Name: Yazar Spotlight: Hücresel Algılama ve Tepkilerle Kendinden Düzensiz Bölgelerin Dünyasının Kilidini Açmak
Uploaded: 2024-01-12T14:50:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Estimation of Structural Sensitivity of Intrinsically Disordered Regions in Response to Hyperosmotic Stress in Living Cells Using FRET at JoVE.com

Makalenin eleştirel incelemesi için Cuevas-Velazquez laboratuvarı üyelerine teşekkür ederiz. Bu çalışma, Programa de Apoyo a Proyectos de Investigación e Innovación Tecnológica, Dirección General de Asuntos del Personal Académico, Universidad Nacional Autónoma de México (UNAM-PAPIIT) proje numarası IA203422; Consejo Nacional de Humanidades, Ciencias y Tecnología (CONAHCYT), proje numarası 252952; ve Programa de Apoyo a la Investigación y el Posgrado, Facultad de Química, Universidad Nacional Autónoma de México, Grant 5000-9182. CET (CVU 1083636) ve CAPD (CVU 1269643), M.Sc. Bursları için CONAHCYT'e teşekkür eder.

1. Plazmit yapısı
<ol><li>Polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) ile istenen IDR'yi kodlayan açık okuma çerçevesini (ORF) yükseltin. ORF, floresan proteinleri kodlayan genler tarafından kuşatılacağından durdurma kodonunu dahil etmeyin. Amplifikasyon için, SacI (5') ve BglII (3') kısıtlama bölgelerine sahip primerler tasarlayın. NOT: Temsili sonuçlar bölümü için, seçilen IDR olarak AtLEA4-5'i kullandık. AtLEA4-5'in ORF'sini pTrc99A-AtLEA4-5 plazmid<sup class="xref...

Mayada Hiperozmotik Stresi İncelemek için IDR Yapısal Duyarlılığının FRET Analizi

