Name: تسليط الضوء على المؤلف: فتح عالم المناطق المضطربة جوهريا من خلال الاستشعار والاستجابات الخلوية
Uploaded: 2024-01-12T14:50:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Estimation of Structural Sensitivity of Intrinsically Disordered Regions in Response to Hyperosmotic Stress in Living Cells Using FRET at JoVE.com

نشكر أعضاء مختبر كويفاس-فيلاسكيز على المراجعة النقدية للمخطوطة. وحظي هذا العمل بدعم من برنامج دعم مشاريع البحث والتجديد التقني، والمديرية العامة لخبراء الأكاديميات الشخصية، والمشروع رقم IA203422 التابع للجامعة الوطنية المستقلة في المكسيك؛ المجلس الوطني للإنسان والعلوم والتكنولوجيا، المشروع رقم 252952؛ وبرنامج دعم البحث وبوسغرادو، كلية كيميكا، الجامعة الوطنية المستقلة في المكسيك، منحة 5000-9182. تعترف CET (CVU 1083636) و CAPD (CVU 1269643) ب CONAHCYT لمنحة M.Sc. الدراسية.

1. بناء البلازميد
<ol><li>قم بتضخيم إطار القراءة المفتوح (ORF) الذي يرمز ل IDR المطلوب عن طريق تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR). لا تقم بتضمين كودون التوقف لأن ORF سيكون محاطا بالجينات التي تشفر البروتينات الفلورية. للتضخيم ، صمم البادئات مع مواقع تقييد SacI (5') و BglII (3'). ملاحظة: بالن...

