Name: Författare i fokus: Förbättra rhizobakteriernas kolonisering på växtrötter för förbättrad mikrobiell gödseleffektivitet
Uploaded: 2024-03-01T14:10:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Author Spotlight: Enhancing Rhizobacteria Colonization on Plant Roots for Improved Microbial Fertilizer Efficiency at JoVE.com

Detta arbete finansierades av National Natural Science Foundation of China (32370135), innovationsprogrammet för den kinesiska akademin för jordbruksvetenskap (CAAS-CSAL-202302), vetenskaps- och teknikprojektet vid Jiangsu Vocational College of Agriculture and Forestry (2021kj29).

1. Steril hydroponisk odling av A. thaliana
<ol><li>Förbered A. thaliana plantor.<ol><li>Förbered odling A. thaliana plantmedium som består av 1/2 MS-medium (Murashige och Skoog) med 2 % (vikt/volym) sackaros och 0,9 % (vikt/volym) agar.</li>
		<li>Häll det förberedda steriliseringsmediet i sterila fyrkantiga petriskålar (13 cm x 13 cm) innan det stelnar. Undvik lufttorkning för att bibehålla luftfuktigheten.</li>
		<li>Sänk ner A. thaliana-frön...

Påvisande av rhizobakteriell kolonisering på Arabidopsis thaliana

<ol>
	<li>Wang, B., Wan, C., Zeng, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colonization+on+cotton+plants+with+a+GFP+labeled+strain+of+Bacillus+axarquiensis.">Colonization on cotton plants with a GFP labeled strain of Bacillus axarquiensis.</a> Curr Microbiol. 77 (10), 3085-3094 (2020).</li><li>Zhai, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetic+tool+for+production+of+GFP-expressing+Rhodopseudomonaspalustris+for+visualization+of+bacterial+colonization.">A genetic tool for production of GFP-expressing Rhodopseudomonaspalustris for visualization of bacterial colonization.</a> AMB Express. 9 (1), 141 (2019).</li><li>Synek, L., Rawat, A., L'Haridon, F., Weisskopf, L., Saad, M. M., Hirt, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+strategies+of+plant+colonization+by+beneficial+endophytic+Enterobacter+sp.+SA187.">Multiple strategies of plant colonization by beneficial endophytic Enterobacter sp. SA187.</a> Environ Microbiol. 23 (10), 6223-6240 (2021).</li><li>Zhang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacillus+velezensis+tolerance+to+the+induced+oxidative+stress+in+root+colonization+contributed+by+the+two-component+regulatory+system+sensor+ResE.">Bacillus velezensis tolerance to the induced oxidative stress in root colonization contributed by the two-component regulatory system sensor ResE.</a> Plant Cell Environ. 44 (9), 3094-3102 (2021).</li><li>Liu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant+commensal+type+VII+secretion+system+causes+iron+leakage+from+roots+to+promote+colonization.">Plant commensal type VII secretion system causes iron leakage from roots to promote colonization.</a> Nat Microbiol. 8 (8), 1434-1449 (2023).</li><li>Feng, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+chemotaxis+compounds+in+root+exudates+and+their+sensing+chemoreceptors+in+plant-growth-promoting+Rhizobacteria+Bacillus+amyloliquefaciens+SQR9.">Identification of chemotaxis compounds in root exudates and their sensing chemoreceptors in plant-growth-promoting Rhizobacteria Bacillus amyloliquefaciens SQR9.