Name: Author Spotlight: Advancing Organoid Generation for Drug Development Using iPSCs
Uploaded: 2024-03-15T13:50:00
Description: Read this Scientific Article Protocol about Author Spotlight: Advancing Organoid Generation for Drug Development Using iPSC at JoVE.com

Forfatterne anerkender tidligere træning og generelle anbefalinger vedrørende start af hiPSC- og organoidarbejde fra Dr. Christina Pacak, Silveli Susuki-Hatano og Russell D'Souza. De takker Dr. Chelsey Simmons for hendes vejledning i at bruge hydrogelsystemer til in vitro-cellekulturarbejde . Forfatterne vil også gerne takke Dr. Christine Rodriguez og Thomas Allison fra STEMCELL Technologies for deres vejledning om hiPSC-kultur. Forfatterne takker også TheWell Bioscience for at dække publiceringsomkostningerne.

1. HiPSC vedligeholdelse
FORSIGTIG: Alt arbejde udføres i et biosikkerhedsskab (BSC) efter standard aseptiske teknikker. Skal følge OSHA's sikkerhedsstandarder for laboratorier, herunder korrekt brug af personlige værnemidler såsom laboratoriefrakker, handsker og beskyttelsesbriller.
<ol><li>Fremstilling af matricer, alikvoter og cellekulturmedier<ol><li>For kommercielt tilgængelige dyreafledte basalmembraner (BM'er; Matrix 1-AB, Matrix 2-AB, Matrix 3-AB), fremstilles a...

