Name: 著者スポットライト:細胞センシングと応答による本質的に不秩序な領域の世界を解き放つ
Uploaded: 2024-01-12T14:50:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Estimation of Structural Sensitivity of Intrinsically Disordered Regions in Response to Hyperosmotic Stress in Living Cells Using FRET at JoVE.com

Cuevas-Velazquez研究室のメンバーには、原稿の批判的なレビューに感謝します。この研究は、Programa de Apoyo a Proyectos de Investigación e Innovación Tecnológica、Dirección General de Asuntos del Personal Académico、Universidad Nacional Autónoma de México(UNAM-PAPIIT)プロジェクト番号IA203422の支援を受けました。Consejo Nacional de Humanidades, Ciencias y Tecnología (CONAHCYT), プロジェクト番号 252952;Programa de Apoyo a la Investigación y el Posgrado, Facultad de Química, Universidad Nacional Autónoma de México, Grant 5000-9182.CET(CVU 1083636)およびCAPD(CVU 1269643)は、CONAHCYTの M.Sc 奨学金を認めています。

1. プラスミドコンストラクト
<ol><li>ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)によって目的のIDRをコードするオープンリーディングフレーム(ORF)を増幅します。終止コドンは、蛍光タンパク質をコードする遺伝子に挟まれるため、含めないでください。増幅には、 SacI(5')および BglII(3')の制限部位を持つプライマーを設計します。 注:代表的な結果のセクションでは、選択したIDR?...

