Name: Forfatter i søkelyset: Lås opp en verden av iboende uordnede regioner med cellulær sensing og respons
Uploaded: 2024-01-12T14:50:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Estimation of Structural Sensitivity of Intrinsically Disordered Regions in Response to Hyperosmotic Stress in Living Cells Using FRET at JoVE.com

Vi takker medlemmer av Cuevas-Velazquez-laboratoriet for den kritiske gjennomgangen av manuskriptet. Dette arbeidet ble støttet av Programa de Apoyo a Proyectos de Investigación e Innovación Tecnológica, Dirección General de Asuntos del Personal Académico, Universidad Nacional Autónoma de México (UNAM-PAPIIT) prosjektnummer IA203422; Consejo Nacional de Humanidades, Ciencias y Tecnología (CONAHCYT), prosjektnummer 252952; og Programa de Apoyo a la Investigación y el Posgrado, Facultad de Química, Universidad Nacional Autónoma de México, Grant 5000-9182. CET (CVU 1083636) og CAPD (CVU 1269643) anerkjenner CONAHCYT for deres M.Sc. Scholarship.

1. Plasmid konstruksjon
<ol><li>Forsterk den åpne leserammen (ORF) som koder for ønsket IDR ved polymerasekjedereaksjon (PCR). Ikke inkluder stoppkodonet siden ORF vil bli flankert av genene som koder for fluorescerende proteiner. For forsterkning, design primere med SacI (5') og BglII (3') begrensningssteder. MERK: For delen om representative resultater brukte vi AtLEA4-5 som valgt IDR. Vi forsterket ORF for AtLEA4-5 fra pTrc99A-AtLEA4-5 plasmid12.</li>
	...

FRET-analyse av IDR-strukturell følsomhet for å studere hyperosmotisk stress i gjær

