Name: מחבר זרקור: פתיחת העולם של אזורים לא מסודרים במהותם באמצעות חישה תאית ותגובות
Uploaded: 2024-01-12T14:50:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Estimation of Structural Sensitivity of Intrinsically Disordered Regions in Response to Hyperosmotic Stress in Living Cells Using FRET at JoVE.com

אנו מודים לחברי מעבדת Cuevas-Velazquez על הסקירה הביקורתית של כתב היד. עבודה זו נתמכה על ידי Programa de Apoyo a Proyectos de Investigación e Innovación Tecnológica, Dirección General de Asuntos del Personal Académico, Universidad Nacional Autónoma de México (UNAM-PAPIIT) פרויקט מספר IA203422; Consejo Nacional de Humanidades, Ciencias y Tecnología (CONAHCYT), פרויקט מספר 252952; ו- Programa de Apoyo a la Investigación y el Posgrado, Facultad de Química, Universidad Nacional Autónoma de México, Grant 5000-9182. CET (CVU 1083636) ו- CAPD (CVU 1269643) מודים ל- CONAHCYT על מלגת M.Sc שלהם.

1. מבנה פלסמיד
<ol><li>הגבר את מסגרת הקריאה הפתוחה (ORF) המקודדת עבור IDR הרצוי על ידי תגובת שרשרת פולימראז (PCR). אל תכלול את קודון העצירה מכיוון שה- ORF יהיה מוקף בגנים המקודדים את החלבונים הפלואורסצנטיים. עבור ההגברה, עצבו פריימרים עם אתרי הגבלה SacI (5') ו-BglII (3'). הערה: עבור מקטע התו...