酵母の高浸透圧ストレス研究のためのIDR構造感度のFRET解析

<ol>
	<li>Wright, P. E., Dyson, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrinsically+disordered+proteins+in+cellular+signalling+and+regulation.">Intrinsically disordered proteins in cellular signalling and regulation.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 16 (1), 18-29 (2015).</li><li>Covarrubias, A. A., Romero-P&#233;rez, P. S., Cuevas-Velazquez, C. L., Rend&#243;n-Luna, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+functional+diversity+of+structural+disorder+in+plant+proteins.">The functional diversity of structural disorder in plant proteins.</a> Arch Biochem Biophys. 680, 108229 (2019).</li><li>Ahmed, S. 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L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrinsically+disordered+protein+biosensor+tracks+the+physical-chemical+effects+of+osmotic+stress+on+cells.">Intrinsically disordered protein biosensor tracks the physical-chemical effects of osmotic stress on cells.</a> Nat Commun. 12 (1), 5438 (2021).</li><li>Holehouse, A. S., Sukenik, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlling+structural+bias+in+intrinsically+disordered+proteins+using+solution+space+scanning.">Controlling structural bias in intrinsically disordered proteins using solution space scanning.</a> J Chem Theory Comput. 16 (3), 1794-1805 (2020).</li><li>Martin, E. W., Hopkins, J. B., Mittag, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small-angle+X-ray+scattering+experiments+of+monodisperse+intrinsically+disordered+protein+samples+close+to+the+solubility+limit.">Small-angle X-ray scattering experiments of monodisperse intrinsically disordered protein samples close to the solubility limit.</a> Methods Enzymol. 646, 185-222 (2021).</li><li>Miles, A. J., Drew, E. D., Wallace, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DichroIDP:+a+method+for+analyses+of+intrinsically+disordered+proteins+using+circular+dichroism+spectroscopy.">DichroIDP: a method for analyses of intrinsically disordered proteins using circular dichroism spectroscopy.</a> Commun Biol. 6 (1), 823 (2023).</li><li>Kaminski, C. F., Rees, E. J., Schierle, G. S. 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A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Unstructured+N-terminal+Region+of+Arabidopsis+Group+4+Late+Embryogenesis+Abundant+(LEA)+Proteins+Is+Required+for+Folding+and+for+Chaperone-like+Activity+under+Water+Deficit.">The Unstructured N-terminal Region of Arabidopsis Group 4 Late Embryogenesis Abundant (LEA) Proteins Is Required for Folding and for Chaperone-like Activity under Water Deficit.</a> J Biol Chem. 291 (20), 10893-10903 (2016).</li><li>JoVE Science Education Database. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Restriction enzyme digests. , (2023).</li><li>JoVE Science Education Database. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Gel purification. , (2023).</li><li>JoVE Science Education Database. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> DNA ligation reactions. , (2023).</li><li>JoVE Science Education Database. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Bacterial transformation using heat Ssock and competent cells. , (2023).</li><li>JoVE Science Education Database. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> PCR: Principle, instrumentation, and applications. , (2023).</li><li>JoVE Science Education Database. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Plasmid purification. , (2023).</li><li>JoVE Science Education Database. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> DNA gel electrophoresis. , (2023).</li><li>JoVE Core Molecular Biology. Sanger/chain termination sequencing using dideoxynucleotides - Concept Available from: <a target="_blank" href="https://app.jove.com/science-education/v/12020/sanger-sequencing">https://app.jove.com/science-education/v/12020/sanger-sequencing</a> (2023)</li><li>Theillet, F. