Name: Autor im Rampenlicht: Die Welt der intrinsisch ungeordneten Regionen mit zellulärer Sensorik und Reaktionen erschließen
Uploaded: 2024-01-12T14:50:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Estimation of Structural Sensitivity of Intrinsically Disordered Regions in Response to Hyperosmotic Stress in Living Cells Using FRET at JoVE.com

Wir danken den Mitgliedern des Cuevas-Velazquez-Labors für die kritische Überprüfung des Manuskripts. Diese Arbeit wurde unterstützt durch das Programa de Apoyo a Proyectos de Investigación e Innovación Tecnológica, die Dirección General de Asuntos del Personal Académico, die Universidad Nacional Autónoma de México (UNAM-PAPIIT) Projektnummer IA203422; Consejo Nacional de Humanidades, Ciencias y Tecnología (CONAHCYT), Projektnummer 252952; und Programa de Apoyo a la Investigación y el Posgrado, Facultad de Química, Universidad Nacional Autónoma de México, Grant 5000-9182. CET (CVU 1083636) und CAPD (CVU 1269643) würdigen CONAHCYT für ihr M.Sc-Stipendium.

1. Plasmid-Konstrukt
<ol><li>Amplifizieren Sie den offenen Leserahmen (ORF), der für die gewünschte IDR kodiert, durch Polymerase-Kettenreaktion (PCR). Schließen Sie das Stoppcodon nicht ein, da der ORF von den Genen flankiert wird, die für die fluoreszierenden Proteine kodieren. Für die Amplifikation werden Primer mit den Restriktionsstellen SacI (5') und BglII (3') entworfen. HINWEIS: Für den Abschnitt "Repräsentative Ergebnisse" haben wir AtLEA4-5 als ausgewählten IDR ve...

FRET-Analyse der strukturellen Sensitivität von IDR zur Untersuchung von hyperosmotischem Stress in Hefe

