Name: Forfatter Spotlight: Forbedring av rhizobakteriekolonisering på planterøtter for forbedret mikrobiell gjødseleffektivitet
Uploaded: 2024-03-01T14:10:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Author Spotlight: Enhancing Rhizobacteria Colonization on Plant Roots for Improved Microbial Fertilizer Efficiency at JoVE.com

Dette arbeidet ble finansiert av National Natural Science Foundation of China (32370135), innovasjonsprogrammet til Chinese Academy of Agricultural Sciences (CAAS-CSAL-202302), Science and Technology Project of Jiangsu Vocational College of Agriculture and Forestry (2021kj29).

1. Steril hydroponisk A. thaliana dyrking
<ol><li>Forbered A. thaliana frøplanter.<ol><li>Forbered kultur A. thaliana frøplanter medium, som består av 1/2 MS medium (Murashige og Skoog) med 2% (wt / vol) sukrose og 0,9% (wt / vol) agar.</li>
		<li>Hell det tilberedte steriliseringsmediet i sterile firkantede petriskåler (13 cm x 13 cm) før størkning. Unngå lufttørking for å opprettholde fuktighet.</li>
		<li>Dypp A. thalianafrø i et 2 ml mi...

Rhizobakteriell koloniseringsdeteksjon på Arabidopsis thaliana

<ol>
	<li>Wang, B., Wan, C., Zeng, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colonization+on+cotton+plants+with+a+GFP+labeled+strain+of+Bacillus+axarquiensis.">Colonization on cotton plants with a GFP labeled strain of Bacillus axarquiensis.</a> Curr Microbiol. 77 (10), 3085-3094 (2020).</li><li>Zhai, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetic+tool+for+production+of+GFP-expressing+Rhodopseudomonaspalustris+for+visualization+of+bacterial+colonization.">A genetic tool for production of GFP-expressing Rhodopseudomonaspalustris for visualization of bacterial colonization.</a> AMB Express. 9 (1), 141 (2019).</li><li>Synek, L., Rawat, A., L'Haridon, F., Weisskopf, L., Saad, M. M., Hirt, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+strategies+of+plant+colonization+by+beneficial+endophytic+Enterobacter+sp.+SA187.">Multiple strategies of plant colonization by beneficial endophytic Enterobacter sp. SA187.</a> Environ Microbiol. 23 (10), 6223-6240 (2021).</li><li>Zhang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacillus+velezensis+tolerance+to+the+induced+oxidative+stress+in+root+colonization+contributed+by+the+two-component+regulatory+system+sensor+ResE.">Bacillus velezensis tolerance to the induced oxidative stress in root colonization contributed by the two-component regulatory system sensor ResE.</a> Plant Cell Environ. 44 (9), 3094-3102 (2021).</li><li>Liu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant+commensal+type+VII+secretion+system+causes+iron+leakage+from+roots+to+promote+colonization.">Plant commensal type VII secretion system causes iron leakage from roots to promote colonization.</a> Nat Microbiol. 8 (8), 1434-1449 (2023).</li><li>Feng, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+chemotaxis+compounds+in+root+exudates+and+their+sensing+chemoreceptors+in+plant-growth-promoting+Rhizobacteria+Bacillus+amyloliquefaciens+SQR9.">Identification of chemotaxis compounds in root exudates and their sensing chemoreceptors in plant-growth-promoting Rhizobacteria Bacillus amyloliquefaciens SQR9.