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physicochemical+properties+of+cells+and+their+effects+on+intrinsically+disordered+proteins+(IDPs).">Physicochemical properties of cells and their effects on intrinsically disordered proteins (IDPs).</a> Chem Rev. 114 (13), 6661-6714 (2014).</li><li>Brutscher, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NMR+methods+for+the+study+of+instrinsically+disordered+proteins+structure,+dynamics,+and+interactions:+General+overview+and+practical+guidelines.">NMR methods for the study of instrinsically disordered proteins structure, dynamics, and interactions: General overview and practical guidelines.</a> Adv Exp Med Biol. 870, 49-122 (2015).</li><li>Metskas, L. A., Rhoades, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+FRET+of+intrinsically+disordered+proteins.">Single-molecule FRET of intrinsically disordered proteins.</a> Annu Rev Phys Chem. 71, 391-414 (2020).</li><li>Roebroek, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+readout+of+multiple+FRET+pairs+using+photochromism.">Simultaneous readout of multiple FRET pairs using photochromism.</a> Nat Commun. 12 (1), 2005 (2021).</li><li>Algar, W. R., Hildebrandt, N., Vogel, S. S., Medintz, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FRET+as+a+biomolecular+research+tool+-+understanding+its+potential+while+avoiding+pitfalls.">FRET as a biomolecular research tool - understanding its potential while avoiding pitfalls.</a> Nat Methods. 16 (9), 815-829 (2019).</li><li>Lyon, A. S., Peeples, W. B., Rosen, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+framework+for+understanding+the+functions+of+biomolecular+condensates+across+scales.">A framework for understanding the functions of biomolecular condensates across scales.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 22 (3), 215-235 (2021).</li><li>Belott, C., Janis, B., Menze, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liquid-liquid+phase+separation+promotes+animal+desiccation+tolerance.">Liquid-liquid phase separation promotes animal desiccation tolerance.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 117 (44), 27676-27684 (2020).</li><li>Miermont, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Severe+osmotic+compression+triggers+a+slowdown+of+intracellular+signaling,+which+can+be+explained+by+molecular+crowding.">Severe osmotic compression triggers a slowdown of intracellular signaling, which can be explained by molecular crowding.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (14), 5725-5730 (2013).</li><li>Saito, H., Posas, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Response+to+hyperosmotic+stress.">Response to hyperosmotic stress.</a> Genetics. 192 (2), 289-318 (2012).</li><li>Selenko, P., Wagner, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Looking+into+live+cells+with+in-cell+NMR+spectroscopy.">Looking into live cells with in-cell NMR spectroscopy.</a> J Struct Biol. 158 (2), 244-253 (2007).</li><li>Cattani, J., Subramaniam, V., Drescher, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Room-temperature+in-cell+EPR+spectroscopy:+alpha-Synuclein+disease+variants+remain+intrinsically+disordered+in+the+cell.">Room-temperature in-cell EPR spectroscopy: alpha-Synuclein disease variants remain intrinsically disordered in the cell.</a> Phys Chem Chem Phys. 19 (28), 18147-18151 (2017).</li><li>Beveridge, R., Chappuis, Q., Macphee, C., Barran, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+spectrometry+methods+for+intrinsically+disordered+proteins.">Mass spectrometry methods for intrinsically disordered proteins.</a> Analyst. 138 (1), 32-42 (2013).</li><li>Beveridge, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ion+mobility+mass+spectrometry+uncovers+the+impact+of+the+patterning+of+oppositely+charged+residues+on+the+conformational+distributions+of+intrinsically+disordered+proteins.">Ion mobility mass spectrometry uncovers the impact of the patterning of oppositely charged residues on the conformational distributions of intrinsically disordered proteins.</a> J Am Chem Soc. 141 (12), 4908-4918 (2019).</li></ol>