تحليل الحنق للحساسية الهيكلية IDR لدراسة الإجهاد المفرط التناضح في الخميرة

<ol>
	<li>Wright, P. E., Dyson, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrinsically+disordered+proteins+in+cellular+signalling+and+regulation.">Intrinsically disordered proteins in cellular signalling and regulation.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 16 (1), 18-29 (2015).</li><li>Covarrubias, A. A., Romero-P&#233;rez, P. S., Cuevas-Velazquez, C. L., Rend&#243;n-Luna, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+functional+diversity+of+structural+disorder+in+plant+proteins.">The functional diversity of structural disorder in plant proteins.</a> Arch Biochem Biophys. 680, 108229 (2019).</li><li>Ahmed, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+intrinsically+disordered+regions+in+proteins+informed+by+human+genetic+diversity.">Characterization of intrinsically disordered regions in proteins informed by human genetic diversity.</a> PLoS Comput Biol. 18 (3), e1009911 (2022).</li><li>Birol, M., Melo, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Untangling+the+conformational+polymorphism+of+disordered+proteins+associated+with+neurodegeneration+at+the+single-molecule+level.">Untangling the conformational polymorphism of disordered proteins associated with neurodegeneration at the single-molecule level.</a> Front Mol Neurosci. 12, 309 (2019).</li><li>Moses, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revealing+the+hidden+sensitivity+of+intrinsically+disordered+proteins+to+their+chemical+environment.">Revealing the hidden sensitivity of intrinsically disordered proteins to their chemical environment.</a> J Phys Chem Lett. 11 (23), 10131-10136 (2020).</li><li>Cuevas-Velazquez, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrinsically+disordered+protein+biosensor+tracks+the+physical-chemical+effects+of+osmotic+stress+on+cells.">Intrinsically disordered protein biosensor tracks the physical-chemical effects of osmotic stress on cells.</a> Nat Commun. 12 (1), 5438 (2021).</li><li>Holehouse, A. S., Sukenik, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlling+structural+bias+in+intrinsically+disordered+proteins+using+solution+space+scanning.">Controlling structural bias in intrinsically disordered proteins using solution space scanning.</a> J Chem Theory Comput. 16 (3), 1794-1805 (2020).</li><li>Martin, E. W., Hopkins, J. B., Mittag, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small-angle+X-ray+scattering+experiments+of+monodisperse+intrinsically+disordered+protein+samples+close+to+the+solubility+limit.">Small-angle X-ray scattering experiments of monodisperse intrinsically disordered protein samples close to the solubility limit.</a> Methods Enzymol. 646, 185-222 (2021).</li><li>Miles, A. J., Drew, E. D., Wallace, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DichroIDP:+a+method+for+analyses+of+intrinsically+disordered+proteins+using+circular+dichroism+spectroscopy.">DichroIDP: a method for analyses of intrinsically disordered proteins using circular dichroism spectroscopy.</a> Commun Biol. 6 (1), 823 (2023).</li><li>Kaminski, C. F., Rees, E. J., Schierle, G. S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+quantitative+protocol+for+intensity-based+live+cell+FRET+imaging.">A quantitative protocol for intensity-based live cell FRET imaging.</a> Method Mol Biol. 1076, 445-454 (2014).</li><li>Moses, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+biases+in+disordered+proteins+are+prevalent+in+the+cell.">Structural biases in disordered proteins are prevalent in the cell.</a> bioRxiv. , (2022).</li><li>Cuevas-Velazquez, C. L., Saab-Rinc&#243;n, G., Reyes, J. L., Covarrubias, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Unstructured+N-terminal+Region+of+Arabidopsis+Group+4+Late+Embryogenesis+Abundant+(LEA)+Proteins+Is+Required+for+Folding+and+for+Chaperone-like+Activity+under+Water+Deficit.">The Unstructured N-terminal Region of Arabidopsis Group 4 Late Embryogenesis Abundant (LEA) Proteins Is Required for Folding and for Chaperone-like Activity under Water Deficit.</a> J Biol Chem. 291 (20), 10893-10903 (2016).</li><li>JoVE Science Education Database. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Restriction enzyme digests. , (2023).</li><li>JoVE Science Education Database. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Gel purification. , (2023).</li><li>JoVE Science Education Database. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> DNA ligation reactions. , (2023).</li><li>JoVE Science Education Database. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Bacterial transformation using heat Ssock and competent cells. , (2023).</li><li>JoVE Science Education Database. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> PCR: Principle, instrumentation, and applications. , (2023).</li><li>JoVE Science Education Database. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Plasmid purification. , (2023).</li><li>JoVE Science Education Database. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> DNA gel electrophoresis. , (2023).</li><li>JoVE Core Molecular Biology. Sanger/chain termination sequencing using dideoxynucleotides - Concept Available from: <a target="_blank" href="https://app.jove.com/science-education/v/12020/sanger-sequencing">https://app.jove.com/science-education/v/12020/sanger-sequencing</a> (2023)</li><li>Theillet, F. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physicochemical+properties+of+cells+and+their+effects+on+intrinsically+disordered+proteins+(IDPs).">Physicochemical properties of cells and their effects on intrinsically disordered proteins (IDPs).</a> Chem Rev. 114 (13), 6661-6714 (2014).</li><li>Brutscher, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NMR+methods+for+the+study+of+instrinsically+disordered+proteins+structure,+dynamics,+and+interactions:+General+overview+and+practical+guidelines.">NMR methods for the study of instrinsically disordered proteins structure, dynamics, and interactions: General overview and practical guidelines.</a> Adv Exp Med Biol. 870, 49-122 (2015).</li><li>Metskas, L. A., Rhoades, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+FRET+of+intrinsically+disordered+proteins.">Single-molecule FRET of intrinsically disordered proteins.</a> Annu Rev Phys Chem. 71, 391-414 (2020).</li><li>Roebroek, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+readout+of+multiple+FRET+pairs+using+photochromism.">Simultaneous readout of multiple FRET pairs using photochromism.</a> Nat Commun. 12 (1), 2005 (2021).</li><li>Algar, W. R., Hildebrandt, N., Vogel, S. S., Medintz, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FRET+as+a+biomolecular+research+tool+-+understanding+its+potential+while+avoiding+pitfalls.">FRET as a biomolecular research tool - understanding its potential while avoiding pitfalls.</a> Nat Methods. 16 (9), 815-829 (2019).</li><li>Lyon, A. S., Peeples, W. B., Rosen, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+framework+for+understanding+the+functions+of+biomolecular+condensates+across+scales.">A framework for understanding the functions of biomolecular condensates across scales.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 22 (3), 215-235 (2021).</li><li>Belott, C., Janis, B., Menze, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liquid-liquid+phase+separation+promotes+animal+desiccation+tolerance.">Liquid-liquid phase separation promotes animal desiccation tolerance.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 117 (44), 27676-27684 (2020).</li><li>Miermont, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Severe+osmotic+compression+triggers+a+slowdown+of+intracellular+signaling,+which+can+be+explained+by+molecular+crowding.">Severe osmotic compression triggers a slowdown of intracellular signaling, which can be explained by molecular crowding.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (14), 5725-5730 (2013).</li><li>Saito, H., Posas, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Response+to+hyperosmotic+stress.">Response to hyperosmotic stress.</a> Genetics. 192 (2), 289-318 (2012).</li><li>Selenko, P., Wagner, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Looking+into+live+cells+with+in-cell+NMR+spectroscopy.">Looking into live cells with in-cell NMR spectroscopy.</a> J Struct Biol. 158 (2), 244-253 (2007).</li><li>Cattani, J., Subramaniam, V., Drescher, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Room-temperature+in-cell+EPR+spectroscopy:+alpha-Synuclein+disease+variants+remain+intrinsically+disordered+in+the+cell.">Room-temperature in-cell EPR spectroscopy: alpha-Synuclein disease variants remain intrinsically disordered in the cell.</a> Phys Chem Chem Phys. 19 (28), 18147-18151 (2017).</li><li>Beveridge, R., Chappuis, Q., Macphee, C., Barran, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+spectrometry+methods+for+intrinsically+disordered+proteins.">Mass spectrometry methods for intrinsically disordered proteins.</a> Analyst. 138 (1), 32-42 (2013).</li><li>Beveridge, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ion+mobility+mass+spectrometry+uncovers+the+impact+of+the+patterning+of+oppositely+charged+residues+on+the+conformational+distributions+of+intrinsically+disordered+proteins.">Ion mobility mass spectrometry uncovers the impact of the patterning of oppositely charged residues on the conformational distributions of intrinsically disordered proteins.</a> J Am Chem Soc. 141 (12), 4908-4918 (2019).</li></ol>