<ol>
	<li>Wright, P. E., Dyson, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrinsically+disordered+proteins+in+cellular+signalling+and+regulation.">Intrinsically disordered proteins in cellular signalling and regulation.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 16 (1), 18-29 (2015).</li><li>Covarrubias, A. A., Romero-P&#233;rez, P. S., Cuevas-Velazquez, C. L., Rend&#243;n-Luna, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+functional+diversity+of+structural+disorder+in+plant+proteins.">The functional diversity of structural disorder in plant proteins.</a> Arch Biochem Biophys. 680, 108229 (2019).</li><li>Ahmed, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+intrinsically+disordered+regions+in+proteins+informed+by+human+genetic+diversity.">Characterization of intrinsically disordered regions in proteins informed by human genetic diversity.</a> PLoS Comput Biol. 18 (3), e1009911 (2022).</li><li>Birol, M., Melo, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Untangling+the+conformational+polymorphism+of+disordered+proteins+associated+with+neurodegeneration+at+the+single-molecule+level.">Untangling the conformational polymorphism of disordered proteins associated with neurodegeneration at the single-molecule level.</a> Front Mol Neurosci. 12, 309 (2019).</li><li>Moses, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revealing+the+hidden+sensitivity+of+intrinsically+disordered+proteins+to+their+chemical+environment.">Revealing the hidden sensitivity of intrinsically disordered proteins to their chemical environment.</a> J Phys Chem Lett. 11 (23), 10131-10136 (2020).</li><li>Cuevas-Velazquez, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrinsically+disordered+protein+biosensor+tracks+the+physical-chemical+effects+of+osmotic+stress+on+cells.">Intrinsically disordered protein biosensor tracks the physical-chemical effects of osmotic stress on cells.</a> Nat Commun. 12 (1), 5438 (2021).</li><li>Holehouse, A. S., Sukenik, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlling+structural+bias+in+intrinsically+disordered+proteins+using+solution+space+scanning.">Controlling structural bias in intrinsically disordered proteins using solution space scanning.</a> J Chem Theory Comput. 16 (3), 1794-1805 (2020).</li><li>Martin, E. W., Hopkins, J. B., Mittag, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small-angle+X-ray+scattering+experiments+of+monodisperse+intrinsically+disordered+protein+samples+close+to+the+solubility+limit.">Small-angle X-ray scattering experiments of monodisperse intrinsically disordered protein samples close to the solubility limit.</a> Methods Enzymol. 646, 185-222 (2021).</li><li>Miles, A. J., Drew, E. D., Wallace, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DichroIDP:+a+method+for+analyses+of+intrinsically+disordered+proteins+using+circular+dichroism+spectroscopy.">DichroIDP: a method for analyses of intrinsically disordered proteins using circular dichroism spectroscopy.</a> Commun Biol. 6 (1), 823 (2023).</li><li>Kaminski, C. F., Rees, E. J., Schierle, G. S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+quantitative+protocol+for+intensity-based+live+cell+FRET+imaging.">A quantitative protocol for intensity-based live cell FRET imaging.</a> Method Mol Biol. 1076, 445-454 (2014).</li><li>Moses, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+biases+in+disordered+proteins+are+prevalent+in+the+cell.">Structural biases in disordered proteins are prevalent in the cell.</a> bioRxiv. , (2022).</li><li>Cuevas-Velazquez, C. L., Saab-Rinc&#243;n, G., Reyes, J. L., Covarrubias, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Unstructured+N-terminal+Region+of+Arabidopsis+Group+4+Late+Embryogenesis+Abundant+(LEA)+Proteins+Is+Required+for+Folding+and+for+Chaperone-like+Activity+under+Water+Deficit.">The Unstructured N-terminal Region of Arabidopsis Group 4 Late Embryogenesis Abundant (LEA) Proteins Is Required for Folding and for Chaperone-like Activity under Water Deficit.</a> J Biol Chem. 291 (20), 10893-10903 (2016).</li><li>JoVE Science Education Database. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Restriction enzyme digests. , (2023).</li><li>JoVE Science Education Database. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Gel purification. , (2023).</li><li>JoVE Science Education Database. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> DNA ligation reactions. , (2023).</li><li>JoVE Science Education Database. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Bacterial transformation using heat Ssock and competent cells. , (2023).</li><li>JoVE Science Education Database. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> PCR: Principle, instrumentation, and applications. , (2023).