ניתוח FRET של רגישות מבנית IDR לחקר עקה היפראוסמוטית בשמרים

<ol>
	<li>Wright, P. E., Dyson, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrinsically+disordered+proteins+in+cellular+signalling+and+regulation.">Intrinsically disordered proteins in cellular signalling and regulation.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 16 (1), 18-29 (2015).</li><li>Covarrubias, A. A., Romero-P&#233;rez, P. S., Cuevas-Velazquez, C. L., Rend&#243;n-Luna, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+functional+diversity+of+structural+disorder+in+plant+proteins.">The functional diversity of structural disorder in plant proteins.</a> Arch Biochem Biophys. 680, 108229 (2019).</li><li>Ahmed, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+intrinsically+disordered+regions+in+proteins+informed+by+human+genetic+diversity.">Characterization of intrinsically disordered regions in proteins informed by human genetic diversity.</a> PLoS Comput Biol. 18 (3), e1009911 (2022).</li><li>Birol, M., Melo, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Untangling+the+conformational+polymorphism+of+disordered+proteins+associated+with+neurodegeneration+at+the+single-molecule+level.">Untangling the conformational polymorphism of disordered proteins associated with neurodegeneration at the single-molecule level.</a> Front Mol Neurosci. 12, 309 (2019).</li><li>Moses, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revealing+the+hidden+sensitivity+of+intrinsically+disordered+proteins+to+their+chemical+environment.">Revealing the hidden sensitivity of intrinsically disordered proteins to their chemical environment.</a> J Phys Chem Lett. 11 (23), 10131-10136 (2020).</li><li>Cuevas-Velazquez, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrinsically+disordered+protein+biosensor+tracks+the+physical-chemical+effects+of+osmotic+stress+on+cells.">Intrinsically disordered protein biosensor tracks the physical-chemical effects of osmotic stress on cells.</a> Nat Commun. 12 (1), 5438 (2021).</li><li>Holehouse, A. S., Sukenik, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlling+structural+bias+in+intrinsically+disordered+proteins+using+solution+space+scanning.">Controlling structural bias in intrinsically disordered proteins using solution space scanning.</a> J Chem Theory Comput. 16 (3), 1794-1805 (2020).</li><li>Martin, E. W., Hopkins, J. B., Mittag, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small-angle+X-ray+scattering+experiments+of+monodisperse+intrinsically+disordered+protein+samples+close+to+the+solubility+limit.">Small-angle X-ray scattering experiments of monodisperse intrinsically disordered protein samples close to the solubility limit.</a> Methods Enzymol. 646, 185-222 (2021).</li><li>Miles, A. J., Drew, E. D., Wallace, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DichroIDP:+a+method+for+analyses+of+intrinsically+disordered+proteins+using+circular+dichroism+spectroscopy.">DichroIDP: a method for analyses of intrinsically disordered proteins using circular dichroism spectroscopy.</a> Commun Biol. 6 (1), 823 (2023).</li><li>Kaminski, C. F., Rees, E. J., Schierle, G. S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+quantitative+protocol+for+intensity-based+live+cell+FRET+imaging.">A quantitative protocol for intensity-based live cell FRET imaging.</a> Method Mol Biol. 1076, 445-454 (2014).</li><li>Moses, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+biases+in+disordered+proteins+are+prevalent+in+the+cell.">Structural biases in disordered proteins are prevalent in the cell.</a> bioRxiv. , (2022).</li><li>Cuevas-Velazquez, C. L., Saab-Rinc&#243;n, G., Reyes, J. L., Covarrubias, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Unstructured+N-terminal+Region+of+Arabidopsis+Group+4+Late+Embryogenesis+Abundant+(LEA)+Proteins+Is+Required+for+Folding+and+for+Chaperone-like+Activity+under+Water+Deficit.">The Unstructured N-terminal Region of Arabidopsis Group 4 Late Embryogenesis Abundant (LEA) Proteins Is Required for Folding and for Chaperone-like Activity under Water Deficit.</a> J Biol Chem. 291 (20), 10893-10903 (2016).</li><li>JoVE Science Education Database. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Restriction enzyme digests. , (2023).</li><li>JoVE Science Education Database. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Gel purification. , (2023).</li><li>JoVE Science Education Database. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> DNA ligation reactions. , (2023).</li><li>JoVE Science Education Database. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Bacterial transformation using heat Ssock and competent cells. , (2023).</li><li>JoVE Science Education Database. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> PCR: Principle, instrumentation, and applications. , (2023).</li><li>JoVE Science Education Database. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Plasmid purification. , (2023).</li><li>JoVE Science Education Database. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> DNA gel electrophoresis. , (2023).</li><li>JoVE Core Molecular Biology. Sanger/chain termination sequencing using dideoxynucleotides - Concept Available from: <a target="_blank" href="https://app.jove.com/science-education/v/12020/sanger-sequencing">https://app.jove.com/science-education/v/12020/sanger-sequencing</a> (2023)</li><li>Theillet, F. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physicochemical+properties+of+cells+and+their+effects+on+intrinsically+disordered+proteins+(IDPs).">Physicochemical properties of cells and their effects on intrinsically disordered proteins (IDPs).</a> Chem Rev. 114 (13), 6661-6714 (2014).</li><li>Brutscher, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NMR+methods+for+the+study+of+instrinsically+disordered+proteins+structure,+dynamics,+and+interactions:+General+overview+and+practical+guidelines.">NMR methods for the study of instrinsically disordered proteins structure, dynamics, and interactions: General overview and practical guidelines.</a> Adv Exp Med Biol. 870, 49-122 (2015).</li><li>Metskas, L. A., Rhoades, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+FRET+of+intrinsically+disordered+proteins.">Single-molecule FRET of intrinsically disordered proteins.</a> Annu Rev Phys Chem. 71, 391-414 (2020).</li><li>Roebroek, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+readout+of+multiple+FRET+pairs+using+photochromism.">Simultaneous readout of multiple FRET pairs using photochromism.</a> Nat Commun. 12 (1), 2005 (2021).</li><li>Algar, W. R., Hildebrandt, N., Vogel, S. S., Medintz, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FRET+as+a+biomolecular+research+tool+-+understanding+its+potential+while+avoiding+pitfalls.">FRET as a biomolecular research tool - understanding its potential while avoiding pitfalls.</a> Nat Methods. 16 (9), 815-829 (2019).</li><li>Lyon, A. S., Peeples, W. B., Rosen, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+framework+for+understanding+the+functions+of+biomolecular+condensates+across+scales.">A framework for understanding the functions of biomolecular condensates across scales.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 22 (3), 215-235 (2021).</li><li>Belott, C., Janis, B., Menze, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liquid-liquid+phase+separation+promotes+animal+desiccation+tolerance.">Liquid-liquid phase separation promotes animal desiccation tolerance.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 117 (44), 27676-27684 (2020).</li><li>Miermont, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Severe+osmotic+compression+triggers+a+slowdown+of+intracellular+signaling,+which+can+be+explained+by+molecular+crowding.">Severe osmotic compression triggers a slowdown of intracellular signaling, which can be explained by molecular crowding.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (14), 5725-5730 (2013).</li><li>Saito, H., Posas, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Response+to+hyperosmotic+stress.">Response to hyperosmotic stress.</a> Genetics. 192 (2), 289-318 (2012).</li><li>Selenko, P., Wagner, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Looking+into+live+cells+with+in-cell+NMR+spectroscopy.">Looking into live cells with in-cell NMR spectroscopy.</a> J Struct Biol. 158 (2), 244-253 (2007).</li><li>Cattani, J., Subramaniam, V., Drescher, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Room-temperature+in-cell+EPR+spectroscopy:+alpha-Synuclein+disease+variants+remain+intrinsically+disordered+in+the+cell.">Room-temperature in-cell EPR spectroscopy: alpha-Synuclein disease variants remain intrinsically disordered in the cell.</a> Phys Chem Chem Phys. 19 (28), 18147-18151 (2017).</li><li>Beveridge, R., Chappuis, Q., Macphee, C., Barran, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+spectrometry+methods+for+intrinsically+disordered+proteins.">Mass spectrometry methods for intrinsically disordered proteins.</a> Analyst. 138 (1), 32-42 (2013).</li><li>Beveridge, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ion+mobility+mass+spectrometry+uncovers+the+impact+of+the+patterning+of+oppositely+charged+residues+on+the+conformational+distributions+of+intrinsically+disordered+proteins.">Ion mobility mass spectrometry uncovers the impact of the patterning of oppositely charged residues on the conformational distributions of intrinsically disordered proteins.</a> J Am Chem Soc. 141 (12), 4908-4918 (2019).</li></ol>

