Existe una gran necesidad de nuevos tratamientos y te...

La córnea, que es la superficie transparente del ojo, está compuesta por tres capas distintas: el epitelio, el estroma y el endotelio. Este órgano tiene la mayor densidad de inervación del cuerpo y está compuesto principalmente por fibras sensoriales (tipos Aδ y C) que se originan en la rama oftálmica del ganglio del trigémino. Las fibras sensoriales penetran en la periferia de la córnea en el estroma medio en forma de grandes haces que se ramifican para cubrir la superficie. Luego se bifurcan para perforar la membrana de Bowmann y formar el plexo subbasal, que es fácilmente reconocible por la formación de un vórtice en el centro de la córnea. Esas fibras terminan como terminaciones nerviosas libres en la superficie externa del epitelio. Son capaces de transducir estímulos térmicos, mecánicos y químicos y de liberar factores tróficos que son esenciales para la homeostasis del epitelio 1,2. La queratitis neurotrófica (NK) es una enfermedad degenerativa que afecta a la inervación sensorial corneal. Esta enfermedad rara se deriva de una disminución o pérdida de la sensibilidad corneal que se traduce en una menor producción de lágrimas y malas propiedades curativas de la córnea3. La NK progresa a través de tres estadios bien descritos, desde el estadio 1, en el que los pacientes sufren defectos epiteliales, hasta el estadio 3, en el que se produce la fusión del estroma y/o la perforación de la córnea4.
Clínicamente, los orígenes de esta enfermedad pueden ser diversos. Los pacientes pueden perder la inervación corneal después de una lesión física en el ojo, una cirugía o a través de enfermedades crónicas, como la diabetes 5,6. Hasta la fecha, el proceso de patogénesis de NK sigue siendo poco conocido, y las opciones terapéuticas para esta afección que amenaza la vista son muy limitadas. Por lo tanto, se necesita una mejor comprensión de las características de los defectos epiteliales para comprender mejor los mecanismos detrás de la regeneración de esas fibras y potencialmente promoverlos. Aquí, proponemos varios modelos de lesión corneal que inducen NK en ratones.
El primer modelo es la abrasión de la capa epitelial de la córnea con una rebaba ocular. Este modelo ha sido estudiado principalmente en el contexto de la regeneración del epitelio en diferentes animales, como roedores y peces 7,8,9, y para probar moléculas que promueven la cicatrización corneal10,11. Fisiológicamente, las células epiteliales tardan entre 2 y 3 días en cerrar la herida. El patrón fisiológico de la inervación, sin embargo, tarda más de cuatro semanas en recuperarse de la abrasión12,13. Durante la cirugía, la rebaba ocular elimina la capa epitelial de la córnea que contiene el plexo subbasal y las terminaciones nerviosas libres de las fibras. Este procedimiento se puede comparar clínicamente con pacientes con queratectomía fotorrefractiva (PRK) para corregir defectos refractivos oculares. El procedimiento consiste en extirpar el epitelio de la córnea y luego remodelar el estroma con un láser14. Los pacientes pueden experimentar varios efectos secundarios después de dicha cirugía, como una disminución de la densidad del nervio corneal durante 2 años y una reducción de la sensibilidad durante un período de 3 meses a un año después de la cirugía15. Dado que la cirugía induce una fragilidad del microambiente corneal, este modelo podría ayudar a investigar estos efectos secundarios y desarrollar enfoques terapéuticos que promuevan una reinervación más rápida, reduciendo así los efectos secundarios en cuestión.
El segundo modelo consiste en seccionar los axones en la periferia de la córnea con un punzón de biopsia, induciendo una degeneración walleriana de la inervación central 16. Clínicamente, este método podría compararse con la queratoplastia lamelar anterior, en la que el cirujano realiza una trepanación parcial de la córnea para eliminar una parte del grosor anterior de la córnea y reemplazarla con un trasplante de donante 17. Después de la queratoplastia lamelar, los pacientes pueden sufrir una serie de síntomas que incluyen ojo seco, pérdida de inervación corneal y rechazo del injerto18. Este modelo de axotomía realizado en los nervios corneales podría proporcionar información sobre los mecanismos de degeneración de las fibras, que ocurre después de un injerto, seguido de la regeneración de los axones.
El tercer método daña los nervios corneales con un láser. Mediante el uso de un microscopio multifotónico en la córnea de animales anestesiados, se induce la degeneración de los nervios localizados en el campo óptico como resultado de la formación de especies reactivas de oxígeno (ROS), lo que conduce al daño del ADN y a la cavitación celular19. Este método recapitula el fotodaño corneal inducido por la sobreexposición a los rayos UV naturales (quemaduras solares), que también desencadena la formación de ROS, lo que conduce a daños en el ADN20. Los pacientes que sufren quemaduras solares en la córnea experimentan un gran dolor, ya que el deterioro de las células epiteliales priva a las extremidades de las fibras corneales de todo.
Los tres métodos aquí descritos están diseñados para permitir la investigación del proceso de patogénesis NK y la regeneración de axones. Son fácilmente reproducibles y precisos. Además, permiten una rápida recuperación y un fácil seguimiento de los animales.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>0.2 &#181;m seringe filter</td>
			<td>CLEARLINE</td>
			<td>51733</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5 mm rust ring remover</td>
			<td>Alger Equipment Company</td>
			<td>BU-5S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL plastic tubes</td>
			<td>Eppendrof&#160;</td>
			<td>30120094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Algerbrush burr, Complete instrument</td>
			<td>Alger Equipment Company</td>
			<td>BR2-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-beta III Tubulin antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab18207</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antigenfix</td>
			<td>Diapath</td>
			<td>P0016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Artificial tear</td>
			<td>Larmes artificielles Martinet</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buprecare</td>
			<td>Animalcare</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton swab</td>
			<td>Any provider</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting tools</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescein</td>
			<td>Merck</td>
			<td>103887</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin from cold water fish skin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G7765</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat serum</td>
			<td>Merck</td>
			<td>S26</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Head Holder</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>SGM 4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heated plate</td>
			<td>BIOSEB LAB instruments</td>
			<td>BIO-HE002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>H3570</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imalgene 1000</td>
			<td>BOEHRINGER INGELHEIM ANIMAL HEALTH France</td>
			<td>N/A</td>
			<td>French marketing authorization numbre: FR/V/0167433 4/1992</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LAS X software</td>
			<td>Leica</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Large volume computational clearing (LVCC) process</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser Chameleon Ultra II</td>
			<td>Coherent</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser power meter</td>
			<td>Coherent</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica Thunder Imager Tissue microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multi-photon Zeiss LSM 7MP upright microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ocry-gel</td>
			<td>TVM lab</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parametric oscillator</td>
			<td>Coherent</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penlights with blue cobalt filtercap</td>
			<td>Bernell</td>
			<td>ALPEN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>150318</td>
			<td>Axotomy protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petridish</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>150288</td>
			<td>Cornea whole-mount processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rompun 2%</td>
			<td>Elanco</td>
			<td>N/A</td>
			<td>French marketing authorization numbre: FR/V/8146715 2/1980</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile biopsy punch 2.5 mm</td>
			<td>LCH medical</td>
			<td>LCH-PUK-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>VWR</td>
			<td>0694</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vectashield</td>
			<td>EuroBioSciences</td>
			<td>H-1000</td>
			<td>Mounting medium</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