ここで紹介する手法は、IDRのアンサンブルのグローバルな次元が環境摂動をどのように感知し、応答するかについての洞察を得る方法を提供します。この方法は、遺伝的にコードされたコンストラクトに依存しており、酵母細胞でのプラスミドの安定発現以外に追加の成分を必要としないため、他の細胞タイプでの潜在的なアプリケーションに適応できます。さらに、真核細胞がライフサイ?...

天然変性領域(IDR)は、細胞プロセスにおける重要な構成要素です1。構造化ドメインと組み合わせて、IDRはタンパク質機能に不可欠です。IDRのアミノ酸組成は偏っており、主に荷電残基、親水性残基、および小残基で表されます。この特性により、IDRは複雑度の低いドメインと見なされる2,3。多くのIDRが注目されているのは、これらの領域が病態、特に神経変性疾患において重要な役割を果たしていることが主な理由です。このような疾患は、自己組織化とそれに続くニューロンにおけるIDRの細胞外または細胞内沈着を特徴とする4。例えば、アルツハイマー病のアミロイドβ(Aβ)、ハンチントン病のハンチンチン(HTT)、筋萎縮性側索硬化症や前頭側頭型認知症のTAR DNA結合タンパク質-43(TDP-43)や肉腫で融合したタンパク質(FUS)などが挙げられる4。疾患におけるIDRの構造再配列の研究は、蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)などの分光法によって大幅に強化されています。
IDRの親水性と伸長性により、溶液環境の物理化学的特性の変化に非常に敏感になります5。IDRの立体配座アンサンブルが環境によって変化する度合いを構造感度5,6,7と呼ぶ。IDRの立体構造とダイナミクスの研究には、円二色性(CD)や小角X線散乱(SAXS)など、さまざまな手法が用いられます8,9。残念ながら、CDやSAXSは精製タンパク質を大量に必要とするため、細胞での研究には適していません。対照的に、FRETは、1つのIDRを特異的に標識する2つの蛍光分子の蛍光強度を測定する技術であり、生細胞などの複雑な混合物でそれらをモニターすることができることを意味する10。生細胞におけるIDRの構造感受性を動的に測定することは、環境が無秩序なプロテオームのコンフォメーションと機能をどのように制御しているかを理解するために必要です。
FRETは、生細胞内のIDR、球状タンパク質、マルチドメインタンパク質の構造感受性を定量化するための強力な方法です。この方法では、FRETペアとして知られる2つの蛍光タンパク質(FP)の間に挟まれた目的のIDRからなるコンストラクトが必要です。このプロトコルでは、IDRの感度に関する以前の研究で報告された他のFPと比較して、ダイナミックレンジが広いため、ドナーFPとしてmCerulean3を、アクセプターFPとしてシトリンを使用することを提案します6。FRETは、異なる細胞環境における植物IDRの構造的感受性を測定するために以前に利用されてきました6。さらに、この手法は、in vitroとin vivoの両方でさまざまな研究グループによってIDRの全体的なタンパク質寸法を特徴付けるために使用されています5,11。
ここでは、生きた酵母(Saccharomyces cerevisiae)細胞におけるIDRの構造感受性を研究するためのアンサンブルFRET法について説明します。AtLEA4-5と呼ばれるプラントIDRに基づく代表的な結果を示します。AtLEA4-5は溶液中で無秩序であるが、in vitroで高分子クラウディングが誘導されるとαヘリックスに折り畳まれる12。AtLEA4-5は、in silicoおよびin vitroで報告されているように、比較的小さく(158残基)、無秩序で環境摂動に敏感であるため、この方法の優れた参照モデルです6,12。ここで紹介する方法は、酵母細胞は増殖しやすく、処理量も少量であるため、ハイスループットアプローチに拡張できます。さらに、プロトコルへの小さな修正は、細菌および植物細胞6などの他の細胞系に適用することができる。このプロトコルは、ほとんどの研究機関で利用可能な機器である蛍光モードを備えたマイクロプレートリーダーにアクセスできる分子生物学研究室で行うことができます。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>96-well plate</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>655096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>5040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BglII</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>R0144S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BJ5465 cells</td>
			<td>American Type Culture Collection</td>
			<td>208289</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffer MES 50 mM</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M8250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffer Tris-HCl 10 mM</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15506017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA 1 mM</td>
			<td>Merck</td>
			<td>108452</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352057</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB media</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L2897</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lithium acetate 0.1 M</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L6883</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low Melt Agarose</td>
			<td>GOLDBIO</td>
			<td>A-204-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td>eppendorf</td>
			<td>5452000010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Miniprep kit</td>
			<td>ZymoPure</td>
			<td>D4210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH 0.02 M</td>
			<td>Merck</td>
			<td>106462</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEG 3,350 40%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>1546547</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>plasmid pDRFLIP38-AtLEA4-5</td>
			<td>addgene</td>
			<td>178189</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate reader</td>
			<td>BMG LABTECH</td>
			<td>CLARIOstar Plus</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SacI</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>R3156S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Salmon sperm DNA 2 mg/mL</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15632011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SD-Ura</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Y1501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium cloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taq polymesare</td>
			<td>Promega</td>
			<td>M5123</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transiluminator</td>
			<td>Accuris instruments</td>
			<td>E4000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV-Visible spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Biomate3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>YPD media</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Y1500</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