</a> Mol Plant Microbe Interact. 31, 995-1005 (2018).</li><li>Woo, S. L., Hermosa, R., Lorito, M., Monte, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trichoderma:+a+multipurpose,+plant-beneficial+microorganism+for+eco-sustainable+agriculture.">Trichoderma: a multipurpose, plant-beneficial microorganism for eco-sustainable agriculture.</a> Nat Rev Microbiol. 21 (5), 312-326 (2023).</li><li>Nongkhlaw, F. M., Joshi, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microscopic+study+on+colonization+and+antimicrobial+property+of+endophytic+bacteria+associated+with+ethnomedicinal+plants+of+Meghalaya.">Microscopic study on colonization and antimicrobial property of endophytic bacteria associated with ethnomedicinal plants of Meghalaya.</a> J Microsc Ultrastruct. 5 (3), 132-139 (2017).</li><li>Ravelo-Ortega, G., Raya-Gonz&#225;lez, J., L&#243;pez-Bucio, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compounds+from+rhizosphere+microbes+that+promote+plant+growth.">Compounds from rhizosphere microbes that promote plant growth.</a> Curr Opin Plant Biol. 73, 1369-5266 (2023).</li><li>Schulz-Bohm, K., Gerards, S., Hundscheid, M., Melenhorst, J., de Boer, W., Garbeva, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calling+from+distance:+attraction+of+soil+bacteria+by+plant+root+volatiles.">Calling from distance: attraction of soil bacteria by plant root volatiles.</a> ISME J. 12 (5), 1252-1262 (2018).</li><li>Sharifi, R., Lee, S. M., Ryu, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbe-induced+plant+volatiles.">Microbe-induced plant volatiles.</a> New Phytol. 220 (3), 684-691 (2018).</li><li>Eckshtain-Levi, N., Harris, S. L., Roscios, R. Q., Shank, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+community+members+increase+Bacillus+subtilis+maintenance+on+the+roots+of+Arabidopsis+thaliana.">Bacterial community members increase Bacillus subtilis maintenance on the roots of Arabidopsis thaliana.</a> Phytobiomes J. 4, 303-313 (2020).</li><li>Liu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Root+colonization+by+beneficial+rhizobacteria.">Root colonization by beneficial rhizobacteria.</a> FEMS Microbiol Rev. 48, (2024).</li><li>Yahya, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+root+exudation+and+architecture+for+improved+growth+of+wheat+mediated+by+phosphate+solubilizing+bacteria.">Differential root exudation and architecture for improved growth of wheat mediated by phosphate solubilizing bacteria.</a> Front Microbiol. 12, 744094 (2021).</li><li>Husna, K. B. -. E., Won, M. -. H., Jeong, M. -. I., Oh, K. -. K., Park, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+and+genomic+insight+of+surfactin-producing+Bacillus+velezensis+and+its+biocontrol+potential+against+pathogenic+contamination+in+lettuce+hydroponics.">Characterization and genomic insight of surfactin-producing Bacillus velezensis and its biocontrol potential against pathogenic contamination in lettuce hydroponics.</a> Environ Sci Pollut Res Int. 30 (58), 121487-121500 (2023).</li></ol>