three strategies to induce neurotrophic keratitis and nerve regeneration in murine cornea

La córnea es un tejido transparente que cubre el ojo y es crucial para una visión clara. Es el tejido más inervado del cuerpo. Esta inervación proporciona sensibilidad y función trófica al ojo y contribuye a preservar la integridad de la córnea. La alteración patológica de esta inervación se denomina queratitis neurotrófica. Esto puede desencadenarse por una lesión en el ojo, una cirugía o una enfermedad. En este estudio, proponemos tres protocolos diferentes para infligir daño a la inervación de manera que recapitulen los tres tipos de casos que generalmente se encuentran en la clínica.
El primer método consiste en realizar una abrasión del epitelio con una rebaba oftálmica. Esto implica la extirpación de la capa epitelial, las terminaciones nerviosas libres y el plexo subbasal de manera similar a la cirugía de queratectomía fotorrefractiva realizada en la clínica. El segundo método solo se dirige a la inervación seccionándola en la periferia con un punzón de biopsia, manteniendo la integridad del epitelio. Este método es similar a los primeros pasos de la queratoplastia lamelar y conduce a una degeneración de la inervación seguida de un nuevo crecimiento de los axones en la córnea central. El último método daña la inervación de un modelo de ratón transgénico utilizando un microscopio multifotónico, que localiza específicamente el sitio de cauterización de las fibras nerviosas fluorescentes. Este método inflige el mismo daño que la fotoqueratitis, una sobreexposición a la luz ultravioleta.
Este estudio describe diferentes opciones para investigar la fisiopatología de la inervación corneal, en particular la degeneración y regeneración de los axones. Promover la regeneración es crucial para evitar complicaciones como defectos epiteliales o incluso la perforación de la córnea. Los modelos propuestos pueden ayudar a probar nuevas moléculas farmacológicas o terapia génica que mejoren la regeneración nerviosa y limiten la progresión de la enfermedad.

