Name: В центре внимания автора: Новый анализ для изучения реакции В-клеток в исследованиях рассеянного склероза
Uploaded: 2023-12-01T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantification of Autoreactive Antibodies in Mice upon Experimental Autoimmune Encephalomyelitis at JoVE.com

Это исследование было поддержано Национальными институтами здравоохранения (R03NS131908) и Министерством обороны в рамках Программы исследований рассеянного склероза в рамках награды No W81XWH-22-1-0517. Мнения, интерпретации, выводы и рекомендации принадлежат автору и не обязательно одобрены Министерством обороны. Это исследование также было поддержано стартап-фондами Университета Восточной Каролины.

Все процедуры с участием мышей были выполнены в соответствии с экспериментальными рекомендациями, утвержденными Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию (IACUC) Университета Восточной Каролины. В этом исследовании использовались самки мышей дикого типа C57BL/6...

Исследование гуморального ответа при аутоиммунной демиелинизации

<ol>
	<li>Reich, D. S., Lucchinetti, C. F., Calabresi, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+sclerosis.">Multiple sclerosis.</a> N Engl J Med. 378 (2), 169-180 (2018).</li><li>Baranzini, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=B+cell+repertoire+diversity+and+clonal+expansion+in+multiple+sclerosis+brain+lesions.">B cell repertoire diversity and clonal expansion in multiple sclerosis brain lesions.</a> J Immunol. 163 (9), 5133-5144 (1999).</li><li>Genain, C. P., Cannella, B., Hauser, S. L., Raine, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+autoantibodies+associated+with+myelin+damage+in+multiple+sclerosis.">Identification of autoantibodies associated with myelin damage in multiple sclerosis.</a> Nat Med. 5 (2), 170-175 (1999).</li><li>Ma, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+hypomethylation+programs+underpin+b+cell+activation+in+early+multiple+sclerosis.">Specific hypomethylation programs underpin b cell activation in early multiple sclerosis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 118 (51), e2111920118 (2021).</li><li>Hauser, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ocrelizumab+versus+interferon+beta-1a+in+relapsing+multiple+sclerosis.">Ocrelizumab versus interferon beta-1a in relapsing multiple sclerosis.</a> N Engl J Med. 376 (3), 221-234 (2017).</li><li>Montalban, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ocrelizumab+versus+placebo+in+primary+progressive+multiple+sclerosis.">Ocrelizumab versus placebo in primary progressive multiple sclerosis.</a> N Engl J Med. 376 (3), 209-220 (2017).</li><li>Didonna, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preclinical+models+of+multiple+sclerosis:+Advantages+and+limitations+towards+better+therapies.">Preclinical models of multiple sclerosis: Advantages and limitations towards better therapies.</a> Curr Med Chem. 23 (14), 1442-1459 (2016).</li><li>Steinman, L., Zamvil, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+to+successfully+apply+animal+studies+in+experimental+allergic+encephalomyelitis+to+research+on+multiple+sclerosis.">How to successfully apply animal studies in experimental allergic encephalomyelitis to research on multiple sclerosis.</a> Ann Neurol. 60 (1), 12-21 (2006).</li><li>Khare, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myelin+oligodendrocyte+glycoprotein-specific+antibodies+from+multiple+sclerosis+patients+exacerbate+disease+in+a+humanized+mouse+model.">Myelin oligodendrocyte glycoprotein-specific antibodies from multiple sclerosis patients exacerbate disease in a humanized mouse model.</a> J Autoimmun. 86, 104-115 (2018).</li><li>Marta, C. B., Oliver, A. R., Sweet, R. A., Pfeiffer, S. E., Ruddle, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogenic+myelin+oligodendrocyte+glycoprotein+antibodies+recognize+glycosylated+epitopes+and+perturb+oligodendrocyte+physiology.">Pathogenic myelin oligodendrocyte glycoprotein antibodies recognize glycosylated epitopes and perturb oligodendrocyte physiology.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (39), 13992-13997 (2005).</li><li>Flach, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autoantibody-boosted+t-cell+reactivation+in+the+target+organ+triggers+manifestation+of+autoimmune+cns+disease.">Autoantibody-boosted t-cell reactivation in the target organ triggers manifestation of autoimmune cns disease.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (12), 3323-3328 (2016).</li><li>Didonna, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ataxin-1+regulates+b+cell+function+and+the+severity+of+autoimmune+experimental+encephalomyelitis.">Ataxin-1 regulates b cell function and the severity of autoimmune experimental encephalomyelitis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 117 (38), 23742-23750 (2020).</li><li>Didonna, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sex-specific+tau+methylation+patterns+and+synaptic+transcriptional+alterations+are+associated+with+neural+vulnerability+during+chronic+neuroinflammation.">Sex-specific tau methylation patterns and synaptic transcriptional alterations are associated with neural vulnerability during chronic neuroinflammation.</a> J Autoimmun. 101, 56-69 (2019).</li><li>Ma, Q., Matsunaga, A., Ho, B., Oksenberg, J. R., Didonna, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oligodendrocyte-specific+argonaute+profiling+identifies+micrornas+associated+with+experimental+autoimmune+encephalomyelitis.">Oligodendrocyte-specific argonaute profiling identifies micrornas associated with experimental autoimmune encephalomyelitis.</a> J Neuroinflammation. 17 (1), 297 (2020).</li><li>Lanz, T. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonally+expanded+b+cells+in+multiple+sclerosis+bind+ebv+ebna1+and+glialcam.">Clonally expanded b cells in multiple sclerosis bind ebv ebna1 and glialcam.</a> Nature. 603 (7900), 321-327 (2022).</li></ol>