تقدم الطريقة المعروضة هنا طريقة للحصول على رؤى حول كيفية استشعار الأبعاد العالمية لمجموعة IDRs للاضطرابات البيئية والاستجابة لها. تعتمد هذه الطريقة على بنية مشفرة وراثيا ولا تتطلب مكونات إضافية تتجاوز التعبير المستقر للبلازميد في خلايا الخميرة ، مما يجعلها قابلة للتكيف مع التطبيقات المح?...

المناطق المضطربة جوهريا (IDRs) هي مكونات حاسمة في العمليات الخلوية1. بالاقتران مع المجالات المهيكلة، تعد IDRs ضرورية لوظائف البروتين. تركيبة الأحماض الأمينية ل IDRs متحيزة ، ممثلة بشكل أساسي بالمخلفات المشحونة والمحبة للماء والصغيرة. بسبب هذه الخاصية ، تعتبر IDRs نطاقات منخفضة التعقيد 2,3. وقد حظيت العديد من الروابطات الإندونيسية بالاهتمام، ويرجع ذلك أساسا إلى أن هذه المناطق تلعب دورا حاسما في الحالات المرضية، وخاصة الأمراض التنكسية العصبية. تتميز هذه الأمراض بالتجميع الذاتي والترسب اللاحق خارج الخلية أو داخل الخلايا من IDRs في الخلايا العصبية4. ومن الأمثلة على هذه التفاعلات التفاعلية الأميلويد-β (Aβ) في مرض الزهايمر، وهنتنغتين (HTT) في مرض هنتنغتون، وبروتين ربط الحمض النووي لتقرير التقييم الثالث 43 (TDP-43) وتنصهر في الساركوما (FUS) في التصلب الجانبي الضموري والخرف الجبهيالصدغي 4. تم تعزيز دراسة إعادة الترتيب الهيكلي ل IDRs في سياق المرض بشكل كبير من خلال الطرق الطيفية ، بما في ذلك نقل طاقة الرنين الفلوري (FRET).
إن الطبيعة المحبة للماء والموسعة ل IDRs تجعلها حساسة للغاية للتغيرات في الخواص الفيزيائية والكيميائية لبيئة المحلول5. تسمى الدرجة التي يتم بها تعديل المجموعة التوافقية ل IDRs بواسطة البيئة الحساسية الهيكلية5،6،7. يمكن استخدام تقنيات مختلفة لدراسة تشكل وديناميكيات IDRs ، بما في ذلك ثنائية اللون الدائرية (CD) وتشتت الأشعة السينية بزاوية صغيرة (SAXS) 8,9. لسوء الحظ ، تتطلب CD و SAXS كميات كبيرة من البروتينات النقية ، لذلك فهي غير مناسبة للدراسات في الخلايا. في المقابل ، FRET هي تقنية تقيس شدة التألق لجزيئين من الفلورسنت يسميان على وجه التحديد IDR واحدا ، مما يعني أنه يمكن مراقبتهما في مخاليط معقدة مثل الخلايا الحية10. يعد القياس الديناميكي للحساسية الهيكلية ل IDRs في الخلايا الحية ضروريا لفهم كيفية تنظيم البيئة لتشكل ووظيفة البروتين المضطرب.
FRET هي طريقة قوية لقياس الحساسية الهيكلية ل IDRs ، وكذلك البروتينات الكروية ومتعددة المجالات في الخلايا الحية. تتطلب الطريقة بنية تتكون من IDR ذات أهمية محصورة بين اثنين من البروتينات الفلورية (FP) ، والمعروفة باسم زوج FRET. بالنسبة لهذا البروتوكول ، نقترح استخدام mCerulean3 باعتباره FP المانح والسترين كمتلقي FP ، بسبب نطاقها الديناميكي الكبير ، مقارنة ب FPs الأخرى التي تم الإبلاغ عنها في دراسة سابقة حول حساسية IDRs6. تم استغلال FRET سابقا لقياس الحساسية الهيكلية ل IDR للنبات في سياقات خلويةمختلفة 6. بالإضافة إلى ذلك ، تم استخدام هذه التقنية لتوصيف أبعاد البروتين الكلية ل IDRs من قبل مجموعات بحثية مختلفة في كل من المختبر وفي الجسم الحي 5,11.
هنا ، نصف طريقة FRET الجماعية لدراسة الحساسية الهيكلية ل IDRs في خلايا الخميرة الحية (Saccharomyces cerevisiae). نعرض نتائج تمثيلية تستند إلى IDR نباتي يسمى AtLEA4-5. AtLEA4-5 مضطرب في المحلول ، لكنه يطوى إلى حلزون α عندما يحدث ازدحام جزيئي كبير في المختبر12. AtLEA4-5 هو نموذج مرجعي جيد لهذه الطريقة لأنه صغير نسبيا (158 بقايا) ، مضطرب وحساس للاضطراب البيئي كما ورد في السيليكو وفي المختبر 6,12. يمكن توسيع نطاق الطريقة المعروضة هنا لنهج الإنتاجية العالية لأن خلايا الخميرة سهلة النمو ، ويتم تطبيق العلاج بكميات صغيرة. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن تطبيق تعديلات صغيرة على البروتوكول على الأنظمة الخلوية الأخرى مثل البكتيريا والخلايا النباتية6. يمكن إجراء البروتوكول في أي مختبر للبيولوجيا الجزيئية مع إمكانية الوصول إلى قارئ الصفائح الدقيقة مع وضع التألق ، وهو جهاز متوفر في معظم المؤسسات البحثية.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>96-well plate</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>655096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>5040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BglII</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>R0144S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BJ5465 cells</td>
			<td>American Type Culture Collection</td>
			<td>208289</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffer MES 50 mM</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M8250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffer Tris-HCl 10 mM</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15506017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA 1 mM</td>
			<td>Merck</td>
			<td>108452</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352057</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB media</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L2897</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lithium acetate 0.1 M</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L6883</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low Melt Agarose</td>
			<td>GOLDBIO</td>
			<td>A-204-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td>eppendorf</td>
			<td>5452000010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Miniprep kit</td>
			<td>ZymoPure</td>
			<td>D4210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH 0.02 M</td>
			<td>Merck</td>
			<td>106462</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEG 3,350 40%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>1546547</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>plasmid pDRFLIP38-AtLEA4-5</td>
			<td>addgene</td>
			<td>178189</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate reader</td>
			<td>BMG LABTECH</td>
			<td>CLARIOstar Plus</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SacI</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>R3156S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Salmon sperm DNA 2 mg/mL</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15632011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SD-Ura</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Y1501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium cloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taq polymesare</td>
			<td>Promega</td>
			<td>M5123</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transiluminator</td>
			<td>Accuris instruments</td>
			<td>E4000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV-Visible spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Biomate3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>YPD media</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Y1500</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