</li><li>JoVE Science Education Database. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Plasmid purification. , (2023).</li><li>JoVE Science Education Database. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> DNA gel electrophoresis. , (2023).</li><li>JoVE Core Molecular Biology. Sanger/chain termination sequencing using dideoxynucleotides - Concept Available from: <a target="_blank" href="https://app.jove.com/science-education/v/12020/sanger-sequencing">https://app.jove.com/science-education/v/12020/sanger-sequencing</a> (2023)</li><li>Theillet, F. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physicochemical+properties+of+cells+and+their+effects+on+intrinsically+disordered+proteins+(IDPs).">Physicochemical properties of cells and their effects on intrinsically disordered proteins (IDPs).</a> Chem Rev. 114 (13), 6661-6714 (2014).</li><li>Brutscher, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NMR+methods+for+the+study+of+instrinsically+disordered+proteins+structure,+dynamics,+and+interactions:+General+overview+and+practical+guidelines.">NMR methods for the study of instrinsically disordered proteins structure, dynamics, and interactions: General overview and practical guidelines.</a> Adv Exp Med Biol. 870, 49-122 (2015).</li><li>Metskas, L. A., Rhoades, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+FRET+of+intrinsically+disordered+proteins.">Single-molecule FRET of intrinsically disordered proteins.</a> Annu Rev Phys Chem. 71, 391-414 (2020).</li><li>Roebroek, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+readout+of+multiple+FRET+pairs+using+photochromism.">Simultaneous readout of multiple FRET pairs using photochromism.</a> Nat Commun. 12 (1), 2005 (2021).</li><li>Algar, W. R., Hildebrandt, N., Vogel, S. S., Medintz, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FRET+as+a+biomolecular+research+tool+-+understanding+its+potential+while+avoiding+pitfalls.">FRET as a biomolecular research tool - understanding its potential while avoiding pitfalls.</a> Nat Methods. 16 (9), 815-829 (2019).</li><li>Lyon, A. S., Peeples, W. B., Rosen, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+framework+for+understanding+the+functions+of+biomolecular+condensates+across+scales.">A framework for understanding the functions of biomolecular condensates across scales.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 22 (3), 215-235 (2021).</li><li>Belott, C., Janis, B., Menze, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liquid-liquid+phase+separation+promotes+animal+desiccation+tolerance.">Liquid-liquid phase separation promotes animal desiccation tolerance.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 117 (44), 27676-27684 (2020).</li><li>Miermont, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Severe+osmotic+compression+triggers+a+slowdown+of+intracellular+signaling,+which+can+be+explained+by+molecular+crowding.">Severe osmotic compression triggers a slowdown of intracellular signaling, which can be explained by molecular crowding.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (14), 5725-5730 (2013).</li><li>Saito, H., Posas, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Response+to+hyperosmotic+stress.">Response to hyperosmotic stress.</a> Genetics. 192 (2), 289-318 (2012).</li><li>Selenko, P., Wagner, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Looking+into+live+cells+with+in-cell+NMR+spectroscopy.">Looking into live cells with in-cell NMR spectroscopy.</a> J Struct Biol. 158 (2), 244-253 (2007).</li><li>Cattani, J., Subramaniam, V., Drescher, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Room-temperature+in-cell+EPR+spectroscopy:+alpha-Synuclein+disease+variants+remain+intrinsically+disordered+in+the+cell.">Room-temperature in-cell EPR spectroscopy: alpha-Synuclein disease variants remain intrinsically disordered in the cell.</a> Phys Chem Chem Phys. 19 (28), 18147-18151 (2017).</li><li>Beveridge, R., Chappuis, Q., Macphee, C., Barran, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+spectrometry+methods+for+intrinsically+disordered+proteins.">Mass spectrometry methods for intrinsically disordered proteins.</a> Analyst. 138 (1), 32-42 (2013).</li><li>Beveridge, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ion+mobility+mass+spectrometry+uncovers+the+impact+of+the+patterning+of+oppositely+charged+residues+on+the+conformational+distributions+of+intrinsically+disordered+proteins.">Ion mobility mass spectrometry uncovers the impact of the patterning of oppositely charged residues on the conformational distributions of intrinsically disordered proteins.</a> J Am Chem Soc. 141 (12), 4908-4918 (2019).</li></ol>

