Name: 저자 스포트라이트: Unlocking the World of Intrinsically Disordered Regions with Cellular Sensing and Responses
Uploaded: 2024-01-12T14:50:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Estimation of Structural Sensitivity of Intrinsically Disordered Regions in Response to Hyperosmotic Stress in Living Cells Using FRET at JoVE.com

원고를 비판적으로 검토해 주신 Cuevas-Velazquez 연구실 관계자분들께 감사드립니다. 이 작업은 Programa de Apoyo a Proyectos de Investigación e Innovación Tecnológica, Dirección General de Asuntos del Personal Académico, Universidad Nacional Autónoma de México (UNAM-PAPIIT) 프로젝트 번호 IA203422의 지원을 받았습니다. Consejo Nacional de Humanidades, Ciencias y Tecnología (CONAHCYT), 프로젝트 번호 252952; 및 Programa de Apoyo a la Investigación y el Posgrado, Facultad de Química, Universidad Nacional Autónoma de México, Grant 5000-9182. CET(CVU 1083636) 및 CAPD(CVU 1269643)는 CONAHCYT를 M.Sc 장학금으로 인정합니다.

1. 플라스미드 구성
<ol><li>중합효소 연쇄 반응(PCR)에 의해 원하는 IDR을 코딩하는 개방형 판독 프레임(ORF)을 증폭합니다. ORF는 형광 단백질을 암호화하는 유전자 옆에 있기 때문에 정지 코돈을 포함하지 마십시오. 증폭을 위해 SacI(5') 및 BglII(3') 제한 부위를 사용하여 프라이머를 설계합니다. 참고: 대표 결과 섹션의 경우 AtLEA4-5를 선택한 IDR로 사용했습니다. pTrc99A-AtLEA4-5...