estimation of structural sensitivity of intrinsically disordered regions in response to hyperosmotic stress in living cells using fret

المناطق المضطربة جوهريا (IDRs) هي مجالات بروتينية تشارك في العمليات الخلوية الحاسمة. أثناء ظروف الإجهاد ، تتغير الخصائص الفيزيائية والكيميائية للبيئة الخلوية ، مما يؤثر بشكل مباشر على المجموعة التوافقية من IDRs. IDRs حساسة بطبيعتها للاضطرابات البيئية. تعد دراسة كيفية تنظيم الخصائص الفيزيائية والكيميائية للخلية للمجموعة التوافقية من IDRs أمرا ضروريا لفهم التحكم البيئي في وظيفتها. هنا ، نصف طريقة خطوة بخطوة لقياس الحساسية الهيكلية ل IDRs في خلايا Saccharomyces cerevisiae الحية استجابة لظروف الإجهاد المفرط الأسموزي. نقدم استخدام نقل طاقة الرنين الفلوري الجماعي (FRET) لتقدير كيفية تغير الأبعاد العالمية ل IDRs أثناء الزيادة التدريجية للإجهاد المفرط الأسموزي المفروض على الخلايا التي تحتوي على أي تناضح. بالإضافة إلى ذلك ، نقدم نصا لمعالجة قياسات التألق ومقارنة الحساسية الهيكلية لمختلف IDRs. باتباع هذه الطريقة، يمكن للباحثين الحصول على رؤى قيمة حول التغيرات التوافقية التي تخضع لها IDRs في الوسط المعقد داخل الخلايا عند البيئات المتغيرة.