<ol>
	<li>Wright, P. E., Dyson, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrinsically+disordered+proteins+in+cellular+signalling+and+regulation.">Intrinsically disordered proteins in cellular signalling and regulation.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 16 (1), 18-29 (2015).</li><li>Covarrubias, A. A., Romero-P&#233;rez, P. S., Cuevas-Velazquez, C. L., Rend&#243;n-Luna, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+functional+diversity+of+structural+disorder+in+plant+proteins.">The functional diversity of structural disorder in plant proteins.</a> Arch Biochem Biophys. 680, 108229 (2019).</li><li>Ahmed, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+intrinsically+disordered+regions+in+proteins+informed+by+human+genetic+diversity.">Characterization of intrinsically disordered regions in proteins informed by human genetic diversity.</a> PLoS Comput Biol. 18 (3), e1009911 (2022).</li><li>Birol, M., Melo, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Untangling+the+conformational+polymorphism+of+disordered+proteins+associated+with+neurodegeneration+at+the+single-molecule+level.">Untangling the conformational polymorphism of disordered proteins associated with neurodegeneration at the single-molecule level.</a> Front Mol Neurosci. 12, 309 (2019).</li><li>Moses, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revealing+the+hidden+sensitivity+of+intrinsically+disordered+proteins+to+their+chemical+environment.">Revealing the hidden sensitivity of intrinsically disordered proteins to their chemical environment.</a> J Phys Chem Lett. 11 (23), 10131-10136 (2020).</li><li>Cuevas-Velazquez, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrinsically+disordered+protein+biosensor+tracks+the+physical-chemical+effects+of+osmotic+stress+on+cells.">Intrinsically disordered protein biosensor tracks the physical-chemical effects of osmotic stress on cells.</a> Nat Commun. 12 (1), 5438 (2021).</li><li>Holehouse, A. S., Sukenik, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlling+structural+bias+in+intrinsically+disordered+proteins+using+solution+space+scanning.">Controlling structural bias in intrinsically disordered proteins using solution space scanning.</a> J Chem Theory Comput. 16 (3), 1794-1805 (2020).</li><li>Martin, E. W., Hopkins, J. B., Mittag, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small-angle+X-ray+scattering+experiments+of+monodisperse+intrinsically+disordered+protein+samples+close+to+the+solubility+limit.">Small-angle X-ray scattering experiments of monodisperse intrinsically disordered protein samples close to the solubility limit.</a> Methods Enzymol. 646, 185-222 (2021).</li><li>Miles, A. J., Drew, E. D., Wallace, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DichroIDP:+a+method+for+analyses+of+intrinsically+disordered+proteins+using+circular+dichroism+spectroscopy.">DichroIDP: a method for analyses of intrinsically disordered proteins using circular dichroism spectroscopy.</a> Commun Biol. 6 (1), 823 (2023).</li><li>Kaminski, C. F., Rees, E. J., Schierle, G. S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+quantitative+protocol+for+intensity-based+live+cell+FRET+imaging.">A quantitative protocol for intensity-based live cell FRET imaging.</a> Method Mol Biol. 1076, 445-454 (2014).</li><li>Moses, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+biases+in+disordered+proteins+are+prevalent+in+the+cell.">Structural biases in disordered proteins are prevalent in the cell.</a> bioRxiv. , (2022).</li><li>Cuevas-Velazquez, C. L., Saab-Rinc&#243;n, G., Reyes, J. L., Covarrubias, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Unstructured+N-terminal+Region+of+Arabidopsis+Group+4+Late+Embryogenesis+Abundant+(LEA)+Proteins+Is+Required+for+Folding+and+for+Chaperone-like+Activity+under+Water+Deficit.">The Unstructured N-terminal Region of Arabidopsis Group 4 Late Embryogenesis Abundant (LEA) Proteins Is Required for Folding and for Chaperone-like Activity under Water Deficit.</a> J Biol Chem. 291 (20), 10893-10903 (2016).</li><li>JoVE Science Education Database. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Restriction enzyme digests. , (2023).</li><li>JoVE Science Education Database. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Gel purification. , (2023).</li><li>JoVE Science Education Database. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> DNA ligation reactions. , (2023).</li><li>JoVE Science Education Database. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Bacterial transformation using heat Ssock and competent cells. , (2023).</li><li>JoVE Science Education Database. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> PCR: Principle, instrumentation, and applications. , (2023).