Name: מחבר זרקור: שיפור התיישבות הריזובקטריה על שורשי צמחים לשיפור יעילות הדשן המיקרוביאלי
Uploaded: 2024-03-01T14:10:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Author Spotlight: Enhancing Rhizobacteria Colonization on Plant Roots for Improved Microbial Fertilizer Efficiency at JoVE.com

עבודה זו מומנה על ידי הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (32370135), תוכנית החדשנות של האקדמיה הסינית למדעי החקלאות (CAAS-CSAL-202302), פרויקט המדע והטכנולוגיה של המכללה המקצועית ג'יאנגסו לחקלאות וייעור (2021kj29).

1. הידרופוני סטרילי א. גידול תאליאנה
<ol><li>הכינו שתילי A. thaliana .<ol><li>הכינו תרבית שתילי A. thaliana בינוני, המורכב מ 1/2 MS בינוני (Murashige ו Skoog) עם 2% (wt / vol) סוכרוז ו 0.9% (wt / vol) אגר.</li>
		<li>יוצקים את אמצעי העיקור המוכן לכלי פטרי מרובעים סטריליים (13X13 ס"מ) לפני המיצוק. יש להימנע מ?...

זיהוי נשאות ריזובקטריאלית על Arabidopsis thaliana

<ol>
	<li>Wang, B., Wan, C., Zeng, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colonization+on+cotton+plants+with+a+GFP+labeled+strain+of+Bacillus+axarquiensis.">Colonization on cotton plants with a GFP labeled strain of Bacillus axarquiensis.</a> Curr Microbiol. 77 (10), 3085-3094 (2020).</li><li>Zhai, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetic+tool+for+production+of+GFP-expressing+Rhodopseudomonaspalustris+for+visualization+of+bacterial+colonization.">A genetic tool for production of GFP-expressing Rhodopseudomonaspalustris for visualization of bacterial colonization.</a> AMB Express. 9 (1), 141 (2019).</li><li>Synek, L., Rawat, A., L'Haridon, F., Weisskopf, L., Saad, M. M., Hirt, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+strategies+of+plant+colonization+by+beneficial+endophytic+Enterobacter+sp.+SA187.">Multiple strategies of plant colonization by beneficial endophytic Enterobacter sp. SA187.</a> Environ Microbiol. 23 (10), 6223-6240 (2021).</li><li>Zhang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacillus+velezensis+tolerance+to+the+induced+oxidative+stress+in+root+colonization+contributed+by+the+two-component+regulatory+system+sensor+ResE.">Bacillus velezensis tolerance to the induced oxidative stress in root colonization contributed by the two-component regulatory system sensor ResE.</a> Plant Cell Environ. 44 (9), 3094-3102 (2021).</li><li>Liu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant+commensal+type+VII+secretion+system+causes+iron+leakage+from+roots+to+promote+colonization.">Plant commensal type VII secretion system causes iron leakage from roots to promote colonization.</a> Nat Microbiol. 8 (8), 1434-1449 (2023).</li><li>Feng, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+chemotaxis+compounds+in+root+exudates+and+their+sensing+chemoreceptors+in+plant-growth-promoting+Rhizobacteria+Bacillus+amyloliquefaciens+SQR9.">Identification of chemotaxis compounds in root exudates and their sensing chemoreceptors in plant-growth-promoting Rhizobacteria Bacillus amyloliquefaciens SQR9.</a> Mol Plant Microbe Interact. 31, 995-1005 (2018).</li><li>Woo, S. L., Hermosa, R., Lorito, M., Monte, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trichoderma:+a+multipurpose,+plant-beneficial+microorganism+for+eco-sustainable+agriculture.">Trichoderma: a multipurpose, plant-beneficial microorganism for eco-sustainable agriculture.</a> Nat Rev Microbiol. 21 (5), 312-326 (2023).</li><li>Nongkhlaw, F. M., Joshi, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microscopic+study+on+colonization+and+antimicrobial+property+of+endophytic+bacteria+associated+with+ethnomedicinal+plants+of+Meghalaya.">Microscopic study on colonization and antimicrobial property of endophytic bacteria associated with ethnomedicinal plants of Meghalaya.</a> J Microsc Ultrastruct. 5 (3), 132-139 (2017).</li><li>Ravelo-Ortega, G., Raya-Gonz&#225;lez, J., L&#243;pez-Bucio, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compounds+from+rhizosphere+microbes+that+promote+plant+growth.">Compounds from rhizosphere microbes that promote plant growth.</a> Curr Opin Plant Biol. 73, 1369-5266 (2023).</li><li>Schulz-Bohm, K., Gerards, S., Hundscheid, M., Melenhorst, J., de Boer, W., Garbeva, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calling+from+distance:+attraction+of+soil+bacteria+by+plant+root+volatiles.">Calling from distance: attraction of soil bacteria by plant root volatiles.</a> ISME J. 12 (5), 1252-1262 (2018).</li><li>Sharifi, R., Lee, S. M., Ryu, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbe-induced+plant+volatiles.">Microbe-induced plant volatiles.</a> New Phytol. 220 (3), 684-691 (2018).</li><li>Eckshtain-Levi, N., Harris, S. L., Roscios, R. Q., Shank, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+community+members+increase+Bacillus+subtilis+maintenance+on+the+roots+of+Arabidopsis+thaliana.">Bacterial community members increase Bacillus subtilis maintenance on the roots of Arabidopsis thaliana.</a> Phytobiomes J. 4, 303-313 (2020).</li><li>Liu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Root+colonization+by+beneficial+rhizobacteria.">Root colonization by beneficial rhizobacteria.</a> FEMS Microbiol Rev. 48, (2024).</li><li>Yahya, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+root+exudation+and+architecture+for+improved+growth+of+wheat+mediated+by+phosphate+solubilizing+bacteria.">Differential root exudation and architecture for improved growth of wheat mediated by phosphate solubilizing bacteria.</a> Front Microbiol. 12, 744094 (2021).</li><li>Husna, K. B. -. E., Won, M. -. H., Jeong, M. -. I., Oh, K. -. K., Park, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+and+genomic+insight+of+surfactin-producing+Bacillus+velezensis+and+its+biocontrol+potential+against+pathogenic+contamination+in+lettuce+hydroponics.">Characterization and genomic insight of surfactin-producing Bacillus velezensis and its biocontrol potential against pathogenic contamination in lettuce hydroponics.</a> Environ Sci Pollut Res Int. 30 (58), 121487-121500 (2023).</li></ol>