</a> Mol Plant Microbe Interact. 31, 995-1005 (2018).</li><li>Woo, S. L., Hermosa, R., Lorito, M., Monte, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trichoderma:+a+multipurpose,+plant-beneficial+microorganism+for+eco-sustainable+agriculture.">Trichoderma: a multipurpose, plant-beneficial microorganism for eco-sustainable agriculture.</a> Nat Rev Microbiol. 21 (5), 312-326 (2023).</li><li>Nongkhlaw, F. M., Joshi, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microscopic+study+on+colonization+and+antimicrobial+property+of+endophytic+bacteria+associated+with+ethnomedicinal+plants+of+Meghalaya.">Microscopic study on colonization and antimicrobial property of endophytic bacteria associated with ethnomedicinal plants of Meghalaya.</a> J Microsc Ultrastruct. 5 (3), 132-139 (2017).</li><li>Ravelo-Ortega, G., Raya-Gonz&#225;lez, J., L&#243;pez-Bucio, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compounds+from+rhizosphere+microbes+that+promote+plant+growth.">Compounds from rhizosphere microbes that promote plant growth.</a> Curr Opin Plant Biol. 73, 1369-5266 (2023).</li><li>Schulz-Bohm, K., Gerards, S., Hundscheid, M., Melenhorst, J., de Boer, W., Garbeva, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calling+from+distance:+attraction+of+soil+bacteria+by+plant+root+volatiles.">Calling from distance: attraction of soil bacteria by plant root volatiles.</a> ISME J. 12 (5), 1252-1262 (2018).</li><li>Sharifi, R., Lee, S. M., Ryu, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbe-induced+plant+volatiles.">Microbe-induced plant volatiles.</a> New Phytol. 220 (3), 684-691 (2018).</li><li>Eckshtain-Levi, N., Harris, S. L., Roscios, R. Q., Shank, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+community+members+increase+Bacillus+subtilis+maintenance+on+the+roots+of+Arabidopsis+thaliana.">Bacterial community members increase Bacillus subtilis maintenance on the roots of Arabidopsis thaliana.</a> Phytobiomes J. 4, 303-313 (2020).</li><li>Liu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Root+colonization+by+beneficial+rhizobacteria.">Root colonization by beneficial rhizobacteria.</a> FEMS Microbiol Rev. 48, (2024).</li><li>Yahya, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+root+exudation+and+architecture+for+improved+growth+of+wheat+mediated+by+phosphate+solubilizing+bacteria.">Differential root exudation and architecture for improved growth of wheat mediated by phosphate solubilizing bacteria.</a> Front Microbiol. 12, 744094 (2021).</li><li>Husna, K. B. -. E., Won, M. -. H., Jeong, M. -. I., Oh, K. -. K., Park, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+and+genomic+insight+of+surfactin-producing+Bacillus+velezensis+and+its+biocontrol+potential+against+pathogenic+contamination+in+lettuce+hydroponics.">Characterization and genomic insight of surfactin-producing Bacillus velezensis and its biocontrol potential against pathogenic contamination in lettuce hydroponics.</a> Environ Sci Pollut Res Int. 30 (58), 121487-121500 (2023).</li></ol>