Intrinsically disordered regions (IDRs) are critical components in cellular processes1. In combination with structured domains, IDRs are essential for protein functions. The amino acid composition of IDRs is biased, represented mainly by charged, hydrophilic, and small residues. Because of this property, IDRs are considered low complexity domains2,3. Numerous IDRs have garnered attention, primarily because these regions play a crucial role in pathological conditions, particularly neurodegenerative diseases. Such diseases are characterized by self-assembly and subsequent extracellular or intracellular deposition of IDRs in neurons4. Examples of such IDRs include amyloid-&#946;&#160;(A&#946;) in Alzheimer&#39;s disease, huntingtin (HTT) in Huntington&#39;s disease, and TAR DNA-binding protein-43 (TDP-43) and fused in sarcoma (FUS) in amyotrophic lateral sclerosis and frontotemporal dementia4. The study of the structural rearrangements of IDRs in the context of disease has been significantly enhanced by spectroscopic methods, including fluorescence resonance energy transfer (FRET).
The hydrophilic and extended nature of IDRs makes them extremely sensitive to changes in the physicochemical properties of the solution environment5. The degree by which the conformational ensemble of IDRs is modified by the environment is called structural sensitivity5,6,7. Different techniques can be used to study the conformation and dynamics of IDRs, including circular dichroism (CD) and small-angle X-ray scattering (SAXS)8,9. Unfortunately, CD and SAXS require large quantities of purified proteins, so they are not appropriate for studies in cells. In contrast, FRET is a technique that measures the fluorescence intensity of two fluorescent molecules that specifically label one IDR, meaning that they can be monitored in complex mixtures such as living cells10. Dynamically measuring the structural sensitivity of IDRs in living cells is necessary for understanding how the environment regulates the conformation and function of the disordered proteome.
FRET is a powerful method for quantifying the structural sensitivity of IDRs, as well as globular and multidomain proteins in living cells. The method requires a construct consisting of an IDR of interest sandwiched between two fluorescent proteins (FP), known as a FRET pair. For this protocol, we suggest the use of mCerulean3 as the donor FP and Citrine as the acceptor FP, because of their large dynamic range, compared to other FPs reported in a previous study about IDRs sensitivity6. FRET has previously been exploited to measure the structural sensitivity of a plant IDR in different cellular contexts6. In addition, this technique has been used to characterize overall protein dimensions of IDRs by different research groups both in vitro and in vivo5,11.
Here, we describe the ensemble FRET method for studying the structural sensitivity of IDRs in living yeast (Saccharomyces cerevisiae) cells. We show representative results that are based in a plant IDR called AtLEA4-5. AtLEA4-5 is disordered in solution, but folds into &#945;-helix when macromolecular crowding is induced in vitro12. AtLEA4-5 is a good reference model for this method because it is relatively small (158 residues), disordered and sensitive to environmental perturbation as reported in silico and in vitro6,12. The method presented here can be scaled for high throughput approaches because yeast cells are easy to grow, and the treatment is applied in small volumes. In addition, small modifications to the protocol can be applied to other cellular systems such as bacteria and plant cells6. The protocol can be performed in any molecular biology laboratory with access to a microplate reader with fluorescence mode, an equipment available in most research institutions.

تسليط الضوء على المؤلف: فتح عالم المناطق المضطربة جوهريا من خلال الاستشعار والاستجابات الخلوية

تقدير الحساسية التركيبية للمناطق المضطربة جوهريا استجابة للإجهاد المفرط الأسموزي في الخلايا الحية باستخدام FRET

We aim to understand how intrinsically disordered regions sense and respond to changes in the physical chemical properties of the environment. We combine biophysical, biochemical, genetic, and cell biology techniques to monitor how the structural ensemble of disordered regions change in living cells. Protein biophysics techniques are currently used to study the confirmation of IVRs.These include nuclear magnetic resonance, circular dichroism, small angle x-ray scattering, and FRET. Most of these techniques can only be used in vitro. Studying the confirmation of IVRs in a cellular context is challenging with high cost and time consuming techniques.We provide an alternative to overcome these challenges. Our protocol can monitor the confirmation of IVRs in an easy, fast, and reproducible way, complementing other in vitro methods. Our findings offered an understanding of the molecular mechanisms underlying the structural sensitivity of IVRs under stress.This allows the use of IVRs as somatic biosensors. The precise tracking of the cellular environment will contribute to a more nuanced understanding of life's fundamental processes. Our research has led to questions about the determinants of a structural sensitivity in intrinsically disordered regions, its relevance to IVR's functions, and the environmental factors influencing these sensitivity.

بعد تحويل خلايا الخميرة باستخدام بلازميد pDRFLIP38-AtLEA4-5 ، لوحظ مضان المحولات الإيجابية باستخدام محول الضوء الأزرق ومرشح (الشكل 1). يستغرق تحضير الحلول المختلفة للحث على الإجهاد الأسموزي المفرط وقتا طويلا ، لذلك نقترح اتباع نموذج 96 بئرا في الشكل 2. مباشرة بعد معا...