<ol>
	<li>Wright, P. E., Dyson, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrinsically+disordered+proteins+in+cellular+signalling+and+regulation.">Intrinsically disordered proteins in cellular signalling and regulation.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 16 (1), 18-29 (2015).</li><li>Covarrubias, A. A., Romero-P&#233;rez, P. S., Cuevas-Velazquez, C. L., Rend&#243;n-Luna, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+functional+diversity+of+structural+disorder+in+plant+proteins.">The functional diversity of structural disorder in plant proteins.</a> Arch Biochem Biophys. 680, 108229 (2019).</li><li>Ahmed, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+intrinsically+disordered+regions+in+proteins+informed+by+human+genetic+diversity.">Characterization of intrinsically disordered regions in proteins informed by human genetic diversity.</a> PLoS Comput Biol. 18 (3), e1009911 (2022).</li><li>Birol, M., Melo, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Untangling+the+conformational+polymorphism+of+disordered+proteins+associated+with+neurodegeneration+at+the+single-molecule+level.">Untangling the conformational polymorphism of disordered proteins associated with neurodegeneration at the single-molecule level.</a> Front Mol Neurosci. 12, 309 (2019).</li><li>Moses, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revealing+the+hidden+sensitivity+of+intrinsically+disordered+proteins+to+their+chemical+environment.">Revealing the hidden sensitivity of intrinsically disordered proteins to their chemical environment.</a> J Phys Chem Lett. 11 (23), 10131-10136 (2020).</li><li>Cuevas-Velazquez, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrinsically+disordered+protein+biosensor+tracks+the+physical-chemical+effects+of+osmotic+stress+on+cells.">Intrinsically disordered protein biosensor tracks the physical-chemical effects of osmotic stress on cells.</a> Nat Commun. 12 (1), 5438 (2021).</li><li>Holehouse, A. S., Sukenik, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlling+structural+bias+in+intrinsically+disordered+proteins+using+solution+space+scanning.">Controlling structural bias in intrinsically disordered proteins using solution space scanning.</a> J Chem Theory Comput. 16 (3), 1794-1805 (2020).</li><li>Martin, E. W., Hopkins, J. B., Mittag, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small-angle+X-ray+scattering+experiments+of+monodisperse+intrinsically+disordered+protein+samples+close+to+the+solubility+limit.">Small-angle X-ray scattering experiments of monodisperse intrinsically disordered protein samples close to the solubility limit.</a> Methods Enzymol. 646, 185-222 (2021).</li><li>Miles, A. J., Drew, E. D., Wallace, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DichroIDP:+a+method+for+analyses+of+intrinsically+disordered+proteins+using+circular+dichroism+spectroscopy.">DichroIDP: a method for analyses of intrinsically disordered proteins using circular dichroism spectroscopy.</a> Commun Biol. 6 (1), 823 (2023).</li><li>Kaminski, C. F., Rees, E. J., Schierle, G. S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+quantitative+protocol+for+intensity-based+live+cell+FRET+imaging.">A quantitative protocol for intensity-based live cell FRET imaging.</a> Method Mol Biol. 1076, 445-454 (2014).</li><li>Moses, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+biases+in+disordered+proteins+are+prevalent+in+the+cell.">Structural biases in disordered proteins are prevalent in the cell.</a> bioRxiv. , (2022).</li><li>Cuevas-Velazquez, C. L., Saab-Rinc&#243;n, G., Reyes, J. L., Covarrubias, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Unstructured+N-terminal+Region+of+Arabidopsis+Group+4+Late+Embryogenesis+Abundant+(LEA)+Proteins+Is+Required+for+Folding+and+for+Chaperone-like+Activity+under+Water+Deficit.">The Unstructured N-terminal Region of Arabidopsis Group 4 Late Embryogenesis Abundant (LEA) Proteins Is Required for Folding and for Chaperone-like Activity under Water Deficit.</a> J Biol Chem. 291 (20), 10893-10903 (2016).</li><li>JoVE Science Education Database. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Restriction enzyme digests. , (2023).</li><li>JoVE Science Education Database. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Gel purification. , (2023).</li><li>JoVE Science Education Database. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> DNA ligation reactions. , (2023).</li><li>JoVE Science Education Database. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Bacterial transformation using heat Ssock and competent cells. , (2023).</li><li>JoVE Science Education Database. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> PCR: Principle, instrumentation, and applications. , (2023).