Die hier vorgestellte Methode bietet eine Möglichkeit, Einblicke zu gewinnen, wie die globalen Dimensionen des Ensembles von IDRs Umweltstörungen wahrnehmen und darauf reagieren. Diese Methode beruht auf einem genetisch kodierten Konstrukt und benötigt keine zusätzlichen Komponenten außer einer plasmidstabilen Expression in Hefezellen, wodurch sie für potenzielle Anwendungen in anderen Zelltypen angepasst werden kann. Darüber hinaus ist es vielseitig einsetzbar, um andere physikalisch-chemische Störungen zu erfor...

Intrinsisch ungeordnete Regionen (IDRs) sind kritische Komponenten in zellulären Prozessen1. In Kombination mit strukturierten Domänen sind IDRs essentiell für Proteinfunktionen. Die Aminosäurezusammensetzung von IDRs ist verzerrt und wird hauptsächlich durch geladene, hydrophile und kleine Reste dargestellt. Aufgrund dieser Eigenschaft werden IDRs als Domänen mit geringer Komplexität betrachtet 2,3. Zahlreiche IDRs haben Aufmerksamkeit erregt, vor allem, weil diese Regionen eine entscheidende Rolle bei pathologischen Zuständen spielen, insbesondere bei neurodegenerativen Erkrankungen. Solche Krankheiten sind durch Selbstorganisation und anschließende extrazelluläre oder intrazelluläre Ablagerung von IDRs in Neuronen gekennzeichnet4. Beispiele für solche IDRs sind Amyloid-β (Aβ) bei der Alzheimer-Krankheit, Huntingtin (HTT) bei der Huntington-Krankheit und das TAR-DNA-bindende Protein-43 (TDP-43) und fusioniert im Sarkom (FUS) bei amyotropher Lateralsklerose und frontotemporaler Demenz4. Die Untersuchung der strukturellen Umlagerungen von IDRs im Zusammenhang mit Krankheiten wurde durch spektroskopische Methoden, einschließlich des Fluoreszenz-Resonanz-Energietransfers (FRET), erheblich verbessert.
Die hydrophile und erweiterte Natur von IDRs macht sie extrem empfindlich gegenüber Änderungen der physikalisch-chemischen Eigenschaften der Lösungsumgebung5. Der Grad, in dem das Konformationsensemble von IDRs durch die Umwelt modifiziert wird, wird als strukturelle Sensitivität bezeichnet 5,6,7. Zur Untersuchung der Konformation und Dynamik von IDRs können verschiedene Techniken verwendet werden, darunter Zirkulardichroismus (CD) und Röntgenkleinwinkelstreuung (SAXS)8,9. Leider benötigen CD und SAXS große Mengen an gereinigten Proteinen, so dass sie für Studien in Zellen nicht geeignet sind. Im Gegensatz dazu ist FRET eine Technik, die die Fluoreszenzintensität von zwei fluoreszierenden Molekülen misst, die spezifisch eine IDR markieren, was bedeutet, dass sie in komplexen Gemischen wie lebenden Zellen überwacht werden können10. Die dynamische Messung der strukturellen Empfindlichkeit von IDRs in lebenden Zellen ist notwendig, um zu verstehen, wie die Umgebung die Konformation und Funktion des ungeordneten Proteoms reguliert.
FRET ist eine leistungsstarke Methode zur Quantifizierung der strukturellen Empfindlichkeit von IDRs sowie von globulären und Multidomänenproteinen in lebenden Zellen. Die Methode erfordert ein Konstrukt, das aus einem IDR von Interesse besteht, der zwischen zwei fluoreszierenden Proteinen (FP) eingebettet ist, einem sogenannten FRET-Paar. Für dieses Protokoll empfehlen wir die Verwendung von mCerulean3 als Spender-FP und Citrin als Akzeptor-FP aufgrund ihres großen Dynamikbereichs im Vergleich zu anderen FPs, die in einer früheren Studie über die Sensitivität von IDRs berichtet wurden6. FRET wurde zuvor genutzt, um die strukturelle Empfindlichkeit einer pflanzlichen IDR in verschiedenen zellulären Kontexten zu messen6. Darüber hinaus wurde diese Technik verwendet, um die Gesamtproteindimensionen von IDRs von verschiedenen Forschungsgruppen sowohl in vitro als auch in vivo zu charakterisieren 5,11.
Hier beschreiben wir die Ensemble-FRET-Methode zur Untersuchung der strukturellen Empfindlichkeit von IDRs in lebenden Hefezellen (Saccharomyces cerevisiae). Wir zeigen repräsentative Ergebnisse, die auf einer Pflanzen-IDR namens AtLEA4-5 basieren. AtLEA4-5 ist in Lösung ungeordnet, faltet sich aber zu α-Helix, wenn in vitro makromolekulares Crowding induziert wird 12. AtLEA4-5 ist ein gutes Referenzmodell für diese Methode, da es relativ klein (158 Rückstände), ungeordnet und empfindlich gegenüber Umweltstörungen ist, wie in silico und in vitro berichtet 6,12. Die hier vorgestellte Methode kann für Hochdurchsatzansätze skaliert werden, da Hefezellen leicht zu züchten sind und die Behandlung in kleinen Volumina angewendet wird. Darüber hinaus können kleine Modifikationen des Protokolls auf andere zelluläre Systeme wie Bakterien und Pflanzenzellen angewendet werden6. Das Protokoll kann in jedem molekularbiologischen Labor durchgeführt werden, das Zugang zu einem Mikroplatten-Reader mit Fluoreszenzmodus hat, ein Gerät, das in den meisten Forschungseinrichtungen verfügbar ist.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>96-well plate</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>655096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>5040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BglII</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>R0144S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BJ5465 cells</td>
			<td>American Type Culture Collection</td>
			<td>208289</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffer MES 50 mM</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M8250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffer Tris-HCl 10 mM</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15506017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA 1 mM</td>
			<td>Merck</td>
			<td>108452</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352057</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB media</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L2897</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lithium acetate 0.1 M</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L6883</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low Melt Agarose</td>
			<td>GOLDBIO</td>
			<td>A-204-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td>eppendorf</td>
			<td>5452000010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Miniprep kit</td>
			<td>ZymoPure</td>
			<td>D4210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH 0.02 M</td>
			<td>Merck</td>
			<td>106462</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEG 3,350 40%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>1546547</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>plasmid pDRFLIP38-AtLEA4-5</td>
			<td>addgene</td>
			<td>178189</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate reader</td>
			<td>BMG LABTECH</td>
			<td>CLARIOstar Plus</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SacI</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>R3156S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Salmon sperm DNA 2 mg/mL</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15632011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SD-Ura</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Y1501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium cloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taq polymesare</td>
			<td>Promega</td>
			<td>M5123</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transiluminator</td>
			<td>Accuris instruments</td>
			<td>E4000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV-Visible spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Biomate3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>YPD media</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Y1500</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