השיטה המוצגת כאן מציעה דרך לקבל תובנות כיצד הממדים הגלובליים של אנסמבל ה- IDR חשים ומגיבים להפרעות סביבתיות. שיטה זו מסתמכת על מבנה מקודד גנטית ואינה דורשת רכיבים נוספים מעבר לביטוי יציב של פלסמיד בתאי שמרים, מה שהופך אותה לניתנת להתאמה ליישומים פוטנציאליים בסוגי תאים אחרים. יתר על כן, הוא ר...

אזורים בעלי אי-סדר פנימי (IDR) הם מרכיבים קריטיים בתהליכים תאיים1. בשילוב עם תחומים מובנים, IDR חיוניים לתפקודי חלבון. הרכב חומצות האמינו של IDR מוטה, ומיוצג בעיקר על ידי שאריות טעונות, הידרופיליות וקטנות. בגלל מאפיין זה, IDR נחשבים לתחומים בעלי מורכבות נמוכה 2,3. IDR רבים משכו תשומת לב, בעיקר משום שאזורים אלה ממלאים תפקיד מכריע במצבים פתולוגיים, במיוחד מחלות נוירודגנרטיביות. מחלות כאלה מאופיינות על ידי הרכבה עצמית ולאחר מכן תצהיר חוץ תאי או תוך תאי של IDR בנוירונים4. דוגמאות ל-IDR כאלה כוללות β עמילואיד (Aβ) במחלת אלצהיימר, הנטינגטין (HTT) במחלת הנטינגטון, וחלבון קושר דנ"א-TAR -43 (TDP-43) והתמזגו בסרקומה (FUS) בטרשת אמיוטרופית צידית ודמנציה פרונטוטמפורלית4. המחקר של סידורים מבניים מחדש של IDR בהקשר של מחלה השתפר באופן משמעותי על ידי שיטות ספקטרוסקופיות, כולל העברת אנרגיה תהודה פלואורסצנטית (FRET).
האופי ההידרופילי והמורחב של IDR הופך אותם לרגישים ביותר לשינויים בתכונות הפיזיקוכימיות של סביבת התמיסה5. המידה שבה ההרכב הקונפורמטיבי של IDR משתנה על ידי הסביבה נקראת רגישות מבנית 5,6,7. ניתן להשתמש בטכניקות שונות כדי לחקור את הקונפורמציה והדינמיקה של IDR, כולל דיכרואיזם מעגלי (CD) ופיזור קרני רנטגן בזווית קטנה (SAXS)8,9. למרבה הצער, CD ו- SAXS דורשים כמויות גדולות של חלבונים מטוהרים, ולכן הם אינם מתאימים למחקרים בתאים. לעומת זאת, FRET היא טכניקה המודדת את עוצמת הפלואורסצנטיות של שתי מולקולות פלואורסצנטיות המסמנות באופן ספציפי IDR אחד, כלומר ניתן לנטר אותן בתערובות מורכבות כגון תאים חיים10. מדידה דינמית של הרגישות המבנית של IDR בתאים חיים נחוצה להבנת האופן שבו הסביבה מווסתת את הקונפורמציה והתפקוד של הפרוטאום הלא מסודר.
FRET היא שיטה רבת עוצמה לכימות הרגישות המבנית של IDRs, כמו גם חלבונים כדוריים ורב-תחומיים בתאים חיים. השיטה דורשת מבנה המורכב מ-IDR של עניין הדחוק בין שני חלבונים פלואורסצנטיים (FP), המכונה זוג FET. עבור פרוטוקול זה, אנו מציעים להשתמש ב- mCerulean3 כ- FP התורם ובסיטרין כ- FP המקבל, בגלל הטווח הדינמי הגדול שלהם, בהשוואה ל- FPs אחרים שדווחו במחקר קודם על רגישות IDR6. FRET נוצל בעבר למדידת הרגישות המבנית של צמח בהקשרים תאיים שונים6. בנוסף, טכניקה זו שימשה לאפיון ממדי החלבון הכוללים של IDR על ידי קבוצות מחקר שונות הן in vitro והן in vivo 5,11.
במאמר זה נתאר את שיטת FRET לחקר הרגישות המבנית של IDR בתאי שמרים חיים (Saccharomyces cerevisiae). אנו מציגים תוצאות מייצגות המבוססות על מפעל IDR בשם AtLEA4-5. AtLEA4-5 אינו מסודר בתמיסה, אך מתקפל לתוך סליל α כאשר נוצרת צפיפות מקרומולקולרית במבחנה12. AtLEA4-5 הוא מודל ייחוס טוב לשיטה זו מכיוון שהוא קטן יחסית (158 שאריות), לא מסודר ורגיש להפרעות סביבתיות כפי שדווח בסיליקו ובמבחנה 6,12. השיטה המוצגת כאן ניתנת להרחבה עבור גישות תפוקה גבוהה מכיוון שקל לגדל תאי שמרים, והטיפול מיושם בכמויות קטנות. בנוסף, שינויים קטנים בפרוטוקול יכולים להיות מיושמים על מערכות תאיות אחרות כגון חיידקים ותאי צמח6. הפרוטוקול יכול להתבצע בכל מעבדה לביולוגיה מולקולרית עם גישה לקורא מיקרו-צלחות עם מצב פלואורסצנטי, ציוד הזמין ברוב מוסדות המחקר.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>96-well plate</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>655096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>5040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BglII</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>R0144S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BJ5465 cells</td>
			<td>American Type Culture Collection</td>
			<td>208289</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffer MES 50 mM</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M8250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffer Tris-HCl 10 mM</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15506017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA 1 mM</td>
			<td>Merck</td>
			<td>108452</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352057</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB media</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L2897</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lithium acetate 0.1 M</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L6883</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low Melt Agarose</td>
			<td>GOLDBIO</td>
			<td>A-204-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td>eppendorf</td>
			<td>5452000010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Miniprep kit</td>
			<td>ZymoPure</td>
			<td>D4210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH 0.02 M</td>
			<td>Merck</td>
			<td>106462</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEG 3,350 40%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>1546547</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>plasmid pDRFLIP38-AtLEA4-5</td>
			<td>addgene</td>
			<td>178189</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate reader</td>
			<td>BMG LABTECH</td>
			<td>CLARIOstar Plus</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SacI</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>R3156S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Salmon sperm DNA 2 mg/mL</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15632011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SD-Ura</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Y1501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium cloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taq polymesare</td>
			<td>Promega</td>
			<td>M5123</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transiluminator</td>
			<td>Accuris instruments</td>
			<td>E4000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV-Visible spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Biomate3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>YPD media</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Y1500</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