כדי להשיג יכולת שחזור טובה, ישנם ארבעה שלבים קריטיים לתהליך זיהוי הקולוניזציה של פרוטוקול זה. ראשית, יש לוודא שמספר תאי החיידקים המחוסנים זהה לחלוטין בכל ניסוי. שנית, יש צורך גם בשליטה על עוצמת ניקוי החיידקים הבלתי מיושבים באמצעות מים סטריליים. שלישית, כל תהליך דילול דגימה צריך להיות מערבו...

קיימות שיטות כמותיות ואיכותיות לאיתור התיישבות ריזוספרה על ידי זן חיידק יחיד. בשיטה האיכותית יש להשתמש בזן המבטא פלואורסצנטיות באופן מכונן ולבחון את התפלגות הפלואורסצנטיות ועוצמתה תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי או מכשירי לייזר קונפוקליים 1,2. אסטרטגיות אלה יכולות בהחלט לשקף התיישבות חיידקים באתרו3, אך הן אינן מדויקות כמו שיטות ספירת לוחות מסורתיות בכימות. חוץ מזה, בגלל המגבלה של הצגת אזורי שורש חלקיים בלבד מתחת למיקרוסקופ, לפעמים זה יכול להיות מושפע מהטיה סובייקטיבית.
במאמר זה אנו מתארים שיטה כמותית, הכוללת איסוף תאי החיידק המאוכלסים וספירת ה-CFUs החיידקיים על צלחת. שיטה זו מבוססת על דילול וציפוי שבאמצעותם ניתן לספור את הזנים המושבלים שהופשטו משורשי הצמח, ולחשב את מספר החיידקים המיושבים הכולל על השורש 4,5.
ראשית, A. thaliana תורבית בתנאים הידרופוניים, ולאחר מכן תאי חיידקים חוסנו בריזוספרה בריכוז סופי של 0.01 OD600. רקמות השורש הנגועות נקצרו יומיים לאחר החיסון ונשטפו במים סטריליים כדי להסיר את תאי החיידקים הלא מיושבים. יתר על כן, תאי חיידקים שהתיישבו על השורש נאספו, נמהלו במאגר מלח חוצץ פוספט (PBS), וצופו על מדיום אגר לוריא-ברטאני (LB). לאחר הדגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס במשך 10 שעות, נספרו ונורמלו מושבות בודדות על לוחות LB כדי לקבוע את תאי החיידקים המאוכלסים על השורשים.
שיטה זו ישימה מאוד, בעלת יכולת חזרה טובה, והיא מתאימה יותר לקביעת התיישבות חיידקית מדויקת בריזוספרה.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>6-well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter cell stainer</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>F8200-40&#181;m</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate reader&#160;</td>
			<td>Tecan</td>
			<td>Infinite M200 PRO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Murashige and Skoog medium</td>
			<td>Hopebio</td>
			<td>HB8469-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaClO</td>
			<td>Alfa</td>
			<td>L14709</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phytagel</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8169</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Square petri dish</td>
			<td>Ruiai Zhengte</td>
			<td>PYM-130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex Genie2</td>
			<td>Scientific Industries</td>
			<td>G560E</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measuring bacterial colonization on arabidopsis thaliana roots in hydroponic condition

