Name: Auteur in de schijnwerpers: Verbetering van de kolonisatie van rhizobacteriën op plantenwortels voor een verbeterde efficiëntie van microbiële meststoffen
Uploaded: 2024-03-01T14:10:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Author Spotlight: Enhancing Rhizobacteria Colonization on Plant Roots for Improved Microbial Fertilizer Efficiency at JoVE.com

Dit werk werd gefinancierd door de National Natural Science Foundation of China (32370135), het innovatieprogramma van de Chinese Academie voor Landbouwwetenschappen (CAAS-CSAL-202302), het Science and Technology Project van het Jiangsu Vocational College of Agriculture and Forestry (2021kj29).

1. Steriele hydrocultuur van A. thaliana
<ol><li>Bereid A. thaliana zaailingen voor.<ol><li>Bereid cultuur A. thaliana zaailingen medium voor, dat bestaat uit 1/2 MS medium (Murashige en Skoog) met 2% (wt/vol) sucrose en 0,9% (wt/vol) agar.</li>
		<li>Giet het bereide sterilisatiemedium in steriele vierkante petrischaaltjes (13 cm x 13 cm) voordat u stolt. Vermijd drogen aan de lucht om de luchtvochtigheid op peil te houden.</li>
		<li>Dompel A. thaliana<...

Detectie van rhizobacteriële kolonisatie op Arabidopsis thaliana

<ol>
	<li>Wang, B., Wan, C., Zeng, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colonization+on+cotton+plants+with+a+GFP+labeled+strain+of+Bacillus+axarquiensis.">Colonization on cotton plants with a GFP labeled strain of Bacillus axarquiensis.</a> Curr Microbiol. 77 (10), 3085-3094 (2020).</li><li>Zhai, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetic+tool+for+production+of+GFP-expressing+Rhodopseudomonaspalustris+for+visualization+of+bacterial+colonization.">A genetic tool for production of GFP-expressing Rhodopseudomonaspalustris for visualization of bacterial colonization.</a> AMB Express. 9 (1), 141 (2019).</li><li>Synek, L., Rawat, A., L'Haridon, F., Weisskopf, L., Saad, M. M., Hirt, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+strategies+of+plant+colonization+by+beneficial+endophytic+Enterobacter+sp.+SA187.">Multiple strategies of plant colonization by beneficial endophytic Enterobacter sp. SA187.</a> Environ Microbiol. 23 (10), 6223-6240 (2021).</li><li>Zhang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacillus+velezensis+tolerance+to+the+induced+oxidative+stress+in+root+colonization+contributed+by+the+two-component+regulatory+system+sensor+ResE.">Bacillus velezensis tolerance to the induced oxidative stress in root colonization contributed by the two-component regulatory system sensor ResE.</a> Plant Cell Environ. 44 (9), 3094-3102 (2021).</li><li>Liu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant+commensal+type+VII+secretion+system+causes+iron+leakage+from+roots+to+promote+colonization.">Plant commensal type VII secretion system causes iron leakage from roots to promote colonization.</a> Nat Microbiol. 8 (8), 1434-1449 (2023).</li><li>Feng, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+chemotaxis+compounds+in+root+exudates+and+their+sensing+chemoreceptors+in+plant-growth-promoting+Rhizobacteria+Bacillus+amyloliquefaciens+SQR9.">Identification of chemotaxis compounds in root exudates and their sensing chemoreceptors in plant-growth-promoting Rhizobacteria Bacillus amyloliquefaciens SQR9.