estimation of structural sensitivity of intrinsically disordered regions in response to hyperosmotic stress in living cells using fret

אזורים בעלי הפרעה פנימית (IDR) הם תחומים חלבוניים המשתתפים בתהליכים תאיים חיוניים. במהלך תנאי עקה, התכונות הפיזיקוכימיות של הסביבה התאית משתנות, ומשפיעות ישירות על ההרכב הקונפורמטיבי של IDRs. IDR רגישים מטבעם להפרעות סביבתיות. חקר האופן שבו התכונות הפיזיקוכימיות של התא מווסתות את ההרכב הקונפורמטיבי של IDR חיוני להבנת הבקרה הסביבתית של תפקודם. במאמר זה אנו מתארים שיטה שלב אחר שלב למדידת הרגישות המבנית של IDR בתאי Saccharomyces cerevisiae חיים בתגובה לתנאי עקה היפראוסמוטיים. אנו מציגים את השימוש בהעברת אנרגיית תהודה פלואורסצנטית (FRET) כדי להעריך כיצד הממדים הגלובליים של IDR משתנים במהלך עלייה הדרגתית של לחץ היפראוסמוטי המוטל על תאים עם אוסמוליט כלשהו. בנוסף, אנו מספקים סקריפט לעיבוד מדידות פלואורסצנטיות והשוואת רגישות מבנית עבור IDR שונים. על ידי ביצוע שיטה זו, חוקרים יכולים לקבל תובנות חשובות לגבי השינויים הקונפורמטיביים שעוברים IDR בסביבה התוך-תאית המורכבת בסביבות משתנות.