</li><li>JoVE Science Education Database. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Plasmid purification. , (2023).</li><li>JoVE Science Education Database. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> DNA gel electrophoresis. , (2023).</li><li>JoVE Core Molecular Biology. Sanger/chain termination sequencing using dideoxynucleotides - Concept Available from: <a target="_blank" href="https://app.jove.com/science-education/v/12020/sanger-sequencing">https://app.jove.com/science-education/v/12020/sanger-sequencing</a> (2023)</li><li>Theillet, F. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physicochemical+properties+of+cells+and+their+effects+on+intrinsically+disordered+proteins+(IDPs).">Physicochemical properties of cells and their effects on intrinsically disordered proteins (IDPs).</a> Chem Rev. 114 (13), 6661-6714 (2014).</li><li>Brutscher, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NMR+methods+for+the+study+of+instrinsically+disordered+proteins+structure,+dynamics,+and+interactions:+General+overview+and+practical+guidelines.">NMR methods for the study of instrinsically disordered proteins structure, dynamics, and interactions: General overview and practical guidelines.</a> Adv Exp Med Biol. 870, 49-122 (2015).</li><li>Metskas, L. A., Rhoades, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+FRET+of+intrinsically+disordered+proteins.">Single-molecule FRET of intrinsically disordered proteins.</a> Annu Rev Phys Chem. 71, 391-414 (2020).</li><li>Roebroek, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+readout+of+multiple+FRET+pairs+using+photochromism.">Simultaneous readout of multiple FRET pairs using photochromism.</a> Nat Commun. 12 (1), 2005 (2021).</li><li>Algar, W. R., Hildebrandt, N., Vogel, S. S., Medintz, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FRET+as+a+biomolecular+research+tool+-+understanding+its+potential+while+avoiding+pitfalls.">FRET as a biomolecular research tool - understanding its potential while avoiding pitfalls.</a> Nat Methods. 16 (9), 815-829 (2019).</li><li>Lyon, A. S., Peeples, W. B., Rosen, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+framework+for+understanding+the+functions+of+biomolecular+condensates+across+scales.">A framework for understanding the functions of biomolecular condensates across scales.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 22 (3), 215-235 (2021).</li><li>Belott, C., Janis, B., Menze, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liquid-liquid+phase+separation+promotes+animal+desiccation+tolerance.">Liquid-liquid phase separation promotes animal desiccation tolerance.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 117 (44), 27676-27684 (2020).</li><li>Miermont, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Severe+osmotic+compression+triggers+a+slowdown+of+intracellular+signaling,+which+can+be+explained+by+molecular+crowding.">Severe osmotic compression triggers a slowdown of intracellular signaling, which can be explained by molecular crowding.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (14), 5725-5730 (2013).</li><li>Saito, H., Posas, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Response+to+hyperosmotic+stress.">Response to hyperosmotic stress.</a> Genetics. 192 (2), 289-318 (2012).</li><li>Selenko, P., Wagner, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Looking+into+live+cells+with+in-cell+NMR+spectroscopy.">Looking into live cells with in-cell NMR spectroscopy.</a> J Struct Biol. 158 (2), 244-253 (2007).</li><li>Cattani, J., Subramaniam, V., Drescher, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Room-temperature+in-cell+EPR+spectroscopy:+alpha-Synuclein+disease+variants+remain+intrinsically+disordered+in+the+cell.">Room-temperature in-cell EPR spectroscopy: alpha-Synuclein disease variants remain intrinsically disordered in the cell.</a> Phys Chem Chem Phys. 19 (28), 18147-18151 (2017).</li><li>Beveridge, R., Chappuis, Q., Macphee, C., Barran, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+spectrometry+methods+for+intrinsically+disordered+proteins.">Mass spectrometry methods for intrinsically disordered proteins.</a> Analyst. 138 (1), 32-42 (2013).</li><li>Beveridge, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ion+mobility+mass+spectrometry+uncovers+the+impact+of+the+patterning+of+oppositely+charged+residues+on+the+conformational+distributions+of+intrinsically+disordered+proteins.">Ion mobility mass spectrometry uncovers the impact of the patterning of oppositely charged residues on the conformational distributions of intrinsically disordered proteins.</a> J Am Chem Soc. 141 (12), 4908-4918 (2019).</li></ol>