</a> Mol Plant Microbe Interact. 31, 995-1005 (2018).</li><li>Woo, S. L., Hermosa, R., Lorito, M., Monte, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trichoderma:+a+multipurpose,+plant-beneficial+microorganism+for+eco-sustainable+agriculture.">Trichoderma: a multipurpose, plant-beneficial microorganism for eco-sustainable agriculture.</a> Nat Rev Microbiol. 21 (5), 312-326 (2023).</li><li>Nongkhlaw, F. M., Joshi, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microscopic+study+on+colonization+and+antimicrobial+property+of+endophytic+bacteria+associated+with+ethnomedicinal+plants+of+Meghalaya.">Microscopic study on colonization and antimicrobial property of endophytic bacteria associated with ethnomedicinal plants of Meghalaya.</a> J Microsc Ultrastruct. 5 (3), 132-139 (2017).</li><li>Ravelo-Ortega, G., Raya-Gonz&#225;lez, J., L&#243;pez-Bucio, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compounds+from+rhizosphere+microbes+that+promote+plant+growth.">Compounds from rhizosphere microbes that promote plant growth.</a> Curr Opin Plant Biol. 73, 1369-5266 (2023).</li><li>Schulz-Bohm, K., Gerards, S., Hundscheid, M., Melenhorst, J., de Boer, W., Garbeva, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calling+from+distance:+attraction+of+soil+bacteria+by+plant+root+volatiles.">Calling from distance: attraction of soil bacteria by plant root volatiles.</a> ISME J. 12 (5), 1252-1262 (2018).</li><li>Sharifi, R., Lee, S. M., Ryu, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbe-induced+plant+volatiles.">Microbe-induced plant volatiles.</a> New Phytol. 220 (3), 684-691 (2018).</li><li>Eckshtain-Levi, N., Harris, S. L., Roscios, R. Q., Shank, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+community+members+increase+Bacillus+subtilis+maintenance+on+the+roots+of+Arabidopsis+thaliana.">Bacterial community members increase Bacillus subtilis maintenance on the roots of Arabidopsis thaliana.</a> Phytobiomes J. 4, 303-313 (2020).</li><li>Liu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Root+colonization+by+beneficial+rhizobacteria.">Root colonization by beneficial rhizobacteria.</a> FEMS Microbiol Rev. 48, (2024).</li><li>Yahya, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+root+exudation+and+architecture+for+improved+growth+of+wheat+mediated+by+phosphate+solubilizing+bacteria.">Differential root exudation and architecture for improved growth of wheat mediated by phosphate solubilizing bacteria.</a> Front Microbiol. 12, 744094 (2021).</li><li>Husna, K. B. -. E., Won, M. -. H., Jeong, M. -. I., Oh, K. -. K., Park, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+and+genomic+insight+of+surfactin-producing+Bacillus+velezensis+and+its+biocontrol+potential+against+pathogenic+contamination+in+lettuce+hydroponics.">Characterization and genomic insight of surfactin-producing Bacillus velezensis and its biocontrol potential against pathogenic contamination in lettuce hydroponics.</a> Environ Sci Pollut Res Int. 30 (58), 121487-121500 (2023).</li></ol>