The cornea, which is the transparent surface of the eye, is composed of three distinct layers: the epithelium, the stroma, and the endothelium. This organ has the highest density of innervation in the body and is composed mainly of sensory fibers (types A&#948; and C) originating from the ophthalmic branch of the trigeminal ganglion. Sensory fibers penetrate the periphery of the cornea in the mid-stroma in the form of big bundles that branch out to cover the surface. They then bifurcate to pierce the Bowmann&#39;s membrane and form the subbasal plexus, which is easily recognizable by the formation of a vortex in the center of the cornea. Those fibers terminate as free nerve endings at the external surface of the epithelium. They are able to transduce thermal, mechanical, and chemical stimuli and to release trophic factors that are essential for epithelium homeostasis1,2. Neurotrophic keratitis (NK) is a degenerative disease affecting the corneal sensory innervation. This rare disease stems from a decrease or a loss of corneal sensitivity that results in lower tear production and poor healing properties of the cornea3. NK progresses through three well-described stages, from stage 1 where patients suffer epithelial defects, to stage 3 where stromal melting and/or corneal perforation occur4.
Clinically, the origins of this disease can be diverse. Patients can lose corneal innervation after physical injury to the eye, surgery, or through chronic diseases, such as diabetes5,6. To date, the NK pathogenesis process remains poorly understood, and therapeutical options for this sight-threatening condition are very limited. Therefore, a better understanding of the characteristics of epithelial defects is needed to better understand the mechanisms behind the regeneration of those fibers and potentially promote them. Here, we propose several models of corneal injury that induce NK in mice.
The first model is the abrasion of the epithelial layer of the cornea with an ocular burr. This model has mainly been studied in the context of the regeneration of the epithelium in different animals, such as rodents and fish7,8,9, and to test molecules promoting corneal healing10,11. Physiologically, it takes 2-3 days for the epithelial cells to close the wound. The physiological pattern of the innervation, however, takes more than four weeks to recover from the abrasion12,13. During the surgery, the ocular burr removes the epithelial layer of the cornea that contains the subbasal plexus and the fibers&#39; free nerve endings. This procedure can be clinically compared to patients with photorefractive keratectomy (PRK) to correct eye refractive defects. The procedure consists of removing the epithelium of the cornea and then reshaping the stroma with a laser14. Patients can experience several side effects following such surgery, such as a decrease of corneal nerve density for 2 years and a reduction in sensitivity for a duration of 3 months to one year post-surgery15. Given that the surgery induces a fragility of the corneal microenvironment, this model could help investigate these side effects and develop therapeutical approaches that would promote faster reinnervation, thus reducing the side effects in question.
The second model consists of sectioning the axons at the periphery of the cornea with a biopsy punch, inducing a Wallerian degeneration of the central innervation 16. Clinically, this method could be compared to anterior lamellar keratoplasty, in which the surgeon realizes a partial trephination of the cornea to remove a part of the anterior thickness of the cornea and replace it with a donor transplant 17. Following lamellar keratoplasty, patients may suffer from a number of symptoms including dry eye, loss of corneal innervation and graft rejection18. This axotomy model performed on corneal nerves could provide insight into the mechanisms of fiber degeneration, which occurs after a graft, followed by the axons&#39; regeneration.
The third method damages the corneal nerves with a laser. By using a multiphoton microscope on the cornea of anesthetized animals, degeneration of the nerves localized in the optical field is induced as a result of reactive oxygen species (ROS) formation, which leads to DNA damage and cellular cavitation19. This method recapitulates the corneal photodamage induced by overexposure to natural UV (sunburn), which also triggers ROS formation, leading to DNA damage20. Patients who suffer from corneal sunburn experience great pain, as the deterioration of epithelial cells deprives the corneal fibers&#39; extremities of all.
The three methods described here are designed to enable the investigation of the NK pathogenesis process and axon regeneration. They are easily reproducible and precise. Moreover, they allow quick recovery and easy monitoring of the animals.