Metoden som presenteres her gir en måte å få innsikt i hvordan de globale dimensjonene til ensemblet av IDR sanser og reagerer på miljøforstyrrelser. Denne metoden er avhengig av en genetisk kodet konstruksjon og krever ingen ekstra komponenter utover et plasmidstabilt uttrykk i gjærceller, noe som gjør det tilpasningsdyktig for potensielle anvendelser i andre celletyper. Videre er det allsidig for å utforske andre fysisk-kjemiske forstyrrelser som eukaryote celler opplever i løpet av livssyklusen<sup class="xre...

Intrinsically disordered regions (IDR) er kritiske komponenter i cellulære prosesser1. I kombinasjon med strukturerte domener er IDR avgjørende for proteinfunksjoner. Aminosyresammensetningen av IDR er partisk, hovedsakelig representert av ladede, hydrofile og små rester. På grunn av denne egenskapen anses IDR-er som domener med lav kompleksitet 2,3. Mange IDR har fått oppmerksomhet, først og fremst fordi disse regionene spiller en avgjørende rolle i patologiske forhold, spesielt nevrodegenerative sykdommer. Slike sykdommer er preget av selvmontering og påfølgende ekstracellulær eller intracellulær avsetning av IDR i nevroner4. Eksempler på slike IDR er amyloid-β (Aβ) ved Alzheimers sykdom, huntingtin (HTT) ved Huntingtons sykdom og TAR DNA-bindende protein-43 (TDP-43) og smeltet sammen i sarkom (FUS) ved amyotrofisk lateral sklerose og frontotemporal demens4. Studien av strukturelle omlegginger av IDR i sykdomssammenheng har blitt betydelig forbedret med spektroskopiske metoder, inkludert fluorescensresonans energioverføring (FRET).
Den hydrofile og utvidede naturen til IDR gjør dem ekstremt følsomme for endringer i de fysisk-kjemiske egenskapene til løsningsmiljøet5. I hvilken grad det konformasjonelle ensemblet av IDR er modifisert av miljøet kalles strukturell følsomhet 5,6,7. Ulike teknikker kan brukes til å studere konformasjonen og dynamikken til IDR, inkludert sirkulær dikroisme (CD) og småvinklet røntgenspredning (SAXS)8,9. Dessverre krever CD og SAXS store mengder rensede proteiner, så de er ikke egnet for studier i celler. I kontrast er FRET en teknikk som måler fluorescensintensiteten til to fluorescerende molekyler som spesifikt merker en IDR, noe som betyr at de kan overvåkes i komplekse blandinger som levende celler10. Dynamisk måling av den strukturelle følsomheten til IDR i levende celler er nødvendig for å forstå hvordan miljøet regulerer konformasjonen og funksjonen til det uordnede proteomet.
FRET er en kraftig metode for å kvantifisere den strukturelle følsomheten til IDR, så vel som kuleformede og multidomeneproteiner i levende celler. Metoden krever en konstruksjon som består av en IDR av interesse klemt mellom to fluorescerende proteiner (FP), kjent som et FRET-par. For denne protokollen foreslår vi bruk av mCerulean3 som donor FP og Citrin som akseptor FP, på grunn av deres store dynamiske område, sammenlignet med andre FPs rapportert i en tidligere studie om IDRs følsomhet6. FRET har tidligere blitt utnyttet til å måle den strukturelle følsomheten til en plante IDR i ulike cellulære sammenhenger6. I tillegg har denne teknikken blitt brukt til å karakterisere generelle proteindimensjoner av IDR av forskjellige forskningsgrupper både in vitro og in vivo 5,11.
Her beskriver vi ensemblet FRET-metoden for å studere den strukturelle følsomheten til IDR i levende gjærceller (Saccharomyces cerevisiae). Vi viser representative resultater som er basert på et anlegg IDR kalt AtLEA4-5. AtLEA4-5 er uordnet i oppløsning, men brettes inn i α-helix når makromolekylær trengning induseres in vitro12. AtLEA4-5 er en god referansemodell for denne metoden fordi den er relativt liten (158 rester), uordnet og følsom for miljøforstyrrelser som rapportert i silico og in vitro 6,12. Metoden som presenteres her kan skaleres for høy gjennomstrømning tilnærminger fordi gjærceller er enkle å dyrke, og behandlingen brukes i små volumer. I tillegg kan små modifikasjoner i protokollen brukes på andre cellulære systemer som bakterier og planteceller6. Protokollen kan utføres i ethvert molekylærbiologisk laboratorium med tilgang til en mikroplateleser med fluorescensmodus, et utstyr som er tilgjengelig i de fleste forskningsinstitusjoner.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>96-well plate</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>655096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>5040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BglII</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>R0144S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BJ5465 cells</td>
			<td>American Type Culture Collection</td>
			<td>208289</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffer MES 50 mM</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M8250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffer Tris-HCl 10 mM</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15506017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA 1 mM</td>
			<td>Merck</td>
			<td>108452</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352057</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB media</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L2897</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lithium acetate 0.1 M</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L6883</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low Melt Agarose</td>
			<td>GOLDBIO</td>
			<td>A-204-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td>eppendorf</td>
			<td>5452000010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Miniprep kit</td>
			<td>ZymoPure</td>
			<td>D4210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH 0.02 M</td>
			<td>Merck</td>
			<td>106462</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEG 3,350 40%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>1546547</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>plasmid pDRFLIP38-AtLEA4-5</td>
			<td>addgene</td>
			<td>178189</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate reader</td>
			<td>BMG LABTECH</td>
			<td>CLARIOstar Plus</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SacI</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>R3156S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Salmon sperm DNA 2 mg/mL</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15632011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SD-Ura</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Y1501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium cloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taq polymesare</td>
			<td>Promega</td>
			<td>M5123</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transiluminator</td>
			<td>Accuris instruments</td>
			<td>E4000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV-Visible spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Biomate3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>YPD media</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Y1500</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

estimation of structural sensitivity of intrinsically disordered regions in response to hyperosmotic stress in living cells using fret

Intrinsically disordered regions (IDR) er proteindomener som deltar i viktige cellulære prosesser. Under stressforhold endres de fysisk-kjemiske egenskapene til det cellulære miljøet, noe som direkte påvirker det konformasjonelle ensemblet av IDR. IDR er iboende følsomme for miljøforstyrrelser. Å studere hvordan cellens fysisk-kjemiske egenskaper regulerer det konformasjonelle ensemblet av IDR er avgjørende for å forstå miljøkontrollen av deres funksjon. Her beskriver vi en trinnvis metode for å måle den strukturelle følsomheten til sprøytebrukere i levende Saccharomyces cerevisiae-celler som respons på hyperosmotiske stressforhold. Vi presenterer bruken av ensemblefluorescensresonans energioverføring (FRET) for å estimere hvordan de globale dimensjonene av IDR endres under en progressiv økning av hyperosmotisk stress pålagt celler med en hvilken som helst osmolyte. I tillegg tilbyr vi et skript for behandling av fluorescensmålinger og sammenligning av strukturell følsomhet for forskjellige IDR. Ved å følge denne metoden kan forskere få verdifull innsikt i konformasjonsendringene som IDR gjennomgår i det komplekse intracellulære miljøet ved skiftende miljøer.