</li><li>JoVE Science Education Database. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Plasmid purification. , (2023).</li><li>JoVE Science Education Database. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> DNA gel electrophoresis. , (2023).</li><li>JoVE Core Molecular Biology. Sanger/chain termination sequencing using dideoxynucleotides - Concept Available from: <a target="_blank" href="https://app.jove.com/science-education/v/12020/sanger-sequencing">https://app.jove.com/science-education/v/12020/sanger-sequencing</a> (2023)</li><li>Theillet, F. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physicochemical+properties+of+cells+and+their+effects+on+intrinsically+disordered+proteins+(IDPs).">Physicochemical properties of cells and their effects on intrinsically disordered proteins (IDPs).</a> Chem Rev. 114 (13), 6661-6714 (2014).</li><li>Brutscher, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NMR+methods+for+the+study+of+instrinsically+disordered+proteins+structure,+dynamics,+and+interactions:+General+overview+and+practical+guidelines.">NMR methods for the study of instrinsically disordered proteins structure, dynamics, and interactions: General overview and practical guidelines.</a> Adv Exp Med Biol. 870, 49-122 (2015).</li><li>Metskas, L. A., Rhoades, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+FRET+of+intrinsically+disordered+proteins.">Single-molecule FRET of intrinsically disordered proteins.</a> Annu Rev Phys Chem. 71, 391-414 (2020).</li><li>Roebroek, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+readout+of+multiple+FRET+pairs+using+photochromism.">Simultaneous readout of multiple FRET pairs using photochromism.</a> Nat Commun. 12 (1), 2005 (2021).</li><li>Algar, W. R., Hildebrandt, N., Vogel, S. S., Medintz, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FRET+as+a+biomolecular+research+tool+-+understanding+its+potential+while+avoiding+pitfalls.">FRET as a biomolecular research tool - understanding its potential while avoiding pitfalls.</a> Nat Methods. 16 (9), 815-829 (2019).</li><li>Lyon, A. S., Peeples, W. B., Rosen, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+framework+for+understanding+the+functions+of+biomolecular+condensates+across+scales.">A framework for understanding the functions of biomolecular condensates across scales.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 22 (3), 215-235 (2021).</li><li>Belott, C., Janis, B., Menze, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liquid-liquid+phase+separation+promotes+animal+desiccation+tolerance.">Liquid-liquid phase separation promotes animal desiccation tolerance.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 117 (44), 27676-27684 (2020).</li><li>Miermont, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Severe+osmotic+compression+triggers+a+slowdown+of+intracellular+signaling,+which+can+be+explained+by+molecular+crowding.">Severe osmotic compression triggers a slowdown of intracellular signaling, which can be explained by molecular crowding.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (14), 5725-5730 (2013).</li><li>Saito, H., Posas, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Response+to+hyperosmotic+stress.">Response to hyperosmotic stress.</a> Genetics. 192 (2), 289-318 (2012).</li><li>Selenko, P., Wagner, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Looking+into+live+cells+with+in-cell+NMR+spectroscopy.">Looking into live cells with in-cell NMR spectroscopy.</a> J Struct Biol. 158 (2), 244-253 (2007).</li><li>Cattani, J., Subramaniam, V., Drescher, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Room-temperature+in-cell+EPR+spectroscopy:+alpha-Synuclein+disease+variants+remain+intrinsically+disordered+in+the+cell.">Room-temperature in-cell EPR spectroscopy: alpha-Synuclein disease variants remain intrinsically disordered in the cell.</a> Phys Chem Chem Phys. 19 (28), 18147-18151 (2017).</li><li>Beveridge, R., Chappuis, Q., Macphee, C., Barran, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+spectrometry+methods+for+intrinsically+disordered+proteins.">Mass spectrometry methods for intrinsically disordered proteins.</a> Analyst. 138 (1), 32-42 (2013).</li><li>Beveridge, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ion+mobility+mass+spectrometry+uncovers+the+impact+of+the+patterning+of+oppositely+charged+residues+on+the+conformational+distributions+of+intrinsically+disordered+proteins.">Ion mobility mass spectrometry uncovers the impact of the patterning of oppositely charged residues on the conformational distributions of intrinsically disordered proteins.</a> J Am Chem Soc. 141 (12), 4908-4918 (2019).</li></ol>