estimation of structural sensitivity of intrinsically disordered regions in response to hyperosmotic stress in living cells using fret

Intrinsisch ungeordnete Regionen (IDRs) sind Proteindomänen, die an entscheidenden zellulären Prozessen beteiligt sind. Unter Stressbedingungen ändern sich die physikalisch-chemischen Eigenschaften der zellulären Umgebung, was sich direkt auf das Konformationsensemble der IDRs auswirkt. IDRs reagieren von Natur aus empfindlich auf Umweltstörungen. Die Untersuchung, wie die physikalisch-chemischen Eigenschaften der Zelle das Konformationsensemble von IDRs regulieren, ist für das Verständnis der Umweltkontrolle ihrer Funktion unerlässlich. Hier beschreiben wir eine schrittweise Methode zur Messung der strukturellen Sensitivität von IDRs in lebenden Saccharomyces cerevisiae-Zellen als Reaktion auf hyperosmotische Stressbedingungen. Wir stellen die Verwendung des Ensemble-Fluoreszenz-Resonanz-Energietransfers (FRET) vor, um abzuschätzen, wie sich die globalen Dimensionen von IDRs während eines fortschreitenden Anstiegs des hyperosmotischen Stresses ändern, der Zellen mit einem beliebigen Osmolyten auferlegt wird. Darüber hinaus stellen wir ein Skript zur Verarbeitung von Fluoreszenzmessungen und zum Vergleich der strukturellen Empfindlichkeit für verschiedene IDRs zur Verfügung. Durch diese Methode können Forscher wertvolle Einblicke in die Konformationsänderungen gewinnen, die IDRs im komplexen intrazellulären Milieu bei wechselnden Umgebungen erfahren.