효모의 고삼투압 스트레스를 연구하기 위한 IDR 구조적 민감도의 FRET 분석

<ol>
	<li>Wright, P. E., Dyson, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrinsically+disordered+proteins+in+cellular+signalling+and+regulation.">Intrinsically disordered proteins in cellular signalling and regulation.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 16 (1), 18-29 (2015).</li><li>Covarrubias, A. A., Romero-P&#233;rez, P. S., Cuevas-Velazquez, C. L., Rend&#243;n-Luna, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+functional+diversity+of+structural+disorder+in+plant+proteins.">The functional diversity of structural disorder in plant proteins.</a> Arch Biochem Biophys. 680, 108229 (2019).</li><li>Ahmed, S. 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L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrinsically+disordered+protein+biosensor+tracks+the+physical-chemical+effects+of+osmotic+stress+on+cells.">Intrinsically disordered protein biosensor tracks the physical-chemical effects of osmotic stress on cells.</a> Nat Commun. 12 (1), 5438 (2021).</li><li>Holehouse, A. S., Sukenik, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlling+structural+bias+in+intrinsically+disordered+proteins+using+solution+space+scanning.">Controlling structural bias in intrinsically disordered proteins using solution space scanning.</a> J Chem Theory Comput. 16 (3), 1794-1805 (2020).</li><li>Martin, E. W., Hopkins, J. B., Mittag, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small-angle+X-ray+scattering+experiments+of+monodisperse+intrinsically+disordered+protein+samples+close+to+the+solubility+limit.">Small-angle X-ray scattering experiments of monodisperse intrinsically disordered protein samples close to the solubility limit.</a> Methods Enzymol. 646, 185-222 (2021).</li><li>Miles, A. J., Drew, E. D., Wallace, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DichroIDP:+a+method+for+analyses+of+intrinsically+disordered+proteins+using+circular+dichroism+spectroscopy.">DichroIDP: a method for analyses of intrinsically disordered proteins using circular dichroism spectroscopy.</a> Commun Biol. 6 (1), 823 (2023).</li><li>Kaminski, C. F., Rees, E. J., Schierle, G. S. 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A., Rhoades, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+FRET+of+intrinsically+disordered+proteins.">Single-molecule FRET of intrinsically disordered proteins.</a> Annu Rev Phys Chem. 71, 391-414 (2020).</li><li>Roebroek, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+readout+of+multiple+FRET+pairs+using+photochromism.">Simultaneous readout of multiple FRET pairs using photochromism.</a> Nat Commun. 12 (1), 2005 (2021).</li><li>Algar, W. R., Hildebrandt, N., Vogel, S. S., Medintz, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FRET+as+a+biomolecular+research+tool+-+understanding+its+potential+while+avoiding+pitfalls.">FRET as a biomolecular research tool - understanding its potential while avoiding pitfalls.</a> Nat Methods. 16 (9), 815-829 (2019).</li><li>Lyon, A. S., Peeples, W. B., Rosen, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+framework+for+understanding+the+functions+of+biomolecular+condensates+across+scales.">A framework for understanding the functions of biomolecular condensates across scales.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 22 (3), 215-235 (2021).</li><li>Belott, C., Janis, B., Menze, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liquid-liquid+phase+separation+promotes+animal+desiccation+tolerance.">Liquid-liquid phase separation promotes animal desiccation tolerance.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 117 (44), 27676-27684 (2020).</li><li>Miermont, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Severe+osmotic+compression+triggers+a+slowdown+of+intracellular+signaling,+which+can+be+explained+by+molecular+crowding.">Severe osmotic compression triggers a slowdown of intracellular signaling, which can be explained by molecular crowding.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (14), 5725-5730 (2013).</li><li>Saito, H., Posas, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Response+to+hyperosmotic+stress.">Response to hyperosmotic stress.</a> Genetics. 192 (2), 289-318 (2012).</li><li>Selenko, P., Wagner, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Looking+into+live+cells+with+in-cell+NMR+spectroscopy.">Looking into live cells with in-cell NMR spectroscopy.</a> J Struct Biol. 158 (2), 244-253 (2007).</li><li>Cattani, J., Subramaniam, V., Drescher, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Room-temperature+in-cell+EPR+spectroscopy:+alpha-Synuclein+disease+variants+remain+intrinsically+disordered+in+the+cell.">Room-temperature in-cell EPR spectroscopy: alpha-Synuclein disease variants remain intrinsically disordered in the cell.</a> Phys Chem Chem Phys. 19 (28), 18147-18151 (2017).</li><li>Beveridge, R., Chappuis, Q., Macphee, C., Barran, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+spectrometry+methods+for+intrinsically+disordered+proteins.">Mass spectrometry methods for intrinsically disordered proteins.</a> Analyst. 138 (1), 32-42 (2013).</li><li>Beveridge, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ion+mobility+mass+spectrometry+uncovers+the+impact+of+the+patterning+of+oppositely+charged+residues+on+the+conformational+distributions+of+intrinsically+disordered+proteins.">Ion mobility mass spectrometry uncovers the impact of the patterning of oppositely charged residues on the conformational distributions of intrinsically disordered proteins.</a> J Am Chem Soc. 141 (12), 4908-4918 (2019).</li></ol>

여기에 제시된 방법은 IDR 앙상블의 전역 차원이 환경 섭동을 감지하고 반응하는 방법에 대한 통찰력을 얻을 수 있는 방법을 제공합니다. 이 방법은 유전적으로 인코딩된 구조에 의존하며 효모 세포에서 플라스미드 안정 발현 이외의 추가 구성 요소가 필요하지 않으므로 다른 세포 유형의 잠재적 응용 분야에 적용할 수 있습니다. 또한, 진핵 세포가 수명주기 동안 경험하는 다른 물리 화학적 섭동?...