Intrinsically disordered regions (IDRs) are critical components in cellular processes1. In combination with structured domains, IDRs are essential for protein functions. The amino acid composition of IDRs is biased, represented mainly by charged, hydrophilic, and small residues. Because of this property, IDRs are considered low complexity domains2,3. Numerous IDRs have garnered attention, primarily because these regions play a crucial role in pathological conditions, particularly neurodegenerative diseases. Such diseases are characterized by self-assembly and subsequent extracellular or intracellular deposition of IDRs in neurons4. Examples of such IDRs include amyloid-&#946;&#160;(A&#946;) in Alzheimer&#39;s disease, huntingtin (HTT) in Huntington&#39;s disease, and TAR DNA-binding protein-43 (TDP-43) and fused in sarcoma (FUS) in amyotrophic lateral sclerosis and frontotemporal dementia4. The study of the structural rearrangements of IDRs in the context of disease has been significantly enhanced by spectroscopic methods, including fluorescence resonance energy transfer (FRET).
The hydrophilic and extended nature of IDRs makes them extremely sensitive to changes in the physicochemical properties of the solution environment5. The degree by which the conformational ensemble of IDRs is modified by the environment is called structural sensitivity5,6,7. Different techniques can be used to study the conformation and dynamics of IDRs, including circular dichroism (CD) and small-angle X-ray scattering (SAXS)8,9. Unfortunately, CD and SAXS require large quantities of purified proteins, so they are not appropriate for studies in cells. In contrast, FRET is a technique that measures the fluorescence intensity of two fluorescent molecules that specifically label one IDR, meaning that they can be monitored in complex mixtures such as living cells10. Dynamically measuring the structural sensitivity of IDRs in living cells is necessary for understanding how the environment regulates the conformation and function of the disordered proteome.
FRET is a powerful method for quantifying the structural sensitivity of IDRs, as well as globular and multidomain proteins in living cells. The method requires a construct consisting of an IDR of interest sandwiched between two fluorescent proteins (FP), known as a FRET pair. For this protocol, we suggest the use of mCerulean3 as the donor FP and Citrine as the acceptor FP, because of their large dynamic range, compared to other FPs reported in a previous study about IDRs sensitivity6. FRET has previously been exploited to measure the structural sensitivity of a plant IDR in different cellular contexts6. In addition, this technique has been used to characterize overall protein dimensions of IDRs by different research groups both in vitro and in vivo5,11.
Here, we describe the ensemble FRET method for studying the structural sensitivity of IDRs in living yeast (Saccharomyces cerevisiae) cells. We show representative results that are based in a plant IDR called AtLEA4-5. AtLEA4-5 is disordered in solution, but folds into &#945;-helix when macromolecular crowding is induced in vitro12. AtLEA4-5 is a good reference model for this method because it is relatively small (158 residues), disordered and sensitive to environmental perturbation as reported in silico and in vitro6,12. The method presented here can be scaled for high throughput approaches because yeast cells are easy to grow, and the treatment is applied in small volumes. In addition, small modifications to the protocol can be applied to other cellular systems such as bacteria and plant cells6. The protocol can be performed in any molecular biology laboratory with access to a microplate reader with fluorescence mode, an equipment available in most research institutions.

מחבר זרקור: פתיחת העולם של אזורים לא מסודרים במהותם באמצעות חישה תאית ותגובות

הערכת רגישות מבנית של אזורים לא מסודרים במהותם בתגובה לעקה היפראוסמוטית בתאים חיים באמצעות FRET

We aim to understand how intrinsically disordered regions sense and respond to changes in the physical chemical properties of the environment. We combine biophysical, biochemical, genetic, and cell biology techniques to monitor how the structural ensemble of disordered regions change in living cells. Protein biophysics techniques are currently used to study the confirmation of IVRs.These include nuclear magnetic resonance, circular dichroism, small angle x-ray scattering, and FRET. Most of these techniques can only be used in vitro. Studying the confirmation of IVRs in a cellular context is challenging with high cost and time consuming techniques.We provide an alternative to overcome these challenges. Our protocol can monitor the confirmation of IVRs in an easy, fast, and reproducible way, complementing other in vitro methods. Our findings offered an understanding of the molecular mechanisms underlying the structural sensitivity of IVRs under stress.This allows the use of IVRs as somatic biosensors. The precise tracking of the cellular environment will contribute to a more nuanced understanding of life's fundamental processes. Our research has led to questions about the determinants of a structural sensitivity in intrinsically disordered regions, its relevance to IVR's functions, and the environmental factors influencing these sensitivity.

לאחר התמרת תאי שמרים עם פלסמיד pDRFLIP38-AtLEA4-5, נצפתה הפלואורסצנטיות של הטרנספורמנטים החיוביים באמצעות טרנסילטור אור כחול ומסנן (איור 1). הכנת הפתרונות השונים לגרימת עקה היפראוסמוטית גוזלת זמן, ולכן אנו מציעים לעקוב אחר תבנית 96 הקידוחים באיור 2. מיד לאחר הטיפול ב...