Intrinsically disordered regions (IDRs) are critical components in cellular processes1. In combination with structured domains, IDRs are essential for protein functions. The amino acid composition of IDRs is biased, represented mainly by charged, hydrophilic, and small residues. Because of this property, IDRs are considered low complexity domains2,3. Numerous IDRs have garnered attention, primarily because these regions play a crucial role in pathological conditions, particularly neurodegenerative diseases. Such diseases are characterized by self-assembly and subsequent extracellular or intracellular deposition of IDRs in neurons4. Examples of such IDRs include amyloid-&#946;&#160;(A&#946;) in Alzheimer&#39;s disease, huntingtin (HTT) in Huntington&#39;s disease, and TAR DNA-binding protein-43 (TDP-43) and fused in sarcoma (FUS) in amyotrophic lateral sclerosis and frontotemporal dementia4. The study of the structural rearrangements of IDRs in the context of disease has been significantly enhanced by spectroscopic methods, including fluorescence resonance energy transfer (FRET).
The hydrophilic and extended nature of IDRs makes them extremely sensitive to changes in the physicochemical properties of the solution environment5. The degree by which the conformational ensemble of IDRs is modified by the environment is called structural sensitivity5,6,7. Different techniques can be used to study the conformation and dynamics of IDRs, including circular dichroism (CD) and small-angle X-ray scattering (SAXS)8,9. Unfortunately, CD and SAXS require large quantities of purified proteins, so they are not appropriate for studies in cells. In contrast, FRET is a technique that measures the fluorescence intensity of two fluorescent molecules that specifically label one IDR, meaning that they can be monitored in complex mixtures such as living cells10. Dynamically measuring the structural sensitivity of IDRs in living cells is necessary for understanding how the environment regulates the conformation and function of the disordered proteome.
FRET is a powerful method for quantifying the structural sensitivity of IDRs, as well as globular and multidomain proteins in living cells. The method requires a construct consisting of an IDR of interest sandwiched between two fluorescent proteins (FP), known as a FRET pair. For this protocol, we suggest the use of mCerulean3 as the donor FP and Citrine as the acceptor FP, because of their large dynamic range, compared to other FPs reported in a previous study about IDRs sensitivity6. FRET has previously been exploited to measure the structural sensitivity of a plant IDR in different cellular contexts6. In addition, this technique has been used to characterize overall protein dimensions of IDRs by different research groups both in vitro and in vivo5,11.
Here, we describe the ensemble FRET method for studying the structural sensitivity of IDRs in living yeast (Saccharomyces cerevisiae) cells. We show representative results that are based in a plant IDR called AtLEA4-5. AtLEA4-5 is disordered in solution, but folds into &#945;-helix when macromolecular crowding is induced in vitro12. AtLEA4-5 is a good reference model for this method because it is relatively small (158 residues), disordered and sensitive to environmental perturbation as reported in silico and in vitro6,12. The method presented here can be scaled for high throughput approaches because yeast cells are easy to grow, and the treatment is applied in small volumes. In addition, small modifications to the protocol can be applied to other cellular systems such as bacteria and plant cells6. The protocol can be performed in any molecular biology laboratory with access to a microplate reader with fluorescence mode, an equipment available in most research institutions.

Autor im Rampenlicht: Die Welt der intrinsisch ungeordneten Regionen mit zellulärer Sensorik und Reaktionen erschließen

Abschätzung der strukturellen Empfindlichkeit von intrinsisch ungeordneten Regionen als Reaktion auf hyperosmotischen Stress in lebenden Zellen mit FRET

We aim to understand how intrinsically disordered regions sense and respond to changes in the physical chemical properties of the environment. We combine biophysical, biochemical, genetic, and cell biology techniques to monitor how the structural ensemble of disordered regions change in living cells. Protein biophysics techniques are currently used to study the confirmation of IVRs.These include nuclear magnetic resonance, circular dichroism, small angle x-ray scattering, and FRET. Most of these techniques can only be used in vitro. Studying the confirmation of IVRs in a cellular context is challenging with high cost and time consuming techniques.We provide an alternative to overcome these challenges. Our protocol can monitor the confirmation of IVRs in an easy, fast, and reproducible way, complementing other in vitro methods. Our findings offered an understanding of the molecular mechanisms underlying the structural sensitivity of IVRs under stress.This allows the use of IVRs as somatic biosensors. The precise tracking of the cellular environment will contribute to a more nuanced understanding of life's fundamental processes. Our research has led to questions about the determinants of a structural sensitivity in intrinsically disordered regions, its relevance to IVR's functions, and the environmental factors influencing these sensitivity.

Nach der Transformation von Hefezellen mit dem pDRFLIP38-AtLEA4-5-Plasmid wurde die Fluoreszenz der positiven Transformanten mit einem Blaulicht-Transilluminator und einem Filter beobachtet (Abbildung 1). Die Vorbereitung der verschiedenen Lösungen zur Induktion von hyperosmotischem Stress ist zeitaufwändig, daher empfehlen wir, der 96-Well-Vorlage in Abbildung 2 zu folgen. Unmittelbar nach der hyperosmotischen Stressbehandlung mit unterschiedlichen Konzentrat...