Burada sunulan yöntem, IDR'ler topluluğunun küresel boyutlarının çevresel bozulmaları nasıl algıladığına ve bunlara nasıl tepki verdiğine dair içgörüler elde etmenin bir yolunu sunar. Bu yöntem, genetik olarak kodlanmış bir yapıya dayanır ve maya hücrelerinde plazmit stabil ekspresyonunun ötesinde hiçbir ek bileşen gerektirmez, bu da onu diğer hücre tiplerindeki potansiyel uygulamalar için uyarlanabilir hale getirir. Ayrıca, ökaryotik hücrelerin yaşam döngüleri boyunca yaşadıkları di...

Kendinden düzensiz bölgeler (IDR'ler) hücresel süreçlerde kritik bileşenlerdir1. Yapılandırılmış alanlarla kombinasyon halinde, IDR'ler protein fonksiyonları için gereklidir. IDR'lerin amino asit bileşimi önyargılıdır ve esas olarak yüklü, hidrofilik ve küçük kalıntılarla temsil edilir. Bu özellik nedeniyle, IDR'ler düşük karmaşıklık alanları 2,3 olarak kabul edilir. Çok sayıda IDR, öncelikle bu bölgelerin patolojik durumlarda, özellikle nörodejeneratif hastalıklarda çok önemli bir rol oynaması nedeniyle dikkat çekmiştir. Bu tür hastalıklar, nöronlarda IDR'lerin kendi kendine toplanması ve ardından hücre dışı veya hücre içi birikmesi ile karakterize edilir4. Bu tür IDR'lerin örnekleri arasında Alzheimer hastalığında amiloid-β (Aβ), Huntington hastalığında huntingtin (HTT) ve amyotrofik lateral skleroz ve frontotemporal demansta sarkomda (FUS) kaynaşmış TAR DNA bağlayıcı protein-43 (TDP-43)bulunur 4. Hastalık bağlamında IDR'lerin yapısal yeniden düzenlemelerinin incelenmesi, floresan rezonans enerji transferi (FRET) dahil olmak üzere spektroskopik yöntemlerle önemli ölçüde geliştirilmiştir.
IDR'lerin hidrofilik ve genişletilmiş doğası, onları çözelti ortamının fizikokimyasal özelliklerindeki değişikliklere karşı son derece hassas hale getirir5. IDR'lerin konformasyonel topluluğunun çevre tarafından değiştirilme derecesine yapısal duyarlılık 5,6,7 denir. IDR'lerin konformasyonunu ve dinamiklerini incelemek için dairesel dikroizm (CD) ve küçük açılı X-ışını saçılımı (SAXS)8,9 dahil olmak üzere farklı teknikler kullanılabilir. Ne yazık ki, CD ve SAXS büyük miktarlarda saflaştırılmış protein gerektirir, bu nedenle hücrelerdeki çalışmalar için uygun değildirler. Buna karşılık, FRET, bir IDR'yi spesifik olarak etiketleyen iki floresan molekülünün floresan yoğunluğunu ölçen bir tekniktir, yani canlı hücreler10 gibi karmaşık karışımlarda izlenebilirler. Canlı hücrelerdeki IDR'lerin yapısal duyarlılığının dinamik olarak ölçülmesi, çevrenin düzensiz proteomun konformasyonunu ve işlevini nasıl düzenlediğini anlamak için gereklidir.
FRET, IDR'lerin yapısal duyarlılığının yanı sıra canlı hücrelerdeki küresel ve çok alanlı proteinlerin ölçülmesi için güçlü bir yöntemdir. Yöntem, FRET çifti olarak bilinen iki floresan protein (FP) arasına sıkıştırılmış bir IDR'den oluşan bir yapı gerektirir. Bu protokol için, IDR'lerin duyarlılığı6 ile ilgili önceki bir çalışmada bildirilen diğer FP'lere kıyasla, geniş dinamik aralıkları nedeniyle donör FP olarak mCerulean3 ve alıcı FP olarak Sitrin kullanılmasını öneriyoruz. FRET daha önce farklı hücresel bağlamlarda bir bitki IDR'sinin yapısal hassasiyetini ölçmek için kullanılmıştır6. Ek olarak, bu teknik, hem in vitro hem de in vivo olarak farklı araştırma grupları tarafından IDR'lerin genel protein boyutlarını karakterize etmek için kullanılmıştır 5,11.
Burada, canlı maya (Saccharomyces cerevisiae) hücrelerinde IDR'lerin yapısal duyarlılığını incelemek için topluluk FRET yöntemini açıklıyoruz. AtLEA4-5 adlı bir tesis IDR'sine dayanan temsili sonuçları gösteriyoruz. AtLEA4-5 çözelti içinde düzensizdir, ancak makromoleküler kalabalıklaşma indüklendiğinde α-sarmal halinde katlanır in vitro12. AtLEA4-5, bu yöntem için iyi bir referans modeldir, çünkü nispeten küçüktür (158 kalıntı), düzensiz ve in silico ve in vitro 6,12 bildirildiği gibi çevresel bozulmaya duyarlıdır. Burada sunulan yöntem, maya hücrelerinin büyümesi kolay olduğu ve tedavinin küçük hacimlerde uygulandığı için yüksek verimli yaklaşımlar için ölçeklendirilebilir. Ek olarak, protokolde yapılan küçük değişiklikler, bakteri ve bitki hücreleri gibi diğer hücresel sistemlere de uygulanabilir6. Protokol, çoğu araştırma kurumunda bulunan bir ekipman olan floresan modlu bir mikroplaka okuyucuya erişimi olan herhangi bir moleküler biyoloji laboratuvarında gerçekleştirilebilir.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>96-well plate</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>655096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>5040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BglII</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>R0144S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BJ5465 cells</td>
			<td>American Type Culture Collection</td>
			<td>208289</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffer MES 50 mM</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M8250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffer Tris-HCl 10 mM</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15506017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA 1 mM</td>
			<td>Merck</td>
			<td>108452</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352057</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB media</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L2897</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lithium acetate 0.1 M</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L6883</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low Melt Agarose</td>
			<td>GOLDBIO</td>
			<td>A-204-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td>eppendorf</td>
			<td>5452000010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Miniprep kit</td>
			<td>ZymoPure</td>
			<td>D4210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH 0.02 M</td>
			<td>Merck</td>
			<td>106462</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEG 3,350 40%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>1546547</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>plasmid pDRFLIP38-AtLEA4-5</td>
			<td>addgene</td>
			<td>178189</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate reader</td>
			<td>BMG LABTECH</td>
			<td>CLARIOstar Plus</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SacI</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>R3156S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Salmon sperm DNA 2 mg/mL</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15632011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SD-Ura</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Y1501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium cloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taq polymesare</td>
			<td>Promega</td>
			<td>M5123</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transiluminator</td>
			<td>Accuris instruments</td>
			<td>E4000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV-Visible spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Biomate3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>YPD media</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Y1500</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