estimation of structural sensitivity of intrinsically disordered regions in response to hyperosmotic stress in living cells using fret

天然変性領域(IDR)は、重要な細胞プロセスに関与するタンパク質ドメインです。ストレス状態では、細胞環境の物理化学的特性が変化し、IDRのコンフォメーションアンサンブルに直接影響します。IDRは本質的に環境の摂動に敏感です。細胞の物理化学的性質がIDRの立体構造アンサンブルをどのように制御するかを研究することは、その機能の環境制御を理解するために不可欠です。ここでは、高浸透圧ストレス条件に応答して、生きた出 芽酵母 細胞におけるIDRの構造感受性を測定するための段階的な方法について説明します。アンサンブル蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)を使用して、浸透圧を有する細胞に課せられる高浸透圧ストレスの漸進的な増加中にIDRの全体的な寸法がどのように変化するかを推定します。さらに、蛍光測定を処理し、異なるIDRの構造感度を比較するためのスクリプトを提供しています。この方法に従うことで、研究者は、環境の変化に応じてIDRが複雑な細胞内環境で受ける立体構造の変化に関する貴重な洞察を得ることができます。

Intrinsically disordered regions (IDRs) are critical components in cellular processes1. In combination with structured domains, IDRs are essential for protein functions. The amino acid composition of IDRs is biased, represented mainly by charged, hydrophilic, and small residues. Because of this property, IDRs are considered low complexity domains2,3. Numerous IDRs have garnered attention, primarily because these regions play a crucial role in pathological conditions, particularly neurodegenerative diseases. Such diseases are characterized by self-assembly and subsequent extracellular or intracellular deposition of IDRs in neurons4. Examples of such IDRs include amyloid-&#946;&#160;(A&#946;) in Alzheimer&#39;s disease, huntingtin (HTT) in Huntington&#39;s disease, and TAR DNA-binding protein-43 (TDP-43) and fused in sarcoma (FUS) in amyotrophic lateral sclerosis and frontotemporal dementia4. The study of the structural rearrangements of IDRs in the context of disease has been significantly enhanced by spectroscopic methods, including fluorescence resonance energy transfer (FRET).
The hydrophilic and extended nature of IDRs makes them extremely sensitive to changes in the physicochemical properties of the solution environment5. The degree by which the conformational ensemble of IDRs is modified by the environment is called structural sensitivity5,6,7. Different techniques can be used to study the conformation and dynamics of IDRs, including circular dichroism (CD) and small-angle X-ray scattering (SAXS)8,9. Unfortunately, CD and SAXS require large quantities of purified proteins, so they are not appropriate for studies in cells. In contrast, FRET is a technique that measures the fluorescence intensity of two fluorescent molecules that specifically label one IDR, meaning that they can be monitored in complex mixtures such as living cells10. Dynamically measuring the structural sensitivity of IDRs in living cells is necessary for understanding how the environment regulates the conformation and function of the disordered proteome.
FRET is a powerful method for quantifying the structural sensitivity of IDRs, as well as globular and multidomain proteins in living cells. The method requires a construct consisting of an IDR of interest sandwiched between two fluorescent proteins (FP), known as a FRET pair. For this protocol, we suggest the use of mCerulean3 as the donor FP and Citrine as the acceptor FP, because of their large dynamic range, compared to other FPs reported in a previous study about IDRs sensitivity6. FRET has previously been exploited to measure the structural sensitivity of a plant IDR in different cellular contexts6. In addition, this technique has been used to characterize overall protein dimensions of IDRs by different research groups both in vitro and in vivo5,11.
Here, we describe the ensemble FRET method for studying the structural sensitivity of IDRs in living yeast (Saccharomyces cerevisiae) cells. We show representative results that are based in a plant IDR called AtLEA4-5. AtLEA4-5 is disordered in solution, but folds into &#945;-helix when macromolecular crowding is induced in vitro12. AtLEA4-5 is a good reference model for this method because it is relatively small (158 residues), disordered and sensitive to environmental perturbation as reported in silico and in vitro6,12. The method presented here can be scaled for high throughput approaches because yeast cells are easy to grow, and the treatment is applied in small volumes. In addition, small modifications to the protocol can be applied to other cellular systems such as bacteria and plant cells6. The protocol can be performed in any molecular biology laboratory with access to a microplate reader with fluorescence mode, an equipment available in most research institutions.

著者スポットライト:細胞センシングと応答による本質的に不秩序な領域の世界を解き放つ

FRETを用いた生細胞の高浸透圧ストレスに応答した内在性変性領域の構造感受性の推定

We aim to understand how intrinsically disordered regions sense and respond to changes in the physical chemical properties of the environment. We combine biophysical, biochemical, genetic, and cell biology techniques to monitor how the structural ensemble of disordered regions change in living cells. Protein biophysics techniques are currently used to study the confirmation of IVRs.These include nuclear magnetic resonance, circular dichroism, small angle x-ray scattering, and FRET. Most of these techniques can only be used in vitro. Studying the confirmation of IVRs in a cellular context is challenging with high cost and time consuming techniques.We provide an alternative to overcome these challenges. Our protocol can monitor the confirmation of IVRs in an easy, fast, and reproducible way, complementing other in vitro methods. Our findings offered an understanding of the molecular mechanisms underlying the structural sensitivity of IVRs under stress.This allows the use of IVRs as somatic biosensors. The precise tracking of the cellular environment will contribute to a more nuanced understanding of life's fundamental processes. Our research has led to questions about the determinants of a structural sensitivity in intrinsically disordered regions, its relevance to IVR's functions, and the environmental factors influencing these sensitivity.