Om een goede reproduceerbaarheid te bereiken, zijn er vier cruciale stappen voor het kolonisatiedetectieproces van dit protocol. Ten eerste is het noodzakelijk om ervoor te zorgen dat het aantal geïnoculeerde bacteriecellen in elk experiment precies hetzelfde is. Ten tweede is het ook noodzakelijk om de reinigingsintensiteit van de niet-gekoloniseerde bacteriën met steriel water te beheersen. Ten derde moet elk monsterverdunningsproces worden gewerveld voordat het wordt uitgevoerd om het monster in een volledige mengto...

Er zijn kwantitatieve en kwalitatieve methoden voor het detecteren van kolonisatie van de rhizosfeer door een enkele bacteriestam. Voor de kwalitatieve methode moet een rek worden gebruikt die constitutief fluorescentie tot expressie brengt, en de fluorescentieverdeling en -intensiteit moeten worden onderzocht met behulp van fluorescentiemicroscopie of confocale laserinstrumenten 1,2. Die strategieën kunnen bacteriële kolonisatie in situ3 heel goed weerspiegelen, maar ze zijn niet zo nauwkeurig als traditionele methoden voor het tellen van platen in kwantificering. Bovendien kan het, vanwege de beperking van het weergeven van slechts gedeeltelijke wortelzones onder de microscoop, soms worden beïnvloed door subjectieve vooringenomenheid.
Hier beschrijven we een kwantitatieve methode, waaronder het verzamelen van de gekoloniseerde bacteriecellen en het tellen van de bacteriële CFU's op een plaat. Deze methode is gebaseerd op verdunning en plating waarbij de gekoloniseerde stammen die van plantenwortels zijn gestript, kunnen worden geteld en het totale aantal gekoloniseerde bacteriën op de wortel kan worden berekend op 4,5.
Eerst werd A. thaliana gekweekt in hydrocultuuromstandigheden en vervolgens werden bacteriële cellen geïnoculeerd in de rhizosfeer met een eindconcentratie van 0,01 OD600. De geïnfecteerde wortelweefsels werden 2 dagen na inoculatie geoogst en in steriel water gewassen om de niet-gekoloniseerde bacteriële cellen te verwijderen. Verder werden bacteriële cellen die op de wortel waren gekoloniseerd, verzameld, verdund in fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) en geplateerd op een Luria-Bertani (LB) agar-medium. Na incubatie bij 37 °C gedurende 10 uur werden enkele kolonies op LB-platen geteld en genormaliseerd om de bacteriecellen te bepalen die op de wortels waren gekoloniseerd.
Deze methode is zeer toepasbaar, heeft een goede herhaalbaarheid en is meer geschikt voor nauwkeurige bepaling van bacteriële kolonisatie in de rhizosfeer.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>6-well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter cell stainer</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>F8200-40&#181;m</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate reader&#160;</td>
			<td>Tecan</td>
			<td>Infinite M200 PRO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Murashige and Skoog medium</td>
			<td>Hopebio</td>
			<td>HB8469-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaClO</td>
			<td>Alfa</td>
			<td>L14709</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phytagel</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8169</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Square petri dish</td>
			<td>Ruiai Zhengte</td>
			<td>PYM-130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex Genie2</td>
			<td>Scientific Industries</td>
			<td>G560E</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measuring bacterial colonization on arabidopsis thaliana roots in hydroponic condition

Het meten van bacteriële kolonisatie op de wortel van Arabidopsis thaliana is een van de meest voorkomende experimenten in onderzoeken naar plant-microbe-interacties. Een gestandaardiseerde methode voor het meten van bacteriële kolonisatie in de rhizosfeer is nodig om de reproduceerbaarheid te verbeteren. We kweekten eerst steriele A. thaliana in hydrocultuuromstandigheden en inoculeerden vervolgens de bacteriële cellen in de rhizosfeer met een eindconcentratie van OD600 van 0,01. 2 dagen na inoculatie werd het wortelweefsel geoogst en drie keer gewassen in steriel water om de niet-gekoloniseerde bacteriecellen te verwijderen. De wortels werden vervolgens gewogen en de bacteriële cellen die op de wortel waren gekoloniseerd, werden verzameld door een draaikolk. De celsuspensie werd verdund in een gradiënt met een fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS), gevolgd door plating op een Luria-Bertani (LB) agarmedium. De platen werden gedurende 10 uur bij 37 °C geïncubeerd, en vervolgens werden de enkele kolonies op LB-platen geteld en genormaliseerd om de bacteriële cellen aan te geven die op de wortels waren gekoloniseerd. Deze methode wordt gebruikt om bacteriële kolonisatie in de rhizosfeer te detecteren in mono-interactieomstandigheden, met een goede reproduceerbaarheid.

There are quantitative and qualitative methods for detecting rhizosphere colonization by a single bacterial strain. For the qualitative method, a strain that constitutively expresses fluorescence should be used, and the fluorescence distribution and intensity should be examined under fluorescence microscopy or laser confocal instruments1,2. Those strategies can well reflect bacterial colonization in situ3, but they are not as accurate as traditional plate counting methods in quantification. Besides, due to the limitation of only displaying partial root zones under the microscope, sometimes it can be influenced by subjective bias. 
Here, we describe a quantitative method, which includes collecting the colonized bacterial cells and counting the bacterial CFUs on a plate. This method is based on dilution and plating by which the colonized strains that were stripped from plant roots can be counted, and the total colonized bacteria number on the root can be calculated4,5. 
First, A. thaliana was cultured in hydroponic conditions, and then bacterial cells were inoculated in the rhizosphere at a final concentration of 0.01 OD600. The infected root tissues were harvested 2 days post-inoculation and washed in sterile water to remove the uncolonized bacterial cells. Further, bacterial cells colonized on the root were collected, diluted in phosphate-buffered saline (PBS) buffer, and plated onto a Luria-Bertani (LB) agar medium. After incubation at 37 &#176;C for 10 h, single colonies on LB plates were counted and normalized to determine the bacterial cells colonized on roots.
This method is highly applicable, has good repeatability, and is more suitable for accurate rhizosphere bacterial colonization determination.