Watch this Scientific Journal Video about Estimation of Structural Sensitivity of Intrinsically Disordered Regions in Response to Hyperosmotic Stress in Living Cells Using FRET at JoVE.com

Intrinsisch ungeordnete Regionen (IDRs) sind flexible Proteindomänen, die ihre Konformation als Reaktion auf Umweltveränderungen verändern. Der Ensemble-Fluoreszenz-Resonanz-Energietransfer (FRET) kann Proteindimensionen unter verschiedenen Bedingungen abschätzen. Wir präsentieren einen FRET-Ansatz zur Bewertung der strukturellen IDR-Sensitivität in lebenden Saccharomyces cerevisiae-Zellen unter hyperosmotischem Stress.

Intrinsically disordered regions (IDRs) are protein domains that participate in crucial cellular processes. During stress conditions, the physicochemical ...

Unser Ziel ist es zu verstehen, wie intrinsisch ungeordnete Regionen Veränderungen der physikalisch-chemischen Eigenschaften der Umwelt wahrnehmen und darauf reagieren. Wir kombinieren biophysikalische, biochemische, genetische und zellbiologische Techniken, um zu überwachen, wie sich das strukturelle Ensemble ungeordneter Regionen in lebenden Zellen verändert. Proteinbiophysikalische Techniken werden derzeit verwendet, um die Bestätigung von IVRs zu untersuchen.Dazu gehören Kernspinresonanz, Zirkulardichroismus, Kleinwinkel-Röntgenstreuung und FRET. Die meisten dieser Techniken können nur in vitro angewendet werden. Die Untersuchung der Bestätigung von IVRs in einem zellulären Kontext ist eine Herausforderung mit hohen Kosten und zeitaufwändigen Techniken.Wir bieten eine Alternative, um diese Herausforderungen zu meistern. Unser Protokoll kann die Bestätigung von IVRs auf einfache, schnelle und reproduzierbare Weise überwachen und andere In-vitro-Methoden ergänzen. Unsere Ergebnisse boten ein Verständnis der molekularen Mechanismen, die der strukturellen Empfindlichkeit von IVRs unter Stress zugrunde liegen.Dies ermöglicht den Einsatz von IVRs als somatische Biosensoren. Die genaue Verfolgung der zellulären Umgebung wird zu einem differenzierteren Verständnis der grundlegenden Prozesse des Lebens beitragen. Unsere Forschung hat zu Fragen zu den Determinanten einer strukturellen Sensitivität in intrinsisch ungeordneten Regionen, ihrer Relevanz für die Funktionen von IVR und den Umweltfaktoren, die diese Sensitivität beeinflussen, geführt.

estimation-structural-sensitivity-intrinsically-disordered-regions

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Estimation of Structural Sensitivity of Intrinsically Disordered Regions in Response to Hyperosmotic Stress in Living Cells Using FRET

Intrinsically disordered regions (IDRs) are protein domains that participate in crucial cellular processes. During stress conditions, the physicochemical properties of the cellular environment change, directly impacting the conformational ensemble of IDRs. IDRs are inherently sensitive to environmental perturbations. Studying how the physicochemical properties of the cell regulate the conformational ensemble of IDRs is essential for understanding the environmental control of their function. Here, we describe a step-by-step method for measuring the structural sensitivity of IDRs in living Saccharomyces cerevisiae cells in response to hyperosmotic stress conditions. We present the use of ensemble fluorescence resonance energy transfer (FRET) to estimate how the global dimensions of IDRs change during a progressive increase of hyperosmotic stress imposed on cells with any osmolyte. In addition, we provide a script for processing fluorescence measurements and comparing structural sensitivity for different IDRs. By following this method, researchers can obtain valuable insights into the conformational changes that IDRs undergo in the complex intracellular milieu upon changing environments.

Intrinsically disordered regions (IDRs) are flexible protein domains that modify their conformation in response to environmental changes. Ensemble fluorescence resonance energy transfer (FRET) can estimate protein dimensions under different conditions. We present a FRET approach to assess IDR structural sensitivity in living Saccharomyces cerevisiae cells under hyperosmotic stress.