Здесь сообщалось о простом и эффективном протоколе на основе ИФА для точной количественной оценки гуморального ответа в соответствующей животной модели патологии рассеянного склероза. Этот метод недавно был использован для описания новой роли белка атаксина-1 в контроле сывороточны?...

Рассеянный склероз (РС) — это хроническое аутоиммунное заболевание центральной нервной системы (ЦНС), характеризующееся очаговой инфильтрацией иммунных клеток в паренхиму головного мозга, разрушением миелиновых оболочек, обволакивающих аксоны, активацией глии и потерей нейронов1. В дополнение к хорошо установленной роли патогенных Т-клеток, многочисленные линии доказательств подчеркнули участие В-клеток в опосредовании аутоиммунного ответа против ЦНС. В-клетки подвергаются клональной экспансии в мозге РС, и антитела против компонентов миелина были обнаружены в демиелинизированных поражениях 2,3. Недавно была задокументирована селективная активация периферических В-клеток в начале заболевания, что предполагает предполагаемую роль этого компартмента иммунных клеток в инициации заболевания4. Успех терапии, истощающей В-клетки, такой как моноклональные антитела против CD20, еще больше подтверждает механистическую связь между аберрантным функционированием В-клеток и аутоиммунной демиелинизацией 5,6. С молекулярной точки зрения, В-клетки могут способствовать заболеванию через презентацию аутоантигена, секрецию провоспалительных цитокинов и выработку аутореактивных антител.
Было разработано несколько животных моделей, чтобы обобщить специфические особенности сложного фенотипа рассеянного склероза. Среди них экспериментальный аутоиммунный энцефаломиелит (ЭАЭ) является наиболее широко используемой парадигмой in vivo и опирается на иммунизацию экспериментальных животных короткими пептидами, полученными из белков миелина, таких как гликопротеин миелина олигодендроцитов (MOG) и основной белок миелина (MBP)7. У животных, иммунизированных EAE, развивается демиелинизирующая патология, которая во многих аспектах напоминает рассеянный склероз, включая устойчивый гуморальный ответ против энцефалитогенного пептида8. По этой причине исследования ЭАЭ сыграли важную роль в анализе функции В-клеток и аутоантител в контексте заболевания. Например, было показано, что MOG-специфические антитела, выделенные у пациентов с РС, могут усугубить клиническое течение в модели ЭАЭ9. Примечательно, что остаток пролина в положении 42 в MOG человека имеет решающее значение для определения патогенности аутоантител10. Совсем недавно было обнаружено, что MOG-специфические аутоантитела способствуют заболеванию не только за счет опосредования потери миелина, но и за счет повышения реактивации аутореактивных Т-клеток в ЦНС11. 
Учитывая важность ответов антител при аутоиммунных заболеваниях ЦНС, в данной статье представлен протокол на основе ИФА для эффективного измерения сывороточных уровней аутореактивных антител у мышей ЭАЭ C57BL/6J, иммунизированных пептидом MOG35-55. В первой части протокола будет описан метод сбора сыворотки с помощью внутрисердечной пункции. Затем будут подробно описаны процедуры настройки ИФА-анализа и получения данных. Наконец, будет обсуждаться анализ и интерпретация данных.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 mL syringes</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>309628</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL microcentrifuge tubes</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>05-408-129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 G needles</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>305122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3,3&#39;,5,5&#39;-tetramethylbenzidine (TMB) substrate</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>N301</td>
			<td>Store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adhesive seals</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>AB0558</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7906</td>
			<td>Store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6J female mice</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>000664</td>