Auteur in de schijnwerpers: Verbetering van de kolonisatie van rhizobacteriën op plantenwortels voor een verbeterde efficiëntie van microbiële meststoffen

Bacteriële kolonisatie meten op wortels van Arabidopsis thaliana in hydrocultuur

Our research focuses on the interaction of beneficial rhizobacteria with plant roots. We are looking for the key mechanisms to enhance the colonization of beneficial bacteria, thus improving the efficiency and the stability of microbial fertilizers in the field. The methods for bacterial colonization of plant roots have been extensively studied, but there are still problems.For example, it's hard to measure the colonization on different sites distinctively, In the future we think applying microscope and high throughput counting will help to solve the problems. Our protocol is highly applicable with good repeatability, and it is more suitable for accurate rhizosphere bacteria colonization determination.

Om de nauwkeurigheid van het kolonisatievermogen van bacteriën te testen dat met deze methode in de A. thaliana rhizosfeer wordt gedetecteerd, hebben we Bacillus velezensis SQR9 WT en een afgeleide mutant Δ8mcp afzonderlijk in de rhizosfeer van A. thaliana geïnoculeerd. De Δ8mcp is een mutant die alle chemoreceptorcoderende genen mist en heeft een aanzienlijk verminderde kolonisatie6. We hebben hun kolonisatie 2 dagen na inoculatie gemeten met behul...

Watch this Scientific Journal Video about Author Spotlight: Enhancing Rhizobacteria Colonization on Plant Roots for Improved Microbial Fertilizer Efficiency at JoVE.com

Kolonisatie van plantengroeibevorderende rhizobacteriën (PGPR) in de rhizosfeer is essentieel voor de groeibevorderende werking. Het is noodzakelijk om de detectiemethode van bacteriële rhizosfeerkolonisatie te standaardiseren. Hier beschrijven we een reproduceerbare methode voor het kwantificeren van bacteriële kolonisatie op het worteloppervlak.

Measuring bacterial colonization on Arabidopsis thaliana root is one of the most frequent experiments in plant-microbe interaction studies. A standardized ...

Ons onderzoek richt zich op de interactie van nuttige rhizobacteriën met plantenwortels. We zijn op zoek naar de belangrijkste mechanismen om de kolonisatie van nuttige bacteriën te verbeteren, waardoor de efficiëntie en de stabiliteit van microbiële meststoffen in het veld worden verbeterd. De methoden voor bacteriële kolonisatie van plantenwortels zijn uitgebreid bestudeerd, maar er zijn nog steeds problemen.Het is bijvoorbeeld moeilijk om de kolonisatie op verschillende locaties onderscheidend te meten, In de toekomst denken we dat het toepassen van een microscoop en hoge doorvoertelling zal helpen om de problemen op te lossen. Ons protocol is zeer toepasbaar met een goede herhaalbaarheid, en het is meer geschikt voor nauwkeurige bepaling van de kolonisatie van rhizosfeerbacteriën.

measuring-bacterial-colonization-on-arabidopsis-thaliana-roots

Research

JoVE Journal

Environment

Measuring Bacterial Colonization on Arabidopsis thaliana Roots in Hydroponic Condition

Measuring bacterial colonization on Arabidopsis thaliana root is one of the most frequent experiments in plant-microbe interaction studies. A standardized method for measuring bacterial colonization in the rhizosphere is necessary to improve reproducibility. We first cultured sterile A.thaliana in hydroponic conditions and then inoculated the bacterial cells in the rhizosphere at a final concentration of OD600 of 0.01. At 2 days post-inoculation, the root tissue was harvested and washed three times in sterile water to remove the uncolonized bacterial cells. The roots were then weighed, and the bacterial cells colonized on the root were collected by vortex. The cell suspension was diluted in a gradient with a phosphate-buffered saline (PBS) buffer, followed by plating onto a Luria-Bertani (LB) agar medium. The plates were incubated at 37 &#176;C for 10 h, and then, the single colonies on LB plates were counted and normalized to indicate the bacterial cells colonized on roots. This method is used to detect bacterial colonization in the rhizosphere in mono-interaction conditions, with good reproducibility.

Colonization of plant growth-promoting rhizobacteria (PGPR) in the rhizosphere is essential for its growth-promoting effect. It is necessary to standardize the method of detection of bacterial rhizosphere colonization. Here, we describe a reproducible method for quantifying bacterial colonization on the root surface.