Intrinsically disordered regions (IDRs) are critical components in cellular processes1. In combination with structured domains, IDRs are essential for protein functions. The amino acid composition of IDRs is biased, represented mainly by charged, hydrophilic, and small residues. Because of this property, IDRs are considered low complexity domains2,3. Numerous IDRs have garnered attention, primarily because these regions play a crucial role in pathological conditions, particularly neurodegenerative diseases. Such diseases are characterized by self-assembly and subsequent extracellular or intracellular deposition of IDRs in neurons4. Examples of such IDRs include amyloid-&#946;&#160;(A&#946;) in Alzheimer&#39;s disease, huntingtin (HTT) in Huntington&#39;s disease, and TAR DNA-binding protein-43 (TDP-43) and fused in sarcoma (FUS) in amyotrophic lateral sclerosis and frontotemporal dementia4. The study of the structural rearrangements of IDRs in the context of disease has been significantly enhanced by spectroscopic methods, including fluorescence resonance energy transfer (FRET).
The hydrophilic and extended nature of IDRs makes them extremely sensitive to changes in the physicochemical properties of the solution environment5. The degree by which the conformational ensemble of IDRs is modified by the environment is called structural sensitivity5,6,7. Different techniques can be used to study the conformation and dynamics of IDRs, including circular dichroism (CD) and small-angle X-ray scattering (SAXS)8,9. Unfortunately, CD and SAXS require large quantities of purified proteins, so they are not appropriate for studies in cells. In contrast, FRET is a technique that measures the fluorescence intensity of two fluorescent molecules that specifically label one IDR, meaning that they can be monitored in complex mixtures such as living cells10. Dynamically measuring the structural sensitivity of IDRs in living cells is necessary for understanding how the environment regulates the conformation and function of the disordered proteome.
FRET is a powerful method for quantifying the structural sensitivity of IDRs, as well as globular and multidomain proteins in living cells. The method requires a construct consisting of an IDR of interest sandwiched between two fluorescent proteins (FP), known as a FRET pair. For this protocol, we suggest the use of mCerulean3 as the donor FP and Citrine as the acceptor FP, because of their large dynamic range, compared to other FPs reported in a previous study about IDRs sensitivity6. FRET has previously been exploited to measure the structural sensitivity of a plant IDR in different cellular contexts6. In addition, this technique has been used to characterize overall protein dimensions of IDRs by different research groups both in vitro and in vivo5,11.
Here, we describe the ensemble FRET method for studying the structural sensitivity of IDRs in living yeast (Saccharomyces cerevisiae) cells. We show representative results that are based in a plant IDR called AtLEA4-5. AtLEA4-5 is disordered in solution, but folds into &#945;-helix when macromolecular crowding is induced in vitro12. AtLEA4-5 is a good reference model for this method because it is relatively small (158 residues), disordered and sensitive to environmental perturbation as reported in silico and in vitro6,12. The method presented here can be scaled for high throughput approaches because yeast cells are easy to grow, and the treatment is applied in small volumes. In addition, small modifications to the protocol can be applied to other cellular systems such as bacteria and plant cells6. The protocol can be performed in any molecular biology laboratory with access to a microplate reader with fluorescence mode, an equipment available in most research institutions.

Forfatter i søkelyset: Lås opp en verden av iboende uordnede regioner med cellulær sensing og respons

Estimering av strukturell følsomhet i iboende uordnede regioner som respons på hyperosmotisk stress i levende celler ved bruk av FRET

We aim to understand how intrinsically disordered regions sense and respond to changes in the physical chemical properties of the environment. We combine biophysical, biochemical, genetic, and cell biology techniques to monitor how the structural ensemble of disordered regions change in living cells. Protein biophysics techniques are currently used to study the confirmation of IVRs.These include nuclear magnetic resonance, circular dichroism, small angle x-ray scattering, and FRET. Most of these techniques can only be used in vitro. Studying the confirmation of IVRs in a cellular context is challenging with high cost and time consuming techniques.We provide an alternative to overcome these challenges. Our protocol can monitor the confirmation of IVRs in an easy, fast, and reproducible way, complementing other in vitro methods. Our findings offered an understanding of the molecular mechanisms underlying the structural sensitivity of IVRs under stress.This allows the use of IVRs as somatic biosensors. The precise tracking of the cellular environment will contribute to a more nuanced understanding of life's fundamental processes. Our research has led to questions about the determinants of a structural sensitivity in intrinsically disordered regions, its relevance to IVR's functions, and the environmental factors influencing these sensitivity.