För att uppnå god reproducerbarhet finns det fyra kritiska steg för koloniseringsdetekteringsprocessen för detta protokoll. För det första är det nödvändigt att se till att antalet inokulerade bakterieceller är exakt detsamma i varje experiment. För det andra är det också nödvändigt att kontrollera rengöringsintensiteten för de icke-koloniserade bakterierna med sterilt vatten. För det tredje måste varje provutspädningsprocess virvlas innan den utförs för att låta provet vara i ett fullständigt bla...

Det finns kvantitativa och kvalitativa metoder för att detektera rhizosfärkolonisering av en enda bakteriestam. För den kvalitativa metoden bör en stam som konstitutivt uttrycker fluorescens användas, och fluorescensfördelningen och intensiteten bör undersökas med fluorescensmikroskopi eller laserkonfokala instrument 1,2. Dessa strategier kan mycket väl återspegla bakteriell kolonisering in situ3, men de är inte lika exakta som traditionella platträkningsmetoder i kvantifiering. Dessutom, på grund av begränsningen att endast visa partiella rotzoner under mikroskopet, kan det ibland påverkas av subjektiv bias.
Här beskriver vi en kvantitativ metod, som innebär att man samlar in de koloniserade bakteriecellerna och räknar de bakteriella CFU:erna på en platta. Denna metod är baserad på utspädning och plätering genom vilken de koloniserade stammar som avlägsnats från växtrötter kan räknas, och det totala antalet koloniserade bakterier på roten kan beräknas som 4,5.
Först odlades A. thaliana under hydroponiska förhållanden, och sedan inokulerades bakterieceller i rhizosfären vid en slutlig koncentration av 0,01 OD600. De infekterade rotvävnaderna skördades 2 dagar efter inokulering och tvättades i sterilt vatten för att avlägsna de okoloniserade bakteriecellerna. Vidare samlades bakterieceller koloniserade på roten, späddes ut i fosfatbuffrad saltlösning (PBS) buffert och pläterades på ett Luria-Bertani (LB) agarmedium. Efter inkubation vid 37 °C i 10 timmar räknades och normaliserades enstaka kolonier på LB-plattor för att bestämma vilka bakterieceller som koloniserades på rötterna.
Denna metod är mycket användbar, har god repeterbarhet och är mer lämplig för noggrann bestämning av bakteriell kolonisering av rhizosfären.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>6-well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter cell stainer</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>F8200-40&#181;m</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate reader&#160;</td>
			<td>Tecan</td>
			<td>Infinite M200 PRO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Murashige and Skoog medium</td>
			<td>Hopebio</td>
			<td>HB8469-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaClO</td>
			<td>Alfa</td>
			<td>L14709</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phytagel</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8169</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Square petri dish</td>
			<td>Ruiai Zhengte</td>
			<td>PYM-130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex Genie2</td>
			<td>Scientific Industries</td>
			<td>G560E</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measuring bacterial colonization on arabidopsis thaliana roots in hydroponic condition

Att mäta bakteriell kolonisering på Arabidopsis thaliana-rot är ett av de vanligaste experimenten i studier av växt-mikrobinteraktion. En standardiserad metod för att mäta bakteriekolonisering i rhizosfären är nödvändig för att förbättra reproducerbarheten. Vi odlade först steril A.thaliana under hydroponiska förhållanden och inokulerade sedan bakteriecellerna i rhizosfären vid en slutlig koncentration av OD600 på 0,01. 2 dagar efter inokuleringen skördades rotvävnaden och tvättades tre gånger i sterilt vatten för att avlägsna de okoloniserade bakteriecellerna. Rötterna vägdes sedan och de bakterieceller som koloniserades på roten samlades in av virveln. Cellsuspensionen späddes ut i en gradient med en fosfatbuffrad koksaltlösning (PBS) buffert, följt av plätering på ett Luria-Bertani (LB) agarmedium. Plattorna inkuberades vid 37 °C i 10 timmar, och sedan räknades och normaliserades de enskilda kolonierna på LB-plattorna för att indikera vilka bakterieceller som koloniserats på rötterna. Denna metod används för att detektera bakteriell kolonisering i rhizosfären under monointeraktionsförhållanden, med god reproducerbarhet.

There are quantitative and qualitative methods for detecting rhizosphere colonization by a single bacterial strain. For the qualitative method, a strain that constitutively expresses fluorescence should be used, and the fluorescence distribution and intensity should be examined under fluorescence microscopy or laser confocal instruments1,2. Those strategies can well reflect bacterial colonization in situ3, but they are not as accurate as traditional plate counting methods in quantification. Besides, due to the limitation of only displaying partial root zones under the microscope, sometimes it can be influenced by subjective bias. 
Here, we describe a quantitative method, which includes collecting the colonized bacterial cells and counting the bacterial CFUs on a plate. This method is based on dilution and plating by which the colonized strains that were stripped from plant roots can be counted, and the total colonized bacteria number on the root can be calculated4,5. 
First, A. thaliana was cultured in hydroponic conditions, and then bacterial cells were inoculated in the rhizosphere at a final concentration of 0.01 OD600. The infected root tissues were harvested 2 days post-inoculation and washed in sterile water to remove the uncolonized bacterial cells. Further, bacterial cells colonized on the root were collected, diluted in phosphate-buffered saline (PBS) buffer, and plated onto a Luria-Bertani (LB) agar medium. After incubation at 37 &#176;C for 10 h, single colonies on LB plates were counted and normalized to determine the bacterial cells colonized on roots.
This method is highly applicable, has good repeatability, and is more suitable for accurate rhizosphere bacterial colonization determination.