For å oppnå god reproduserbarhet er det fire kritiske trinn for koloniseringsdeteksjonsprosessen til denne protokollen. For det første er det nødvendig å sikre at antall inokulerte bakterieceller er nøyaktig det samme i hvert eksperiment. For det andre er det også nødvendig å kontrollere den ukoloniserte bakterierengjøringsintensiteten med sterilt vann. For det tredje må hver prøvefortynningsprosess virves før den utføres for å la prøven være i fullstendig blandingstilstand for å unngå absorpsjonsfeil ...

Det finnes kvantitative og kvalitative metoder for å oppdage rhizosfærekolonisering av en enkelt bakteriestamme. For den kvalitative metoden bør en stamme som konstitutivt uttrykker fluorescens brukes, og fluorescensfordelingen og intensiteten bør undersøkes under fluorescensmikroskopi eller laserkonfokalinstrumenter 1,2. Disse strategiene kan godt reflektere bakteriell kolonisering in situ3, men de er ikke like nøyaktige som tradisjonelle platetellingsmetoder i kvantifisering. Dessuten, på grunn av begrensningen av bare å vise delvise rotsoner under mikroskopet, kan det noen ganger påvirkes av subjektiv skjevhet.
Her beskriver vi en kvantitativ metode, som inkluderer å samle de koloniserte bakteriecellene og telle bakterielle CFUer på en tallerken. Denne metoden er basert på fortynning og plating der de koloniserte stammene som ble fjernet fra planterøtter kan telles, og det totale koloniserte bakterietallet på roten kan beregnes 4,5.
Først ble A. thaliana dyrket under hydroponiske forhold, og deretter ble bakterieceller inokulert i rhizosfæren ved en endelig konsentrasjon på 0, 01 OD600. Det infiserte rotvevet ble høstet 2 dager etter inokulering og vasket i sterilt vann for å fjerne de ukoloniserte bakteriecellene. Videre ble bakterieceller kolonisert på roten samlet, fortynnet i fosfatbufret saltvann (PBS) buffer og belagt på et Luria-Bertani (LB) agarmedium. Etter inkubering ved 37 °C i 10 timer ble enkeltkolonier på LB-plater talt og normalisert for å bestemme bakteriecellene kolonisert på røttene.
Denne metoden er svært anvendelig, har god repeterbarhet, og er mer egnet for nøyaktig bestemmelse av bakteriell kolonisering av rhizosfæren.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>6-well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter cell stainer</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>F8200-40&#181;m</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate reader&#160;</td>
			<td>Tecan</td>
			<td>Infinite M200 PRO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Murashige and Skoog medium</td>
			<td>Hopebio</td>
			<td>HB8469-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaClO</td>
			<td>Alfa</td>
			<td>L14709</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phytagel</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8169</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Square petri dish</td>
			<td>Ruiai Zhengte</td>
			<td>PYM-130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex Genie2</td>
			<td>Scientific Industries</td>
			<td>G560E</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measuring bacterial colonization on arabidopsis thaliana roots in hydroponic condition

Måling av bakteriell kolonisering på Arabidopsis thaliana rot er et av de hyppigste forsøkene i plantemikrobe interaksjonsstudier. En standardisert metode for måling av bakteriell kolonisering i rhizosfæren er nødvendig for å forbedre reproduserbarheten. Vi dyrket først steril A.thaliana i hydroponiske forhold og inokulerte deretter bakteriecellene i rhizosfæren ved en endelig konsentrasjon på OD600 på 0,01. På 2 dager etter inokulering ble rotvevet høstet og vasket tre ganger i sterilt vann for å fjerne de ukoloniserte bakteriecellene. Røttene ble deretter veid, og bakteriecellene kolonisert på roten ble samlet inn av virvel. Cellesuspensjonen ble fortynnet i en gradient med en fosfatbufret saltvannsbuffer (PBS), etterfulgt av plettering på et Luria-Bertani (LB) agarmedium. Platene ble inkubert ved 37 ° C i 10 timer, og deretter ble de enkelte koloniene på LB-plater talt og normalisert for å indikere bakteriecellene kolonisert på røtter. Denne metoden brukes til å oppdage bakteriell kolonisering i rhizosfæren i mono-interaksjonsbetingelser, med god reproduserbarhet.

There are quantitative and qualitative methods for detecting rhizosphere colonization by a single bacterial strain. For the qualitative method, a strain that constitutively expresses fluorescence should be used, and the fluorescence distribution and intensity should be examined under fluorescence microscopy or laser confocal instruments1,2. Those strategies can well reflect bacterial colonization in situ3, but they are not as accurate as traditional plate counting methods in quantification. Besides, due to the limitation of only displaying partial root zones under the microscope, sometimes it can be influenced by subjective bias. 
Here, we describe a quantitative method, which includes collecting the colonized bacterial cells and counting the bacterial CFUs on a plate. This method is based on dilution and plating by which the colonized strains that were stripped from plant roots can be counted, and the total colonized bacteria number on the root can be calculated4,5. 
First, A. thaliana was cultured in hydroponic conditions, and then bacterial cells were inoculated in the rhizosphere at a final concentration of 0.01 OD600. The infected root tissues were harvested 2 days post-inoculation and washed in sterile water to remove the uncolonized bacterial cells. Further, bacterial cells colonized on the root were collected, diluted in phosphate-buffered saline (PBS) buffer, and plated onto a Luria-Bertani (LB) agar medium. After incubation at 37 &#176;C for 10 h, single colonies on LB plates were counted and normalized to determine the bacterial cells colonized on roots.
This method is highly applicable, has good repeatability, and is more suitable for accurate rhizosphere bacterial colonization determination.