מדידת התיישבות חיידקים על שורש Arabidopsis thaliana היא אחד הניסויים השכיחים ביותר במחקרי אינטראקציה בין צמחים למיקרובים. שיטה סטנדרטית למדידת התיישבות חיידקים בריזוספרה נחוצה כדי לשפר את יכולת הרבייה. תחילה תרבינו A.thaliana סטרילית בתנאים הידרופוניים ולאחר מכן חיסנו את תאי החיידק בריזוספרה בריכוז סופי של OD600 של 0.01. יומיים לאחר החיסון, רקמת השורש נקטפה ונשטפה שלוש פעמים במים סטריליים כדי להסיר את תאי החיידקים הלא מיושבים. לאחר מכן נשקלו השורשים, ותאי החיידק שהתיישבו על השורש נאספו על ידי מערבולת. מתלה התא דולל בשיפוע עם חיץ מלח חוצץ פוספט (PBS), ואחריו ציפוי על תווך אגר לוריא-ברטאני (LB). הצלחות הודגרו בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס במשך 10 שעות, ולאחר מכן, המושבות הבודדות על לוחות LB נספרו ונורמלו כדי לציין את תאי החיידקים שהתיישבו על שורשים. שיטה זו משמשת לזיהוי התיישבות חיידקים בריזוספרה בתנאי מונו-אינטראקציה, עם יכולת שחזור טובה.

There are quantitative and qualitative methods for detecting rhizosphere colonization by a single bacterial strain. For the qualitative method, a strain that constitutively expresses fluorescence should be used, and the fluorescence distribution and intensity should be examined under fluorescence microscopy or laser confocal instruments1,2. Those strategies can well reflect bacterial colonization in situ3, but they are not as accurate as traditional plate counting methods in quantification. Besides, due to the limitation of only displaying partial root zones under the microscope, sometimes it can be influenced by subjective bias. 
Here, we describe a quantitative method, which includes collecting the colonized bacterial cells and counting the bacterial CFUs on a plate. This method is based on dilution and plating by which the colonized strains that were stripped from plant roots can be counted, and the total colonized bacteria number on the root can be calculated4,5. 
First, A. thaliana was cultured in hydroponic conditions, and then bacterial cells were inoculated in the rhizosphere at a final concentration of 0.01 OD600. The infected root tissues were harvested 2 days post-inoculation and washed in sterile water to remove the uncolonized bacterial cells. Further, bacterial cells colonized on the root were collected, diluted in phosphate-buffered saline (PBS) buffer, and plated onto a Luria-Bertani (LB) agar medium. After incubation at 37 &#176;C for 10 h, single colonies on LB plates were counted and normalized to determine the bacterial cells colonized on roots.
This method is highly applicable, has good repeatability, and is more suitable for accurate rhizosphere bacterial colonization determination.