estimation of structural sensitivity of intrinsically disordered regions in response to hyperosmotic stress in living cells using fret

Kendinden düzensiz bölgeler (IDR'ler), önemli hücresel süreçlere katılan protein alanlarıdır. Stres koşulları sırasında, hücresel ortamın fizikokimyasal özellikleri değişir ve IDR'lerin konformasyonel topluluğunu doğrudan etkiler. IDR'ler doğası gereği çevresel bozulmalara karşı hassastır. Hücrenin fizikokimyasal özelliklerinin IDR'lerin konformasyonel topluluğunu nasıl düzenlediğini incelemek, işlevlerinin çevresel kontrolünü anlamak için gereklidir. Burada, hiperozmotik stres koşullarına yanıt olarak canlı Saccharomyces cerevisiae hücrelerinde IDR'lerin yapısal duyarlılığını ölçmek için adım adım bir yöntem açıklıyoruz. Herhangi bir ozmolit içeren hücrelere uygulanan hiperozmotik stresin aşamalı bir artışı sırasında IDR'lerin küresel boyutlarının nasıl değiştiğini tahmin etmek için topluluk floresan rezonans enerji transferinin (FRET) kullanımını sunuyoruz. Ek olarak, floresan ölçümlerini işlemek ve farklı IDR'ler için yapısal hassasiyeti karşılaştırmak için bir komut dosyası sağlıyoruz. Araştırmacılar bu yöntemi izleyerek, IDR'lerin değişen ortamlar üzerine karmaşık hücre içi ortamda geçirdikleri konformasyonel değişiklikler hakkında değerli bilgiler edinebilirler.