Autor destacado: Avance de la investigación de la inervación corneal a través de modelos innovadores 

Tres estrategias para inducir queratitis neurotrófica y regeneración nerviosa en la córnea murina

The cornea, which is the transparent tissue covering the eye, requires a balanced microenvironment to maintain its integrity. The dense innervation of the cornea participates to this microenvironment. If there is a loss, which could be partial or total, of this innervation, then a specific condition arises, which is called neurotrophic keratitis.To find new cures and efficient cures for this disease, we need to have specific models. The expansion of the use of transgenic animal bearing fluorescent reporters and microscopic advances have opened new possibilities in visualizing axonary generation. In vivo imagine has become more accessible to any research lab willing to follow the neurogeneration process.The various causes inducing neurotrophic keratitis underlying the difficulties of having only one model to test nerve regeneration therapies. These three models are reproducing various situations seen in clinics, and sharing those methods will allow other labs to uncover new aspects of corneal innervation from which innovative treatments will be designed.

Este estudio propone varios protocolos para infligir daño a la inervación corneal en ratones. Si bien se han utilizado protocolos similares para investigar la fisiopatología de la cicatrización del epitelio, optamos por adaptar y desarrollar nuevos métodos para investigar la regeneración de la inervación corneal. Para observar la inervación, se utilizaron dos técnicas. En primer lugar, empleamos una técnica de inmunofluorescencia para teñir las fibras nerviosas utilizando un anticuerpo panneuronal (tubulina BI...

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Aquí, proponemos tres métodos diferentes para dañar las fibras sensoriales que inervan la córnea. Estos métodos facilitan el estudio de la regeneración axonal en ratones. Estos tres métodos, adaptables a otros modelos animales, son ideales para el estudio de la fisiología de la inervación corneal y la regeneración.

The cornea is a transparent tissue that covers the eye and is crucial for clear vision. It is the most innervated tissue in the body. This innervation ...

La córnea, que es el tejido transparente que cubre el ojo, requiere un microambiente equilibrado para mantener su integridad. La densa inervación de la córnea participa de este microambiente. Si hay una pérdida, que puede ser parcial o total, de esta inervación, entonces surge una condición específica, que se llama queratitis neurotrófica.Para encontrar nuevas curas y curas eficientes para esta enfermedad, necesitamos tener modelos específicos. La expansión del uso de reporteros fluorescentes transgénicos portadores de animales y los avances microscópicos han abierto nuevas posibilidades en la visualización de la generación axonaria. La imagen in vivo se ha vuelto más accesible para cualquier laboratorio de investigación dispuesto a seguir el proceso de neurogeneración.Las diversas causas que inducen la queratitis neurotrófica subyacen a las dificultades de tener un solo modelo para probar las terapias de regeneración nerviosa. Estos tres modelos están reproduciendo diversas situaciones observadas en las clínicas, y compartir esos métodos permitirá a otros laboratorios descubrir nuevos aspectos de la inervación corneal a partir de los cuales se diseñarán tratamientos innovadores.

three-strategies-to-induce-neurotrophic-keratitis-nerve-regeneration

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Three Strategies to Induce Neurotrophic Keratitis and Nerve Regeneration in Murine Cornea

1.0K vistas.  University of  Montpellier, INSERM. La córnea, que es el tejido transparente que cubre el ojo, requiere un microambiente equilibrado para mantener su integridad. La densa inervación de la córnea participa de este microambiente. Si hay una pérdida, que puede ser parcial o total, de esta inervación, entonces surge una condición específica, que se llama queratitis neurotrófica.Para encontrar nuevas curas y curas eficientes para esta enfermedad, necesitamos tener modelos específicos. La expansión del uso de reporte...

Video: Autor destacado: Avance de la investigación de la inervación corneal a través de modelos innovadores 

The cornea is a transparent tissue that covers the eye and is crucial for clear vision. It is the most innervated tissue in the body. This innervation provides sensation and trophic function to the eye and contributes to preserving corneal integrity. The pathological disruption of this innervation is termed neurotrophic keratitis. This can be triggered by injury to the eye, surgery, or disease. In this study, we propose three different protocols for inflicting damage on the innervation in ways that recapitulate the three types of cases generally encountered in the clinic.
The first method consists in making an abrasion of the epithelium with an ophthalmic burr. This involves the removal of the epithelial layer, the free nerve endings, and the subbasal plexus in a manner similar to the photorefractive keratectomy surgery performed in the clinic. The second method&#160;only targets the innervation by sectioning it at the periphery with a biopsy punch, maintaining the integrity of the epithelium. This method is similar to the first steps of lamellar keratoplasty and leads to a degeneration of the innervation followed by regrowth of the axons in the central cornea. The last method damages the innervation of a transgenic mouse model using a multiphoton microscope, which specifically localizes the site of cauterization of the fluorescent nerve fibers. This method inflicts the same damage as photokeratitis, an overexposure to UV light.
This study describes different options for investigating the physiopathology of corneal innervation, particularly the degeneration and regeneration of the axons. Promoting regeneration is crucial for avoiding such complications as epithelium defects or even perforation of the cornea. The proposed models can help test new pharmacological molecules or gene therapy that enhance nerve regeneration and limit disease progression.