酵母細胞をpDRFLIP38-AtLEA4-5プラスミドで形質転換した後、青色光トランスイルミネーターとフィルターで正の形質転換体の蛍光を観察しました(図1)。高浸透圧ストレスを誘発するためのさまざまな溶液の調製には時間がかかるため、 図 2 の 96 ウェルテンプレートに従うことをお勧めします。さまざまな濃度の塩化ナトリウムによる高浸透圧ストレ?...

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天然変性領域(IDR)は、環境変化に応答してコンフォメーションを変化させる柔軟なタンパク質ドメインです。アンサンブル蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)は、さまざまな条件下でタンパク質の寸法を推定できます。高浸透圧ストレス下で生きた 出芽酵母 細胞のIDR構造感受性を評価するためのFRETアプローチを提示します。

Intrinsically disordered regions (IDRs) are protein domains that participate in crucial cellular processes. During stress conditions, the physicochemical ...

私たちは、本質的に無秩序な領域が、環境の物理化学的性質の変化をどのように感知し、応答するかを理解することを目指しています。生物物理学的、生化学的、遺伝学的、細胞生物学の手法を組み合わせて、生細胞の無秩序領域の構造アンサンブルがどのように変化するかをモニターしています。現在、タンパク質生物物理学の手法は、IVRの確認を研究するために使用されています。これらには、核磁気共鳴、円二色性、小角X線散乱、およびFRETが含まれます。これらの技術のほとんどは、in vitroでのみ使用できます。細胞の文脈でIVRの確認を研究することは、高いコストと時間のかかる技術で困難です。私たちは、これらの課題を克服するための代替案を提供します。当社のプロトコルは、IVRの確認を簡単、迅速、再現性のある方法でモニタリングでき、他のin vitro法を補完します。私たちの発見は、ストレス下でのIVRの構造的感受性の根底にある分子メカニズムの理解をもたらしました。これにより、IVRを体細胞バイオセンサーとして使用することができます。細胞環境を正確に追跡することで、生命の根本的なプロセスをより微妙に理解することができます。私たちの研究は、天然変性領域における構造的感受性の決定要因、IVRの機能との関連性、およびこれらの感受性に影響を与える環境要因についての疑問につながりました。

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Research

JoVE Journal

Biochemistry

Estimation of Structural Sensitivity of Intrinsically Disordered Regions in Response to Hyperosmotic Stress in Living Cells Using FRET

Intrinsically disordered regions (IDRs) are protein domains that participate in crucial cellular processes. During stress conditions, the physicochemical properties of the cellular environment change, directly impacting the conformational ensemble of IDRs. IDRs are inherently sensitive to environmental perturbations. Studying how the physicochemical properties of the cell regulate the conformational ensemble of IDRs is essential for understanding the environmental control of their function. Here, we describe a step-by-step method for measuring the structural sensitivity of IDRs in living Saccharomyces cerevisiae cells in response to hyperosmotic stress conditions. We present the use of ensemble fluorescence resonance energy transfer (FRET) to estimate how the global dimensions of IDRs change during a progressive increase of hyperosmotic stress imposed on cells with any osmolyte. In addition, we provide a script for processing fluorescence measurements and comparing structural sensitivity for different IDRs. By following this method, researchers can obtain valuable insights into the conformational changes that IDRs undergo in the complex intracellular milieu upon changing environments.

Intrinsically disordered regions (IDRs) are flexible protein domains that modify their conformation in response to environmental changes. Ensemble fluorescence resonance energy transfer (FRET) can estimate protein dimensions under different conditions. We present a FRET approach to assess IDR structural sensitivity in living Saccharomyces cerevisiae cells under hyperosmotic stress.