Författare i fokus: Förbättra rhizobakteriernas kolonisering på växtrötter för förbättrad mikrobiell gödseleffektivitet

Mätning av bakteriell kolonisering på Arabidopsis thaliana-rötter i hydroponiskt tillstånd

Our research focuses on the interaction of beneficial rhizobacteria with plant roots. We are looking for the key mechanisms to enhance the colonization of beneficial bacteria, thus improving the efficiency and the stability of microbial fertilizers in the field. The methods for bacterial colonization of plant roots have been extensively studied, but there are still problems.For example, it's hard to measure the colonization on different sites distinctively, In the future we think applying microscope and high throughput counting will help to solve the problems. Our protocol is highly applicable with good repeatability, and it is more suitable for accurate rhizosphere bacteria colonization determination.

För att testa noggrannheten i bakteriekoloniseringsförmågan som detekteras med denna metod i A. thaliana rhizosfären, inokulerade vi Bacillus velezensis SQR9 WT och en härledd mutant Δ8mcp i A. thaliana rhizosfär separat. Δ8mcp är en mutant som saknar alla kemoreceptorkodande gener, och den har en signifikant minskad kolonisering6. Vi mätte deras kolonisering 2 dagar efter inokulering med den nuvarande rotkoloniseringsanalysen. Resultaten visa...

Watch this Scientific Journal Video about Author Spotlight: Enhancing Rhizobacteria Colonization on Plant Roots for Improved Microbial Fertilizer Efficiency at JoVE.com

Kolonisering av växttillväxtfrämjande rhizobakterier (PGPR) i rhizosfären är avgörande för dess tillväxtfrämjande effekt. Det är nödvändigt att standardisera metoden för detektion av bakteriell rhizosfärkolonisering. Här beskriver vi en reproducerbar metod för att kvantifiera bakteriell kolonisering på rotytan.

Measuring bacterial colonization on Arabidopsis thaliana root is one of the most frequent experiments in plant-microbe interaction studies. A standardized ...

Vår forskning fokuserar på interaktionen mellan nyttiga rhizobakterier och växtrötter. Vi letar efter de viktigaste mekanismerna för att förbättra koloniseringen av nyttiga bakterier och därmed förbättra effektiviteten och stabiliteten hos mikrobiella gödselmedel i fält. Metoderna för bakteriell kolonisering av växtrötter har studerats ingående, men det finns fortfarande problem.Till exempel är det svårt att mäta kolonisationen på olika platser särskilt, I framtiden tror vi att tillämpning av mikroskop och räkning med hög genomströmning kommer att hjälpa till att lösa problemen. Vårt protokoll är mycket tillämpligt med god repeterbarhet, och det är mer lämpat för noggrann bestämning av kolonisering av rhizosfärbakterier.

measuring-bacterial-colonization-on-arabidopsis-thaliana-roots

Research

JoVE Journal

Environment

Measuring Bacterial Colonization on Arabidopsis thaliana Roots in Hydroponic Condition

Measuring bacterial colonization on Arabidopsis thaliana root is one of the most frequent experiments in plant-microbe interaction studies. A standardized method for measuring bacterial colonization in the rhizosphere is necessary to improve reproducibility. We first cultured sterile A.thaliana in hydroponic conditions and then inoculated the bacterial cells in the rhizosphere at a final concentration of OD600 of 0.01. At 2 days post-inoculation, the root tissue was harvested and washed three times in sterile water to remove the uncolonized bacterial cells. The roots were then weighed, and the bacterial cells colonized on the root were collected by vortex. The cell suspension was diluted in a gradient with a phosphate-buffered saline (PBS) buffer, followed by plating onto a Luria-Bertani (LB) agar medium. The plates were incubated at 37 &#176;C for 10 h, and then, the single colonies on LB plates were counted and normalized to indicate the bacterial cells colonized on roots. This method is used to detect bacterial colonization in the rhizosphere in mono-interaction conditions, with good reproducibility.

Colonization of plant growth-promoting rhizobacteria (PGPR) in the rhizosphere is essential for its growth-promoting effect. It is necessary to standardize the method of detection of bacterial rhizosphere colonization. Here, we describe a reproducible method for quantifying bacterial colonization on the root surface.