מחבר זרקור: שיפור התיישבות הריזובקטריה על שורשי צמחים לשיפור יעילות הדשן המיקרוביאלי

מדידת התיישבות חיידקים על שורשי Arabidopsis thaliana במצב הידרופוני

Our research focuses on the interaction of beneficial rhizobacteria with plant roots. We are looking for the key mechanisms to enhance the colonization of beneficial bacteria, thus improving the efficiency and the stability of microbial fertilizers in the field. The methods for bacterial colonization of plant roots have been extensively studied, but there are still problems.For example, it's hard to measure the colonization on different sites distinctively, In the future we think applying microscope and high throughput counting will help to solve the problems. Our protocol is highly applicable with good repeatability, and it is more suitable for accurate rhizosphere bacteria colonization determination.

כדי לבדוק את הדיוק של יכולת התיישבות החיידקים שזוהתה בשיטה זו בריזוספרה A. thaliana חיסנו את Bacillus velezensis SQR9 WT ומוטציה נגזרת Δ8mcp לתוך A . thaliana rhizosphere בנפרד. Δ8mcp היא מוטציה שחסרה את כל הגנים המקודדים לכימורצפטור, ויש לה ירידה משמעותית בנשאות6. מדדנו את הנשאות שלה...

Watch this Scientific Journal Video about Author Spotlight: Enhancing Rhizobacteria Colonization on Plant Roots for Improved Microbial Fertilizer Efficiency at JoVE.com

התיישבות של ריזובקטריה מעודדת גדילה של צמחים (PGPR) בריזוספרה חיונית להשפעתו מעודדת הצמיחה. יש צורך לתקנן את שיטת הזיהוי של התיישבות ריזוספרה חיידקית. במאמר זה אנו מתארים שיטה הניתנת לשחזור לכימות התיישבות חיידקים על פני השטח של השורש.

Measuring bacterial colonization on Arabidopsis thaliana root is one of the most frequent experiments in plant-microbe interaction studies. A standardized ...

המחקר שלנו מתמקד באינטראקציה של ריזובקטריה מועילה עם שורשי צמחים. אנו מחפשים את מנגנוני המפתח כדי לשפר את ההתיישבות של חיידקים מועילים, ובכך לשפר את היעילות והיציבות של דשנים מיקרוביאליים בשטח. השיטות להתיישבות חיידקים בשורשי צמחים נחקרו בהרחבה, אך עדיין קיימות בעיות.לדוגמה, קשה למדוד את ההתיישבות באתרים שונים באופן מובהק, בעתיד אנו חושבים שיישום מיקרוסקופ וספירת תפוקות גבוהה יעזרו לפתור את הבעיות. הפרוטוקול שלנו ישים מאוד עם יכולת חזרה טובה, והוא מתאים יותר לקביעת התיישבות מדויקת של חיידקי ריזוספרה.

measuring-bacterial-colonization-on-arabidopsis-thaliana-roots

Research

JoVE Journal

Environment

Measuring Bacterial Colonization on Arabidopsis thaliana Roots in Hydroponic Condition

Measuring bacterial colonization on Arabidopsis thaliana root is one of the most frequent experiments in plant-microbe interaction studies. A standardized method for measuring bacterial colonization in the rhizosphere is necessary to improve reproducibility. We first cultured sterile A.thaliana in hydroponic conditions and then inoculated the bacterial cells in the rhizosphere at a final concentration of OD600 of 0.01. At 2 days post-inoculation, the root tissue was harvested and washed three times in sterile water to remove the uncolonized bacterial cells. The roots were then weighed, and the bacterial cells colonized on the root were collected by vortex. The cell suspension was diluted in a gradient with a phosphate-buffered saline (PBS) buffer, followed by plating onto a Luria-Bertani (LB) agar medium. The plates were incubated at 37 &#176;C for 10 h, and then, the single colonies on LB plates were counted and normalized to indicate the bacterial cells colonized on roots. This method is used to detect bacterial colonization in the rhizosphere in mono-interaction conditions, with good reproducibility.

Colonization of plant growth-promoting rhizobacteria (PGPR) in the rhizosphere is essential for its growth-promoting effect. It is necessary to standardize the method of detection of bacterial rhizosphere colonization. Here, we describe a reproducible method for quantifying bacterial colonization on the root surface.