Etter å ha transformert gjærceller med pDRFLIP38-AtLEA4-5-plasmid, ble fluorescensen av de positive transformantene observert med en blå lystransilluminator og et filter (figur 1). Å forberede de forskjellige løsningene for å indusere hyperosmotisk stress er tidkrevende, så vi foreslår å følge 96-brønnsmalen i figur 2. Umiddelbart etter hyperosmotisk stressbehandling med varierende konsentrasjon av natriumklorid ble fluorescensemisjonsspektrene samlet...

Watch this Scientific Journal Video about Estimation of Structural Sensitivity of Intrinsically Disordered Regions in Response to Hyperosmotic Stress in Living Cells Using FRET at JoVE.com

Intrinsically disordered regions (IDR) er fleksible proteindomener som modifiserer deres konformasjon som svar på miljøendringer. Ensemble fluorescens resonans energioverføring (FRET) kan estimere proteindimensjoner under forskjellige forhold. Vi presenterer en FRET-tilnærming for å vurdere IDR-strukturell følsomhet i levende Saccharomyces cerevisiae-celler under hyperosmotisk stress.

Intrinsically disordered regions (IDRs) are protein domains that participate in crucial cellular processes. During stress conditions, the physicochemical ...

Vi tar sikte på å forstå hvordan iboende uordnede regioner sanser og reagerer på endringer i miljøets fysiske, kjemiske egenskaper. Vi kombinerer biofysiske, biokjemiske, genetiske og cellebiologiske teknikker for å overvåke hvordan det strukturelle ensemblet av uordnede regioner endres i levende celler. Protein biofysikk teknikker brukes for tiden til å studere bekreftelsen av IVR.Disse inkluderer kjernemagnetisk resonans, sirkulær dikroisme, røntgenspredning med liten vinkel og FRET. De fleste av disse teknikkene kan bare brukes in vitro. Å studere bekreftelse av IVR i en cellulær kontekst er utfordrende med høye kostnader og tidkrevende teknikker.Vi tilbyr et alternativ for å overvinne disse utfordringene. Vår protokoll kan overvåke bekreftelsen av IVR på en enkel, rask og reproduserbar måte, og utfylle andre in vitro-metoder. Våre funn ga en forståelse av de molekylære mekanismene som ligger til grunn for den strukturelle følsomheten til IVR under stress.Dette tillater bruk av IVR som somatiske biosensorer. Den nøyaktige sporingen av cellemiljøet vil bidra til en mer nyansert forståelse av livets grunnleggende prosesser. Vår forskning har ført til spørsmål om determinanter av en strukturell følsomhet i iboende uordnede regioner, dens relevans for IVRs funksjoner og miljøfaktorene som påvirker disse følsomhetene.

estimation-structural-sensitivity-intrinsically-disordered-regions

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Estimation of Structural Sensitivity of Intrinsically Disordered Regions in Response to Hyperosmotic Stress in Living Cells Using FRET

Intrinsically disordered regions (IDRs) are protein domains that participate in crucial cellular processes. During stress conditions, the physicochemical properties of the cellular environment change, directly impacting the conformational ensemble of IDRs. IDRs are inherently sensitive to environmental perturbations. Studying how the physicochemical properties of the cell regulate the conformational ensemble of IDRs is essential for understanding the environmental control of their function. Here, we describe a step-by-step method for measuring the structural sensitivity of IDRs in living Saccharomyces cerevisiae cells in response to hyperosmotic stress conditions. We present the use of ensemble fluorescence resonance energy transfer (FRET) to estimate how the global dimensions of IDRs change during a progressive increase of hyperosmotic stress imposed on cells with any osmolyte. In addition, we provide a script for processing fluorescence measurements and comparing structural sensitivity for different IDRs. By following this method, researchers can obtain valuable insights into the conformational changes that IDRs undergo in the complex intracellular milieu upon changing environments.

Intrinsically disordered regions (IDRs) are flexible protein domains that modify their conformation in response to environmental changes. Ensemble fluorescence resonance energy transfer (FRET) can estimate protein dimensions under different conditions. We present a FRET approach to assess IDR structural sensitivity in living Saccharomyces cerevisiae cells under hyperosmotic stress.