본질적으로 무질서한 영역(Intrinsically disordered regions, IDR)은 세포 과정의 중요한 구성 요소입니다1. 구조화된 도메인과 함께 IDR은 단백질 기능에 필수적입니다. IDR의 아미노산 조성은 편향되어 있으며, 주로 하전, 친수성 및 작은 잔류물로 대표됩니다. 이 속성 때문에 IDR은 복잡성이 낮은 도메인 2,3으로 간주됩니다. 수많은 IDR이 주목을 받고 있는데, 이는 주로 이 부위가 병리학적 상태, 특히 신경퇴행성 질환에서 중요한 역할을 하기 때문입니다. 이러한 질환은 뉴런에서 IDR의 자가 조립(self-assembly)과 그에 따른 세포외 또는 세포내 침착(extracellular 또는 intracellular deposition)을 특징으로 한다4. 이러한 IDR의 예로는 알츠하이머병의 아밀로이드-β(Aβ), 헌팅턴병의 헌팅틴(HTT), 근위축성 측삭 경화증 및 전두측두엽 치매의 육종(FUS)에서 융합된 TAR DNA 결합 단백질-43(TDP-43) 및 융합 등이 있다4. 질병의 맥락에서 IDR의 구조적 재배열에 대한 연구는 형광 공명 에너지 전달(FRET)을 포함한 분광법에 의해 크게 향상되었습니다.
IDR의 친수성 및 확장 특성으로 인해 용액 환경의 물리화학적 특성 변화에 매우 민감합니다5. IDR의 구조적 앙상블이 환경에 의해 변형되는 정도를 구조적 민감도 5,6,7이라고 합니다. 원형 이색법(CD) 및 소각 X선 산란(SAXS)8,9을 포함하여 IDR의 형태와 역학을 연구하는 데 다양한 기술을 사용할 수 있습니다. 안타깝게도 CD와 SAXS는 정제된 단백질을 대량으로 필요로 하기 때문에 세포 연구에는 적합하지 않습니다. 대조적으로, FRET는 하나의 IDR을 특이적으로 표지하는 두 형광 분자의 형광 강도를 측정하는 기술이며, 이는 살아있는 세포(10)와 같은 복잡한 혼합물에서 모니터링할 수 있음을 의미합니다. 살아있는 세포에서 IDR의 구조적 민감도를 동적으로 측정하는 것은 환경이 무질서한 단백질체의 형태와 기능을 어떻게 조절하는지 이해하는 데 필요합니다.
FRET는 살아있는 세포의 구형 및 다영역 단백질뿐만 아니라 IDR의 구조적 민감도를 정량화하는 강력한 방법입니다. 이 방법에는 FRET 쌍으로 알려진 두 개의 형광 단백질(FP) 사이에 끼워진 관심 IDR로 구성된 구성이 필요합니다. 이 프로토콜의 경우, IDR 민감도에 대한 이전 연구에서 보고된 다른 FP와 비교하여 동적 범위가 넓기 때문에 mCerulean3를 공여체 FP로, 황수정을 수용체 FP로 사용할 것을 제안합니다6. FRET는 이전에 다양한 세포 환경에서 식물 IDR의 구조적 민감도를 측정하는 데 활용되었습니다6. 또한, 이 기술은 in vitro 및 in vivo 5,11 모두에서 다양한 연구 그룹에 의해 IDR의 전체 단백질 치수를 특성화하는 데 사용되었습니다.
여기에서는 살아있는 효모(Saccharomyces cerevisiae) 세포에서 IDR의 구조적 민감도를 연구하기 위한 앙상블 FRET 방법을 설명합니다. AtLEA4-5라는 플랜트 IDR을 기반으로 하는 대표적인 결과를 보여줍니다. AtLEA4-5는 용액에서 무질서하지만, 시험관 내에서 고분자 군집이 유도되면 α나선으로 접힌다 12. AtLEA4-5는 상대적으로 작고(158개 잔기), 무질서하며 in silico 및 in vitro 6,12에서 보고된 바와 같이 환경 섭동에 민감하기 때문에 이 방법에 대한 좋은 참조 모델입니다. 여기에 제시된 방법은 효모 세포가 성장하기 쉽고 처리가 소량으로 적용되기 때문에 고처리량 접근법에 맞게 확장할 수 있습니다. 또한, 프로토콜에 대한 작은 변형은 박테리아 및 식물 세포와 같은 다른 세포 시스템에 적용될 수 있다6. 이 프로토콜은 대부분의 연구 기관에서 사용할 수 있는 장비인 형광 모드가 있는 마이크로플레이트 리더에 액세스할 수 있는 모든 분자 생물학 실험실에서 수행할 수 있습니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>96-well plate</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>655096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>5040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BglII</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>R0144S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BJ5465 cells</td>
			<td>American Type Culture Collection</td>
			<td>208289</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffer MES 50 mM</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M8250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffer Tris-HCl 10 mM</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15506017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA 1 mM</td>
			<td>Merck</td>
			<td>108452</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352057</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB media</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L2897</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lithium acetate 0.1 M</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L6883</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low Melt Agarose</td>
			<td>GOLDBIO</td>
			<td>A-204-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td>eppendorf</td>
			<td>5452000010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Miniprep kit</td>
			<td>ZymoPure</td>
			<td>D4210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH 0.02 M</td>
			<td>Merck</td>
			<td>106462</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEG 3,350 40%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>1546547</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>plasmid pDRFLIP38-AtLEA4-5</td>
			<td>addgene</td>
			<td>178189</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate reader</td>
			<td>BMG LABTECH</td>
			<td>CLARIOstar Plus</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SacI</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>R3156S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Salmon sperm DNA 2 mg/mL</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15632011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SD-Ura</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Y1501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium cloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taq polymesare</td>
			<td>Promega</td>
			<td>M5123</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transiluminator</td>
			<td>Accuris instruments</td>
			<td>E4000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV-Visible spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Biomate3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>YPD media</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Y1500</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