Watch this Scientific Journal Video about Estimation of Structural Sensitivity of Intrinsically Disordered Regions in Response to Hyperosmotic Stress in Living Cells Using FRET at JoVE.com

אזורים לא מסודרים מהותיים (IDR) הם תחומי חלבון גמישים המשנים את הקונפורמציה שלהם בתגובה לשינויים סביבתיים. Ensemble Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) יכול להעריך את ממדי החלבונים בתנאים שונים. אנו מציגים גישת FRET להערכת רגישות מבנית IDR בתאי Saccharomyces cerevisiae חיים תחת לחץ היפראוסמוטי.

Intrinsically disordered regions (IDRs) are protein domains that participate in crucial cellular processes. During stress conditions, the physicochemical ...

אנו שואפים להבין כיצד אזורים בעלי אי-סדר מהותי חשים ומגיבים לשינויים בתכונות הכימיות הפיזיקליות של הסביבה. אנו משלבים טכניקות ביופיזיקליות, ביוכימיות, גנטיות וביולוגיה של התא כדי לעקוב אחר האופן שבו ההרכב המבני של אזורים לא מסודרים משתנה בתאים חיים. טכניקות ביופיזיקה של חלבונים משמשות כיום לחקר האישור של IVRs.אלה כוללים תהודה מגנטית גרעינית, דיכרואיזם מעגלי, פיזור קרני רנטגן בזווית קטנה ו- FRET. רוב הטכניקות הללו ניתן להשתמש רק במבחנה. לימוד האישור של IVR בהקשר תאי הוא מאתגר עם עלויות גבוהות וטכניקות גוזלות זמן.אנו מספקים אלטרנטיבה להתגבר על אתגרים אלה. הפרוטוקול שלנו יכול לפקח על אישור IVR בצורה קלה, מהירה וניתנת לשחזור, ומשלים שיטות חוץ גופיות אחרות. הממצאים שלנו הציעו הבנה של המנגנונים המולקולריים העומדים בבסיס הרגישות המבנית של IVR תחת לחץ.זה מאפשר שימוש ב- IVR כחיישנים ביולוגיים סומטיים. המעקב המדויק אחר הסביבה התאית יתרום להבנה מעמיקה יותר של תהליכי היסוד של החיים. המחקר שלנו הוביל לשאלות לגבי הגורמים הקובעים רגישות מבנית באזורים לא מסודרים במהותם, הרלוונטיות שלה לתפקודי IVR, והגורמים הסביבתיים המשפיעים על רגישות זו.

estimation-structural-sensitivity-intrinsically-disordered-regions

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Estimation of Structural Sensitivity of Intrinsically Disordered Regions in Response to Hyperosmotic Stress in Living Cells Using FRET

Intrinsically disordered regions (IDRs) are protein domains that participate in crucial cellular processes. During stress conditions, the physicochemical properties of the cellular environment change, directly impacting the conformational ensemble of IDRs. IDRs are inherently sensitive to environmental perturbations. Studying how the physicochemical properties of the cell regulate the conformational ensemble of IDRs is essential for understanding the environmental control of their function. Here, we describe a step-by-step method for measuring the structural sensitivity of IDRs in living Saccharomyces cerevisiae cells in response to hyperosmotic stress conditions. We present the use of ensemble fluorescence resonance energy transfer (FRET) to estimate how the global dimensions of IDRs change during a progressive increase of hyperosmotic stress imposed on cells with any osmolyte. In addition, we provide a script for processing fluorescence measurements and comparing structural sensitivity for different IDRs. By following this method, researchers can obtain valuable insights into the conformational changes that IDRs undergo in the complex intracellular milieu upon changing environments.

Intrinsically disordered regions (IDRs) are flexible protein domains that modify their conformation in response to environmental changes. Ensemble fluorescence resonance energy transfer (FRET) can estimate protein dimensions under different conditions. We present a FRET approach to assess IDR structural sensitivity in living Saccharomyces cerevisiae cells under hyperosmotic stress.