Intrinsically disordered regions (IDRs) are critical components in cellular processes1. In combination with structured domains, IDRs are essential for protein functions. The amino acid composition of IDRs is biased, represented mainly by charged, hydrophilic, and small residues. Because of this property, IDRs are considered low complexity domains2,3. Numerous IDRs have garnered attention, primarily because these regions play a crucial role in pathological conditions, particularly neurodegenerative diseases. Such diseases are characterized by self-assembly and subsequent extracellular or intracellular deposition of IDRs in neurons4. Examples of such IDRs include amyloid-&#946;&#160;(A&#946;) in Alzheimer&#39;s disease, huntingtin (HTT) in Huntington&#39;s disease, and TAR DNA-binding protein-43 (TDP-43) and fused in sarcoma (FUS) in amyotrophic lateral sclerosis and frontotemporal dementia4. The study of the structural rearrangements of IDRs in the context of disease has been significantly enhanced by spectroscopic methods, including fluorescence resonance energy transfer (FRET).
The hydrophilic and extended nature of IDRs makes them extremely sensitive to changes in the physicochemical properties of the solution environment5. The degree by which the conformational ensemble of IDRs is modified by the environment is called structural sensitivity5,6,7. Different techniques can be used to study the conformation and dynamics of IDRs, including circular dichroism (CD) and small-angle X-ray scattering (SAXS)8,9. Unfortunately, CD and SAXS require large quantities of purified proteins, so they are not appropriate for studies in cells. In contrast, FRET is a technique that measures the fluorescence intensity of two fluorescent molecules that specifically label one IDR, meaning that they can be monitored in complex mixtures such as living cells10. Dynamically measuring the structural sensitivity of IDRs in living cells is necessary for understanding how the environment regulates the conformation and function of the disordered proteome.
FRET is a powerful method for quantifying the structural sensitivity of IDRs, as well as globular and multidomain proteins in living cells. The method requires a construct consisting of an IDR of interest sandwiched between two fluorescent proteins (FP), known as a FRET pair. For this protocol, we suggest the use of mCerulean3 as the donor FP and Citrine as the acceptor FP, because of their large dynamic range, compared to other FPs reported in a previous study about IDRs sensitivity6. FRET has previously been exploited to measure the structural sensitivity of a plant IDR in different cellular contexts6. In addition, this technique has been used to characterize overall protein dimensions of IDRs by different research groups both in vitro and in vivo5,11.
Here, we describe the ensemble FRET method for studying the structural sensitivity of IDRs in living yeast (Saccharomyces cerevisiae) cells. We show representative results that are based in a plant IDR called AtLEA4-5. AtLEA4-5 is disordered in solution, but folds into &#945;-helix when macromolecular crowding is induced in vitro12. AtLEA4-5 is a good reference model for this method because it is relatively small (158 residues), disordered and sensitive to environmental perturbation as reported in silico and in vitro6,12. The method presented here can be scaled for high throughput approaches because yeast cells are easy to grow, and the treatment is applied in small volumes. In addition, small modifications to the protocol can be applied to other cellular systems such as bacteria and plant cells6. The protocol can be performed in any molecular biology laboratory with access to a microplate reader with fluorescence mode, an equipment available in most research institutions.

Yazar Spotlight: Hücresel Algılama ve Tepkilerle Kendinden Düzensiz Bölgelerin Dünyasının Kilidini Açmak

Canlı Hücrelerde Hiperozmotik Strese Yanıt Olarak İntrinsik Olarak Düzensiz Bölgelerin Yapısal Duyarlılığının FRET Kullanılarak Tahmini

We aim to understand how intrinsically disordered regions sense and respond to changes in the physical chemical properties of the environment. We combine biophysical, biochemical, genetic, and cell biology techniques to monitor how the structural ensemble of disordered regions change in living cells. Protein biophysics techniques are currently used to study the confirmation of IVRs.These include nuclear magnetic resonance, circular dichroism, small angle x-ray scattering, and FRET. Most of these techniques can only be used in vitro. Studying the confirmation of IVRs in a cellular context is challenging with high cost and time consuming techniques.We provide an alternative to overcome these challenges. Our protocol can monitor the confirmation of IVRs in an easy, fast, and reproducible way, complementing other in vitro methods. Our findings offered an understanding of the molecular mechanisms underlying the structural sensitivity of IVRs under stress.This allows the use of IVRs as somatic biosensors. The precise tracking of the cellular environment will contribute to a more nuanced understanding of life's fundamental processes. Our research has led to questions about the determinants of a structural sensitivity in intrinsically disordered regions, its relevance to IVR's functions, and the environmental factors influencing these sensitivity.

Maya hücrelerini pDRFLIP38-AtLEA4-5 plazmidi ile dönüştürdükten sonra, pozitif transformantların floresansı bir mavi ışık transillightörü ve bir filtre ile gözlendi (Şekil 1). Hiperozmotik stresi indüklemek için farklı çözümlerin hazırlanması zaman alıcıdır, bu nedenle Şekil 2'deki 96 kuyucuklu şablonu izlemenizi öneririz. Değişen konsantrasyonlarda sodyum klorür ile hiperozmotik stres tedavisinden hemen sonra, floresan emisyon sp...