estimation of structural sensitivity of intrinsically disordered regions in response to hyperosmotic stress in living cells using fret

내재적 무질서 영역(IDR)은 중요한 세포 과정에 관여하는 단백질 영역입니다. 스트레스 조건 동안 세포 환경의 물리화학적 특성이 변하여 IDR의 구조적 앙상블에 직접적인 영향을 미칩니다. IDR은 본질적으로 환경 섭동에 민감합니다. 세포의 물리화학적 특성이 IDR의 구조적 앙상블을 어떻게 조절하는지 연구하는 것은 IDR 기능의 환경적 제어를 이해하는 데 필수적입니다. 여기에서는 고삼투압 스트레스 조건에 반응하여 살아있는 맥주효모균 세포 에서 IDR의 구조적 민감도를 측정하는 단계별 방법을 설명합니다. 앙상블 형광 공명 에너지 전달(FRET)을 사용하여 삼투질이 있는 세포에 가해지는 고삼투압 스트레스가 점진적으로 증가하는 동안 IDR의 전체 치수가 어떻게 변하는지 추정합니다. 또한 형광 측정을 처리하고 다양한 IDR에 대한 구조적 감도를 비교하기 위한 스크립트를 제공합니다. 이 방법을 따름으로써 연구자들은 환경 변화에 따라 복잡한 세포 내 환경에서 IDR이 겪는 구조적 변화에 대한 귀중한 통찰력을 얻을 수 있습니다.