Here, we propose three different methods of damaging the sensory fibres innervating the cornea. These methods facilitate the study of axon regeneration in mice. These three methods, which are adaptable to other animal models, are ideal for the study of corneal innervation physiology and regeneration.

Investigación

Neurociencias

Murine Corneal Nerve Abrasion for the Induction of Neurotrophic Keratitis

To begin corneal abrasion, place an anesthetized mouse on a table. Apply a drop of artificial tear on the eye undergoing the surgery. Apply a drop of ocular gel on the contralateral eye.Next, position the mouse on its side on a heated plate. Gently use a cotton swab to absorb the artificial tear, and brush aside the mouse's eyelashes without making contact with the eye. Turn on the ocular burr, and carefully open the mouse's eyelid with two fingers.Simultaneously shield the vibrancy to prevent them from entangling in the burr. Locate the pupil or the eye center and gently apply the ocular burr to the eye's surface in circular motions until the epithelium is removed. Alternatively, perform about 20 circular movements on the cornea.Now apply a drop of fluorescent staining solution on the abraided eye. After 20 seconds, dab the eye with a tissue to absorb the solution. Then rinse it with a drop of artificial tear.Finally, absorb the artificial tear with a tissue, and illuminate the eye using a blue cobalt lamp. Prior to the surgery, the basal epithelium was intact and the nerve fibers in the sub basal plexus formed a vortex. The burr tip removed the outer corneal layer, leaving the stroma and endothelium intact with a visible gap at the basal epithelium and sub basal plexus.Regeneration of the epithelium occurred over a week post-surgery. However, the vortex remained absent from the corneal center.

Abrasión del nervio corneal murino para la inducción de queratitis neurotrófica

Murine Corneal Nerve Axotomy for the Induction of Neurotrophic Keratitis

To begin corneal nerve axotomy, place an anesthetized mouse on a table. Apply a drop of artificial tear on the eye undergoing the surgery. Apply a drop of ocular gel on the contralateral eye.Position the mouse under a binocular loupe to assess the eye that is being operated on. Place the bottom of a Petri dish under the mouse's head to keep the eye horizontal. With a cotton swab, carefully dad the artificial tear from the eye and remove the eyelashes without touching the eye.Place a pair of smooth curved pillars under the animal's eye and gently pop it out of the orbit. Gently place a biopsy punch vertically against the cornea surface, apply pressure, and twist the punch several times. Then, remove the biopsy punch and a circular mark should be visible on the cornea.A thin peripheral ring was seen at the point where the biopsy punch was applied, which damaged the basal epithelium. The peripheral nerves appeared to be sectioned, triggering the Wallerian axon degeneration. Heavy degeneration was observed, leading to total loss of innervation in the cornea center.This resulted in the disintegration of the epithelial layer, creating an ulcer.

Axotomía del nervio corneal murino para la inducción de queratitis neurotrófica

Localized Laser Ablation of Murine Corneal Nerves for the Induction of Neurotrophic Keratitis

To begin, place an anesthetized mouse on a table. Apply a drop of ocular gel on both eyes. Place the animal in a head holder to secure its position.Rotate the animal by 90 degrees so that the eye being operated on faces the ceiling. Secure the animal's vibrancy to clear the area around the eye. Secure the animal's body to minimize head movements caused by breathing.Place a circular cover slip horizontally over the eye on top of the ocular gel. Adjust the animal's head as necessary to correctly position the cover slip. Add a drop of PBS on top of the cover slip, then carefully place the animal onto a microscope stage.Adjust the objective turret of the microscope to the appropriate distance for observation. Activate the lasers to induce corneal nerve ablation. Once nerve ablation is complete, remove the animal from the head holder and place it in a cage on a heated plate.The vortex was visibly absent one week after laser ablation. A group of immune cells were observed to have migrated to the illumination site. The stromal fiber bundles appeared to have thinned out.