			<td>Animals between 8-10 weeks of age should be used for EAE experiments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryogenic tubes</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>10-500-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection tray</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>S111022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissector scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14082-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ELISA coating buffer</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>421701</td>
			<td>Store at 4&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Excel software</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td></td>
			<td>Analysis spreadsheet</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11152-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Anti-Mouse IgG, Human ads-HRP</td>
			<td>SouthernBiotech</td>
			<td>1030-05</td>
			<td>Store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LED light source</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>AMPSILED21</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate reader</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>14-377-575&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Molecular biology grade water</td>
			<td>Corning</td>
			<td>46-000-Cl</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse MOG35-55 peptide</td>
			<td>EZBiolab</td>
			<td>cp7203</td>
			<td>Store at -80 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multichannel pipette</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>AP-12-200-P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Noyes spring scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15011-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc MaxiSorp 96-well plates</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>423501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital shaker</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>88-861-023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oven</td>
			<td>VWR</td>
			<td>445-0024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffer saline (PBS)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>14190144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated tabletop centrifuge</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>75002441</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stop solution</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>N600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1706531</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantification of autoreactive antibodies in mice upon experimental autoimmune encephalomyelitis

Экспериментальный аутоиммунный энцефаломиелит (ЭАЭ) — это модель заболевания, которая повторяет аутоиммунное заболевание рассеянный склероз (РС) на гистопатологическом и молекулярном уровнях. ЭАЭ индуцируется иммунизацией экспериментальных животных путем подкожной инъекции коротких пептидов миелина вместе со специфическими адъювантами для усиления иммунного ответа. Как и у человека, у мышей EAE развиваются демиелинизирующие поражения, инфильтрация иммунных клеток в центральную нервную систему (ЦНС), активация глии и повреждение нейронов. Последовательная совокупность доказательств также поддерживает механистическую роль дисфункции В-клеток в этиологии как РС, так и ЭАЭ. В-клетки могут служить антигенпрезентирующими клетками, а также основным источником провоспалительных цитокинов и аутоантител. При EAE вырабатываются антитела против пептидов миелина, которые были использованы для индуцирования заболевания. Было показано, что такие аутоантитела опосредуют либо потерю миелина, либо реактивацию патогенных Т-клеток в ЦНС. В данной статье описан эффективный протокол на основе ИФА для количественного определения аутоантител в сыворотке крови мышей C57BL/6J, иммунизированных пептидом миелина олигодендроцитарного гликопротеина 35-55 (MOG35-55). Предложенный метод служит мощным инструментом для исследования специфичности и величины аберрантного гуморального ответа в контексте аутоиммунной демиелинизации.