Intrinsically disordered regions (IDRs) are critical components in cellular processes1. In combination with structured domains, IDRs are essential for protein functions. The amino acid composition of IDRs is biased, represented mainly by charged, hydrophilic, and small residues. Because of this property, IDRs are considered low complexity domains2,3. Numerous IDRs have garnered attention, primarily because these regions play a crucial role in pathological conditions, particularly neurodegenerative diseases. Such diseases are characterized by self-assembly and subsequent extracellular or intracellular deposition of IDRs in neurons4. Examples of such IDRs include amyloid-&#946;&#160;(A&#946;) in Alzheimer&#39;s disease, huntingtin (HTT) in Huntington&#39;s disease, and TAR DNA-binding protein-43 (TDP-43) and fused in sarcoma (FUS) in amyotrophic lateral sclerosis and frontotemporal dementia4. The study of the structural rearrangements of IDRs in the context of disease has been significantly enhanced by spectroscopic methods, including fluorescence resonance energy transfer (FRET).
The hydrophilic and extended nature of IDRs makes them extremely sensitive to changes in the physicochemical properties of the solution environment5. The degree by which the conformational ensemble of IDRs is modified by the environment is called structural sensitivity5,6,7. Different techniques can be used to study the conformation and dynamics of IDRs, including circular dichroism (CD) and small-angle X-ray scattering (SAXS)8,9. Unfortunately, CD and SAXS require large quantities of purified proteins, so they are not appropriate for studies in cells. In contrast, FRET is a technique that measures the fluorescence intensity of two fluorescent molecules that specifically label one IDR, meaning that they can be monitored in complex mixtures such as living cells10. Dynamically measuring the structural sensitivity of IDRs in living cells is necessary for understanding how the environment regulates the conformation and function of the disordered proteome.
FRET is a powerful method for quantifying the structural sensitivity of IDRs, as well as globular and multidomain proteins in living cells. The method requires a construct consisting of an IDR of interest sandwiched between two fluorescent proteins (FP), known as a FRET pair. For this protocol, we suggest the use of mCerulean3 as the donor FP and Citrine as the acceptor FP, because of their large dynamic range, compared to other FPs reported in a previous study about IDRs sensitivity6. FRET has previously been exploited to measure the structural sensitivity of a plant IDR in different cellular contexts6. In addition, this technique has been used to characterize overall protein dimensions of IDRs by different research groups both in vitro and in vivo5,11.
Here, we describe the ensemble FRET method for studying the structural sensitivity of IDRs in living yeast (Saccharomyces cerevisiae) cells. We show representative results that are based in a plant IDR called AtLEA4-5. AtLEA4-5 is disordered in solution, but folds into &#945;-helix when macromolecular crowding is induced in vitro12. AtLEA4-5 is a good reference model for this method because it is relatively small (158 residues), disordered and sensitive to environmental perturbation as reported in silico and in vitro6,12. The method presented here can be scaled for high throughput approaches because yeast cells are easy to grow, and the treatment is applied in small volumes. In addition, small modifications to the protocol can be applied to other cellular systems such as bacteria and plant cells6. The protocol can be performed in any molecular biology laboratory with access to a microplate reader with fluorescence mode, an equipment available in most research institutions.

저자 스포트라이트: Unlocking the World of Intrinsically Disordered Regions with Cellular Sensing and Responses

FRET를 사용한 살아있는 세포의 고삼투압 스트레스에 대한 반응으로 본질적으로 무질서한 영역의 구조적 민감도 추정

We aim to understand how intrinsically disordered regions sense and respond to changes in the physical chemical properties of the environment. We combine biophysical, biochemical, genetic, and cell biology techniques to monitor how the structural ensemble of disordered regions change in living cells. Protein biophysics techniques are currently used to study the confirmation of IVRs.These include nuclear magnetic resonance, circular dichroism, small angle x-ray scattering, and FRET. Most of these techniques can only be used in vitro. Studying the confirmation of IVRs in a cellular context is challenging with high cost and time consuming techniques.We provide an alternative to overcome these challenges. Our protocol can monitor the confirmation of IVRs in an easy, fast, and reproducible way, complementing other in vitro methods. Our findings offered an understanding of the molecular mechanisms underlying the structural sensitivity of IVRs under stress.This allows the use of IVRs as somatic biosensors. The precise tracking of the cellular environment will contribute to a more nuanced understanding of life's fundamental processes. Our research has led to questions about the determinants of a structural sensitivity in intrinsically disordered regions, its relevance to IVR's functions, and the environmental factors influencing these sensitivity.

pDRFLIP38-AtLEA4-5 플라스미드로 효모 세포를 형질전환한 후, 청색광 transilluminator와 필터로 positive transformants의 형광을 관찰하였다(그림 1). 고삼투압 스트레스를 유발하기 위해 다양한 용액을 준비하는 것은 시간이 많이 걸리므로 그림 2의 96웰 템플릿을 따르는 것이 좋습니다. 다양한 농도의 염화나트륨으로 고삼투압 스트레스 처리 직후, 형광 방출 스펙트...