Watch this Scientific Journal Video about Estimation of Structural Sensitivity of Intrinsically Disordered Regions in Response to Hyperosmotic Stress in Living Cells Using FRET at JoVE.com

Doğası gereği düzensiz bölgeler (IDR'ler), çevresel değişikliklere yanıt olarak konformasyonlarını değiştiren esnek protein alanlarıdır. Topluluk floresan rezonans enerji transferi (FRET), farklı koşullar altında protein boyutlarını tahmin edebilir. Hiperozmotik stres altında yaşayan Saccharomyces cerevisiae hücrelerinde IDR yapısal duyarlılığını değerlendirmek için bir FRET yaklaşımı sunuyoruz.

Intrinsically disordered regions (IDRs) are protein domains that participate in crucial cellular processes. During stress conditions, the physicochemical ...

Doğası gereği düzensiz bölgelerin, çevrenin fiziksel kimyasal özelliklerindeki değişiklikleri nasıl algıladığını ve bunlara nasıl tepki verdiğini anlamayı amaçlıyoruz. Biyofiziksel, biyokimyasal, genetik ve hücre biyolojisi tekniklerini, düzensiz bölgelerin yapısal topluluğunun canlı hücrelerde nasıl değiştiğini izlemek için birleştiriyoruz. Protein biyofiziği teknikleri şu anda IVR'lerin doğrulanmasını incelemek için kullanılmaktadır.Bunlar arasında nükleer manyetik rezonans, dairesel dikroizm, küçük açılı x-ışını saçılımı ve FRET bulunur. Bu tekniklerin çoğu sadece in vitro olarak kullanılabilir. IVR'lerin onayını hücresel bağlamda incelemek, yüksek maliyet ve zaman alıcı tekniklerle zordur.Bu zorlukların üstesinden gelmek için bir alternatif sunuyoruz. Protokolümüz, IVR'lerin onayını kolay, hızlı ve tekrarlanabilir bir şekilde izleyebilir ve diğer in vitro yöntemleri tamamlayabilir. Bulgularımız, stres altındaki IVR'lerin yapısal duyarlılığının altında yatan moleküler mekanizmaların anlaşılmasını sağladı.Bu, IVR'lerin somatik biyosensörler olarak kullanılmasına izin verir. Hücresel ortamın hassas bir şekilde izlenmesi, yaşamın temel süreçlerinin daha incelikli bir şekilde anlaşılmasına katkıda bulunacaktır. Araştırmamız, içsel olarak düzensiz bölgelerde yapısal duyarlılığın belirleyicileri, IVR'ın işlevleriyle ilgisi ve bu duyarlılığı etkileyen çevresel faktörler hakkında sorulara yol açmıştır.

estimation-structural-sensitivity-intrinsically-disordered-regions

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Estimation of Structural Sensitivity of Intrinsically Disordered Regions in Response to Hyperosmotic Stress in Living Cells Using FRET

Intrinsically disordered regions (IDRs) are protein domains that participate in crucial cellular processes. During stress conditions, the physicochemical properties of the cellular environment change, directly impacting the conformational ensemble of IDRs. IDRs are inherently sensitive to environmental perturbations. Studying how the physicochemical properties of the cell regulate the conformational ensemble of IDRs is essential for understanding the environmental control of their function. Here, we describe a step-by-step method for measuring the structural sensitivity of IDRs in living Saccharomyces cerevisiae cells in response to hyperosmotic stress conditions. We present the use of ensemble fluorescence resonance energy transfer (FRET) to estimate how the global dimensions of IDRs change during a progressive increase of hyperosmotic stress imposed on cells with any osmolyte. In addition, we provide a script for processing fluorescence measurements and comparing structural sensitivity for different IDRs. By following this method, researchers can obtain valuable insights into the conformational changes that IDRs undergo in the complex intracellular milieu upon changing environments.

Intrinsically disordered regions (IDRs) are flexible protein domains that modify their conformation in response to environmental changes. Ensemble fluorescence resonance energy transfer (FRET) can estimate protein dimensions under different conditions. We present a FRET approach to assess IDR structural sensitivity in living Saccharomyces cerevisiae cells under hyperosmotic stress.