Multiple sclerosis (MS) is a chronic autoimmune disease of the central nervous system (CNS) characterized by focal infiltration of immune cells into the brain parenchyma, breakdown of myelin sheaths wrapping axons, glia activation, and neuronal loss1. In addition to the well-established role of pathogenic T cells, multiple lines of evidence have highlighted the involvement of B cells in mediating the autoimmune response against the CNS. B cells undergo clonal expansion in the MS brain and antibodies against myelin components have been detected within demyelinated lesions2,3. The selective activation of peripheral B cells at disease onset has been recently documented, suggesting a putative role for this immune cell compartment in disease initiation as well4. The success of B cell-depleting therapies such as anti-CD20 monoclonal antibodies further corroborates the mechanistic connection between aberrant B cell functioning and autoimmune demyelination5,6. From a molecular standpoint, B cells can contribute to disease via autoantigen presentation, pro-inflammatory cytokine secretion, and autoreactive antibody production.
Multiple animal models have been developed to recapitulate specific features of the complex MS phenotype. Among them, experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) is the most widely used in vivo paradigm and relies on the immunization of experimental animals with short peptides derived from myelin proteins such as myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG) and myelin basic protein (MBP)7. EAE immunized animals develop a demyelinating pathology that resembles MS in many aspects, including a robust humoral response against the encephalitogenic peptide8. For this reason, EAE studies have been instrumental in dissecting the function of B cells and autoantibodies in the context of disease. For instance, it was demonstrated that MOG-specific antibodies isolated from MS patients can aggravate the clinical course in EAE models9. Notably, the proline residue at position 42 in human MOG was shown to be critical for determining autoantibody pathogenicity10. More recently, MOG-specific autoantibodies have been found to promote disease not only by mediating myelin loss but also via boosting the reactivation of autoreactive T cells within the CNS11. 
Considering the importance of antibody responses in CNS autoimmunity, this article presents an ELISA-based protocol to efficiently measure the serum levels of autoreactive antibodies in C57BL/6J mice EAE immunized with MOG35-55 peptide. In the first part of the protocol, the method to collect serum via intracardiac puncture will be described. Subsequently, the procedures to set up the ELISA assay and acquire the data will be detailed. Lastly, data analysis and interpretation will be discussed.

В центре внимания автора: Новый анализ для изучения реакции В-клеток в исследованиях рассеянного склероза

Количественная оценка аутореактивных антител у мышей при экспериментальном аутоиммунном энцефаломиелите

So the focus of our laboratory is to understand the molecular basis of multiple sclerosis, a immune disease of the central nervous system that is characterized by demyelination, neuroinflammation, and axonal injury. So this protocol represent an economical and flexible alternatives to commercial kits. Our can be easily adjusted to test B-cell antibody responses against different EEA peptides.My lab is devoted to further understanding the connection between neuroinflammation and neurodegeneration in chronic neurological diseases such as multiple sclerosis.

Чтобы продемонстрировать надежность настоящего ИФА-анализа, метод был протестирован на образцах сыворотки, выделенных из когорты самок мышей C57BL/6J через 20 дней после иммунизации (dpi) со 100 мкг пептида MOG35-55 в полном адъюванте Фрейнда (CFA) в соответствии с валидированным протоколом индукци...

Watch this Scientific Journal Video about Quantification of Autoreactive Antibodies in Mice upon Experimental Autoimmune Encephalomyelitis at JoVE.com

Экспериментальный аутоиммунный энцефаломиелит (ЭАЭ) — это животная модель рассеянного склероза (РС), которая разделяет с болезнью человека устойчивый гуморальный аутоиммунный ответ. Здесь мы сообщаем о простом и гибком протоколе ИФА для количественного определения аутоантител в сыворотке мышей, иммунизированных EAE.

Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) is a disease model that recapitulates the autoimmune disorder multiple sclerosis (MS) at histopathological ...