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내재적 무질서 영역(IDR)은 환경 변화에 대응하여 형태를 수정하는 유연한 단백질 도메인입니다. 앙상블 형광 공명 에너지 전달(FRET)은 다양한 조건에서 단백질 치수를 추정할 수 있습니다. 우리는 고삼투압 스트레스 하에서 살아있는 맥주효모균 세레비지애 세포의 IDR 구조적 민감도를 평가하기 위한 FRET 접근법을 제시합니다.

Intrinsically disordered regions (IDRs) are protein domains that participate in crucial cellular processes. During stress conditions, the physicochemical ...

우리는 본질적으로 무질서한 지역이 환경의 물리적 화학적 특성 변화를 어떻게 감지하고 반응하는지 이해하는 것을 목표로 합니다. 생물물리학적, 생화학적, 유전학적, 세포생물학 기법을 결합하여 살아있는 세포에서 무질서한 영역의 구조적 앙상블이 어떻게 변화하는지 모니터링합니다. 단백질 생물물리학 기술은 현재 IVR의 확인을 연구하는 데 사용됩니다.여기에는 핵 자기 공명, 원형 이색성, 소각 X선 산란 및 FRET가 포함됩니다. 이러한 기술의 대부분은 체외에서만 사용할 수 있습니다. 세포 맥락에서 IVR의 확인을 연구하는 것은 높은 비용과 시간이 많이 소요되는 기술로 인해 어렵습니다.우리는 이러한 문제를 극복할 수 있는 대안을 제공합니다. 당사의 프로토콜은 쉽고 빠르며 재현 가능한 방식으로 IVR 확인을 모니터링하여 다른 in vitro 방법을 보완할 수 있습니다. 우리의 발견은 스트레스를 받는 IVR의 구조적 민감도의 기초가 되는 분자 메커니즘에 대한 이해를 제공했습니다.이를 통해 IVR을 체세포 바이오센서로 사용할 수 있습니다. 세포 환경의 정확한 추적은 생명의 기본 과정을 보다 세밀하게 이해하는 데 기여할 것입니다. 우리의 연구는 본질적으로 무질서한 영역에서 구조적 민감도의 결정 요인, IVR의 기능과의 관련성 및 이러한 민감도에 영향을 미치는 환경 요인에 대한 질문으로 이어졌습니다.

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Research

JoVE Journal

Biochemistry

Estimation of Structural Sensitivity of Intrinsically Disordered Regions in Response to Hyperosmotic Stress in Living Cells Using FRET

Intrinsically disordered regions (IDRs) are protein domains that participate in crucial cellular processes. During stress conditions, the physicochemical properties of the cellular environment change, directly impacting the conformational ensemble of IDRs. IDRs are inherently sensitive to environmental perturbations. Studying how the physicochemical properties of the cell regulate the conformational ensemble of IDRs is essential for understanding the environmental control of their function. Here, we describe a step-by-step method for measuring the structural sensitivity of IDRs in living Saccharomyces cerevisiae cells in response to hyperosmotic stress conditions. We present the use of ensemble fluorescence resonance energy transfer (FRET) to estimate how the global dimensions of IDRs change during a progressive increase of hyperosmotic stress imposed on cells with any osmolyte. In addition, we provide a script for processing fluorescence measurements and comparing structural sensitivity for different IDRs. By following this method, researchers can obtain valuable insights into the conformational changes that IDRs undergo in the complex intracellular milieu upon changing environments.

Intrinsically disordered regions (IDRs) are flexible protein domains that modify their conformation in response to environmental changes. Ensemble fluorescence resonance energy transfer (FRET) can estimate protein dimensions under different conditions. We present a FRET approach to assess IDR structural sensitivity in living Saccharomyces cerevisiae cells under hyperosmotic stress.