Watch this Scientific Journal Video about Estimation of Structural Sensitivity of Intrinsically Disordered Regions in Response to Hyperosmotic Stress in Living Cells Using FRET at JoVE.com

المناطق المضطربة جوهريا (IDRs) هي مجالات بروتينية مرنة تعدل شكلها استجابة للتغيرات البيئية. يمكن ل Ensemble fluorescence resonation Transfer Energy (FRET) تقدير أبعاد البروتين في ظل ظروف مختلفة. نقدم نهج FRET لتقييم الحساسية الهيكلية IDR في خلايا Saccharomyces cerevisiae الحية تحت ضغط فرط التناضح.

Intrinsically disordered regions (IDRs) are protein domains that participate in crucial cellular processes. During stress conditions, the physicochemical ...

نحن نهدف إلى فهم كيف تشعر المناطق المضطربة جوهريا وتستجيب للتغيرات في الخصائص الكيميائية الفيزيائية للبيئة. نحن نجمع بين التقنيات الفيزيائية الحيوية والكيميائية الحيوية والجينية وبيولوجيا الخلية لمراقبة كيفية تغير المجموعة الهيكلية للمناطق المضطربة في الخلايا الحية. تستخدم تقنيات الفيزياء الحيوية للبروتين حاليا لدراسة تأكيد IVRs.وتشمل هذه الرنين المغناطيسي النووي ، وثنائية اللون الدائرية ، وتشتت الأشعة السينية بزاوية صغيرة ، و FRET. لا يمكن استخدام معظم هذه التقنيات إلا في المختبر. تعد دراسة تأكيد IVRs في سياق خلوي أمرا صعبا مع تقنيات التكلفة العالية وتستغرق وقتا طويلا.نحن نقدم بديلا للتغلب على هذه التحديات. يمكن لبروتوكولنا مراقبة تأكيد IVRs بطريقة سهلة وسريعة وقابلة للتكرار ، مكملا الطرق الأخرى في المختبر. قدمت النتائج التي توصلنا إليها فهما للآليات الجزيئية الكامنة وراء الحساسية الهيكلية ل IVRs تحت الضغط.هذا يسمح باستخدام IVRs كمستشعرات حيوية جسدية. سيساهم التتبع الدقيق للبيئة الخلوية في فهم أكثر دقة لعمليات الحياة الأساسية. أدى بحثنا إلى أسئلة حول محددات الحساسية الهيكلية في المناطق المضطربة جوهريا ، وأهميتها لوظائف IVR ، والعوامل البيئية التي تؤثر على هذه الحساسية.

estimation-structural-sensitivity-intrinsically-disordered-regions

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Estimation of Structural Sensitivity of Intrinsically Disordered Regions in Response to Hyperosmotic Stress in Living Cells Using FRET

Intrinsically disordered regions (IDRs) are protein domains that participate in crucial cellular processes. During stress conditions, the physicochemical properties of the cellular environment change, directly impacting the conformational ensemble of IDRs. IDRs are inherently sensitive to environmental perturbations. Studying how the physicochemical properties of the cell regulate the conformational ensemble of IDRs is essential for understanding the environmental control of their function. Here, we describe a step-by-step method for measuring the structural sensitivity of IDRs in living Saccharomyces cerevisiae cells in response to hyperosmotic stress conditions. We present the use of ensemble fluorescence resonance energy transfer (FRET) to estimate how the global dimensions of IDRs change during a progressive increase of hyperosmotic stress imposed on cells with any osmolyte. In addition, we provide a script for processing fluorescence measurements and comparing structural sensitivity for different IDRs. By following this method, researchers can obtain valuable insights into the conformational changes that IDRs undergo in the complex intracellular milieu upon changing environments.

Intrinsically disordered regions (IDRs) are flexible protein domains that modify their conformation in response to environmental changes. Ensemble fluorescence resonance energy transfer (FRET) can estimate protein dimensions under different conditions. We present a FRET approach to assess IDR structural sensitivity in living Saccharomyces cerevisiae cells under hyperosmotic stress.