Таким образом, цель нашей лаборатории — понять молекулярные основы рассеянного склероза, иммунного заболевания центральной нервной системы, которое характеризуется демиелинизацией, нейровоспалением и повреждением аксонов. Таким образом, этот протокол представляет собой экономичную и гибкую альтернативу коммерческим наборам. Мы можем быть легко настроены для тестирования ответов В-клеточных антител против различных пептидов ЕЭЗ.Моя лаборатория посвящена дальнейшему пониманию связи между нейровоспалением и нейродегенерацией при хронических неврологических заболеваниях, таких как рассеянный склероз.

quantification-autoreactive-antibodies-mice-upon-experimental

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Quantification of Autoreactive Antibodies in Mice upon Experimental Autoimmune Encephalomyelitis

Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) is a disease model that recapitulates the autoimmune disorder multiple sclerosis (MS) at histopathological and molecular levels. EAE is induced by immunizing experimental animals via subcutaneous injection of short myelin peptides together with specific adjuvants to boost the immune response. Like the human counterpart, EAE mice develop demyelinating lesions, immune cell infiltration into the central nervous system (CNS), glia activation and neuronal injury. A consistent body of evidence also supports a mechanistic role for B cell dysfunction in the etiology of both MS and EAE. B cells can serve as antigen-presenting cells as well as a primary source of pro-inflammatory cytokines and autoantibodies. In EAE, antibodies are generated against the myelin peptides that were employed to induce the disease. Such autoantibodies have been shown to mediate either myelin loss or pathogenic T cell reactivation into the CNS. This article describes an efficient ELISA-based protocol to quantify autoantibodies in the serum of C57BL/6J mice immunized with the myelin oligodendrocyte glycoprotein 35-55 (MOG35-55) peptide. The proposed method serves as a powerful tool to investigate the specificity and magnitude of the aberrant humoral response in the context of autoimmune demyelination.

Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) is an animal model of multiple sclerosis (MS), which shares with the human disease a robust humoral autoimmune response. Here, we report a simple and flexible ELISA protocol to quantify autoantibodies in the serum of EAE immunized mice.

Serum Collection via Intracardiac Puncture in Experimental Autoimmune Encephalomyelitis (EAE) Immunized Mice

Забор сыворотки крови методом внутрисердечной пункции у экспериментальных мышей, иммунизированных против аутоиммунного энцефаломиелита (ЭАЭ)

Quantification of Autoantibodies in the Serum of Experimental Autoimmune Encephalomyelitis Immunized Mice Using ELISA

Begin by re-suspending the lyophilized MOG 35 55 peptide in water. Dilute the peptide stock to 10 micrograms per milliliter in coating buffer before the experiment. Now pipette 100 microliters of the final solution into wells of a 96 well plate.Simultaneously coat an equal number of wells with 100 microliters of BSA dissolved in coating buffer. Seal the plate with an adhesive film to prevent evaporation and incubate the plate overnight at four degrees Celsius. The next day, perform three washes of the plate with 200 microliters of PBS supplemented with 0.5%tween 20.Subsequently add 100 microliters per well of a blocking solution composed of 3%BSA in PBS. Incubate the sealed plate for one hour at 37 degrees Celsius in a hybridization oven. After incubation, wash the plate three times with 200 microliters per well of PBST.Dilute each serum sample obtained from the blood of EAE immunized mice in blocking solution and add 100 microliters per well to both MOG 35 55 and BSA coated wells. Add the same volume of blocking solution to designated blank wells. Incubate the sealed plate for two hours at room temperature with constant shaking.After incubation, remove the plate from the incubator and rinse the plate three times with 200 microliters per well of PBST. Dilute the HRP conjugated secondary antibody in a solution consisting of 0.2%BSA in PBST and add 100 microliters to each well. Incubate the sealed plate for one hour at room temperature maintaining constant shaking.Wash the plate three times with 200 microliters per well of PBST. Add 100 microliters of three, three prime, five, five prime tetramethyl benzidine substrate to each well. Incubate in the dark for one to five minutes monitoring the development of a blue color.Add 100 microliters of stop solution to each well. Then use a plate reader set at a wavelength of 450 nanometers to measure the optical density in each well. The optical density values of the EAE samples were significantly higher than the control samples indicating a robust immunoglobulin G response against the MOG peptide.