Forfatter Spotlight: Forbedring av rhizobakteriekolonisering på planterøtter for forbedret mikrobiell gjødseleffektivitet

Måling av bakteriell kolonisering på Arabidopsis thaliana røtter i hydroponisk tilstand

Our research focuses on the interaction of beneficial rhizobacteria with plant roots. We are looking for the key mechanisms to enhance the colonization of beneficial bacteria, thus improving the efficiency and the stability of microbial fertilizers in the field. The methods for bacterial colonization of plant roots have been extensively studied, but there are still problems.For example, it's hard to measure the colonization on different sites distinctively, In the future we think applying microscope and high throughput counting will help to solve the problems. Our protocol is highly applicable with good repeatability, and it is more suitable for accurate rhizosphere bacteria colonization determination.

For å teste nøyaktigheten av bakteriekoloniseringsevnen oppdaget ved denne metoden i A. thaliana-rhizosfæren, inokulerte vi Bacillus velezensis SQR9 WT og en avledet mutant Δ8mcp i A. thaliana rhizosphere separat. Δ8mcp er en mutant som mangler alle kjemoreceptorkodende gener, og den har en betydelig redusert kolonisering6. Vi målte deres kolonisering ved 2 dager etter inokulering ved den nåværende rotkoloniseringsanalysen. Resultatene viste en ...

Watch this Scientific Journal Video about Author Spotlight: Enhancing Rhizobacteria Colonization on Plant Roots for Improved Microbial Fertilizer Efficiency at JoVE.com

Kolonisering av plantevekstfremmende rhizobakterier (PGPR) i rhizosfæren er avgjørende for den vekstfremmende effekten. Det er nødvendig å standardisere metoden for deteksjon av bakteriell rhizosfæren kolonisering. Her beskriver vi en reproduserbar metode for å kvantifisere bakteriekolonisering på rotoverflaten.

Measuring bacterial colonization on Arabidopsis thaliana root is one of the most frequent experiments in plant-microbe interaction studies. A standardized ...

Vår forskning fokuserer på samspillet mellom gunstige rhizobakterier og planterøtter. Vi leter etter de viktigste mekanismene for å forbedre koloniseringen av gunstige bakterier, og dermed forbedre effektiviteten og stabiliteten til mikrobiell gjødsel i feltet. Metodene for bakteriell kolonisering av planterøtter har blitt grundig studert, men det er fortsatt problemer.For eksempel er det vanskelig å måle koloniseringen på forskjellige steder særegent, I fremtiden tror vi at bruk av mikroskop og høy gjennomstrømningstelling vil bidra til å løse problemene. Vår protokoll er svært anvendelig med god repeterbarhet, og den er mer egnet for nøyaktig bestemmelse av rhizosfærens bakteriekolonisering.

measuring-bacterial-colonization-on-arabidopsis-thaliana-roots

Research

JoVE Journal

Environment

Measuring Bacterial Colonization on Arabidopsis thaliana Roots in Hydroponic Condition

Measuring bacterial colonization on Arabidopsis thaliana root is one of the most frequent experiments in plant-microbe interaction studies. A standardized method for measuring bacterial colonization in the rhizosphere is necessary to improve reproducibility. We first cultured sterile A.thaliana in hydroponic conditions and then inoculated the bacterial cells in the rhizosphere at a final concentration of OD600 of 0.01. At 2 days post-inoculation, the root tissue was harvested and washed three times in sterile water to remove the uncolonized bacterial cells. The roots were then weighed, and the bacterial cells colonized on the root were collected by vortex. The cell suspension was diluted in a gradient with a phosphate-buffered saline (PBS) buffer, followed by plating onto a Luria-Bertani (LB) agar medium. The plates were incubated at 37 &#176;C for 10 h, and then, the single colonies on LB plates were counted and normalized to indicate the bacterial cells colonized on roots. This method is used to detect bacterial colonization in the rhizosphere in mono-interaction conditions, with good reproducibility.

Colonization of plant growth-promoting rhizobacteria (PGPR) in the rhizosphere is essential for its growth-promoting effect. It is necessary to standardize the method of detection of bacterial rhizosphere colonization. Here, we describe a reproducible method for quantifying bacterial colonization on the root surface.