Matrix Comparison for Efficient Human Intestinal Organoid Generation from iPSCs

<ol>
	<li>Hynes, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrins:+Bidirectional,+allosteric+signaling+machines.">Integrins: Bidirectional, allosteric signaling machines.</a> Cell. 110 (6), 673-687 (2002).</li><li>Frantz, C., Stewart, K. M., Weaver, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+extracellular+matrix+at+a+glance.">The extracellular matrix at a glance.</a> J Cell Sci. 123, 4195-4200 (2010).</li><li>Hinz, B., Gabbiani, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibrosis:+Recent+advances+in+myofibroblast+biology+and+new+therapeutic+perspectives.">Fibrosis: Recent advances in myofibroblast biology and new therapeutic perspectives.</a> F1000 Biol Rep. 2, 78 (2010).</li><li>Pickup, M. W., Mouw, J. K., Weaver, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+extracellular+matrix+modulates+the+hallmarks+of+cancer.">The extracellular matrix modulates the hallmarks of cancer.</a> EMBO Rep. 15 (12), 1243-1253 (2014).</li><li>Rozario, T., DeSimone, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+extracellular+matrix+in+development+and+morphogenesis:+A+dynamic+view.">The extracellular matrix in development and morphogenesis: A dynamic view.</a> Dev Biol. 341 (1), 126-140 (2010).</li><li>Even-Ram, S., Artym, V., Yamada, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix+control+of+stem+cell+fate.">Matrix control of stem cell fate.</a> Cell. 126 (4), 645-647 (2006).</li><li>Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix+elasticity+directs+stem+cell+lineage+specification.">Matrix elasticity directs stem cell lineage specification.</a> Cell. 126 (4), 677-689 (2006).</li><li>Tran, O. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organ-specific+extracellular+matrix+directs+trans-differentiation+of+mesenchymal+stem+cells+and+formation+of+salivary+gland-like+organoids+in+vivo.">Organ-specific extracellular matrix directs trans-differentiation of mesenchymal stem cells and formation of salivary gland-like organoids in vivo.</a> Stem Cell Res Ther. 13 (1), 306 (2022).</li><li>Nikolaev, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homeostatic+mini-intestines+through+scaffold-guided+organoid+morphogenesis.">Homeostatic mini-intestines through scaffold-guided organoid morphogenesis.</a> Nature. 585 (7826), 574-578 (2020).</li><li>Gjorevski, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Designer+matrices+for+intestinal+stem+cell+and+organoid+culture.">Designer matrices for intestinal stem cell and organoid culture.</a> Nature. 539 (7630), 560-564 (2016).</li><li>Gjorevski, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+geometry+drives+deterministic+organoid+patterning.">Tissue geometry drives deterministic organoid patterning.</a> Science. 375 (6576), (2022).</li><li>Heo, J. H., Kang, D., Seo, S. J., Jin, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+the+extracellular+matrix+for+organoid+culture.">Engineering the extracellular matrix for organoid culture.</a> Int J Stem Cells. 15 (1), 60-69 (2022).</li><li>Shamir, E. R., Ewald, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+organotypic+culture:+experimental+models+of+mammalian+biology+and+disease.">Three-dimensional organotypic culture: experimental models of mammalian biology and disease.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 15 (10), 647-664 (2014).</li><li>Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+development+and+disease+with+organoids.">Modeling development and disease with organoids.</a> Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).</li><li>Jung, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+in+vitro+expansion+of+human+colonic+stem+cells.">Isolation and in vitro expansion of human colonic stem cells.</a> Nat Med. 17 (10), 1225-1227 (2011).</li><li>Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organogenesis+in+a+dish:+Modeling+development+and+disease+using+organoid+technologies.">Organogenesis in a dish: Modeling development and disease using organoid technologies.</a> Science. 345 (6194), 1247125 (2014).</li><li>Huch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+expansion+of+single+Lgr5++liver+stem+cells+induced+by+Wnt-driven+regeneration.">In vitro expansion of single Lgr5+ liver stem cells induced by Wnt-driven regeneration.</a> Nature. 494 (7436), 247-250 (2013).</li><li>Greenlee, A. R., Kronenwetter-Koepel, T. A., Kaiser, S. J., Liu, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+Matrigel+and+gelatin+substrata+for+feeder-free+culture+of+undifferentiated+mouse+embryonic+stem+cells+for+toxicity+testing.">Comparison of Matrigel and gelatin substrata for feeder-free culture of undifferentiated mouse embryonic stem cells for toxicity testing.</a> Toxicol In Vitro. 19 (3), 389-397 (2005).</li><li>Geltrex LDEV-Free, HESC-Qualified, Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix User Guide (Pub.No. MAN0007336 3.0. Fisher Scientific Available from: <a target="_blank" href="https://www.thermofisher.com/document-connect/document-connect.html?url=https://assets.thermofisher.cn/TFS-Assets%2FLSG%2Fmanuals%2FGeltrex_LDEV_Free_hESC_qualified_PI.pdf">https://www.thermofisher.com/document-connect/document-connect.html?url=https://assets.thermofisher.cn/TFS-Assets%2FLSG%2Fmanuals%2FGeltrex_LDEV_Free_hESC_qualified_PI.pdf</a> (2024)</li><li>biotechne R&amp;D Systems. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cultrex+Stem+Cell+Qualified+Reduced+Growth+Factor.">Cultrex Stem Cell Qualified Reduced Growth Factor.</a> biotechne R&amp;D Systems. , (2024).</li><li>VitroGel Organoid Protocol. TheWell Bioscience Available from: <a target="_blank" href="https://www.thewellbio.com/video-protocols">https://www.thewellbio.com/video-protocols</a> (2024)</li><li>Spence, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+into+intestinal+tissue+in+vitro.">Directed differentiation of human pluripotent stem cells into intestinal tissue in vitro.</a> Nature. 470 (7332), 105-110 (2011).</li><li>Henderson, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preimplantation+human+embryos+and+embryonic+stem+cells+show+comparable+expression+of+stage-specific+embryonic+antigens.">Preimplantation human embryos and embryonic stem cells show comparable expression of stage-specific embryonic antigens.</a> Stem Cells. 20 (4), 329-337 (2002).</li><li>Haruna, N. F., Huang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigating+the+dynamic+biophysical+properties+of+a+tunable+hydrogel+for+3D+cell+culture.">Investigating the dynamic biophysical properties of a tunable hydrogel for 3D cell culture.</a> J Cytol Tissue Biol. 7, 30 (2020).</li><li>Cherne, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+synthetic+hydrogel,+VitroGel+ORGANOID-3,+improves+immune+cell-epithelial+interactions+in+a+tissue+chip+co-culture+model+of+human+gastric+organoids+and+dendritic+cells.">A synthetic hydrogel, VitroGel ORGANOID-3, improves immune cell-epithelial interactions in a tissue chip co-culture model of human gastric organoids and dendritic cells.</a> Front Pharmacol. 12, 707891 (2021).</li><li>Stewart, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+assessment+of+intestinal+stiffness+and+associations+with+fibrosis+in+human+inflammatory+bowel+disease.">Quantitative assessment of intestinal stiffness and associations with fibrosis in human inflammatory bowel disease.</a> PLoS One. 13, e0200377 (2018).</li><li>Hernandez-Gordillo, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fully+synthetic+matrices+for+in+vitro+culture+of+primary+human+intestinal+enteroids+and+endometrial+organoids.">Fully synthetic matrices for in vitro culture of primary human intestinal enteroids and endometrial organoids.</a> Biomaterials. 254, 120125 (2020).</li><li>Broguiere, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+of+epithelial+organoids+in+a+defined+hydrogel.">Growth of epithelial organoids in a defined hydrogel.</a> Adv Mater. 30, 1801621 (2018).</li><li>Barthes, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+microenvironment+engineering+and+monitoring+for+tissue+engineering+and+regenerative+medicine:+The+recent+advances.">Cell microenvironment engineering and monitoring for tissue engineering and regenerative medicine: The recent advances.</a> BioMed Res Int. 2014, 921905 (2014).</li><li>Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix+elasticity+directs+stem+cell+lineage+specification.">Matrix elasticity directs stem cell lineage specification.</a> Cell. 126 (4), 677-689 (2006).</li><li>Aisenbrey, E. A., Murphy, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+alternatives+to+Matrigel.">Synthetic alternatives to Matrigel.</a> Nat Rev Mater. 5 (7), 539-551 (2020).</li></ol>

Valg af det optimale mikromiljø til stamcelle- og organoidarbejde er et afgørende tidligt skridt, når man bruger disse platforme til en bred vifte af applikationer. Vores repræsentative resultater viser, at Matrix 4-XFO3 i kombination med en højere koncentration af vækstfaktorer fører til større organoider, hvilket tyder på, at de fysiske egenskaber af xenofrie hydrogeler kan udnyttes til at optimere organoidgenerering ved hjælp af disse systemer. Det er tidligere blevet vist, at de unikke egenskaber ved den ek...

Den ekstracellulære matrix (ECM) er en dynamisk og multifunktionel komponent i væv, der spiller en central rolle i reguleringen af celleadfærd og udvikling. Som et komplekst netværk giver det strukturel støtte, celleklæbende ligander1 og lagring af vækstfaktorer og cytokiner, der regulerer cellesignalering. For eksempel fungerer ECM under sårheling som et stillads for migrerende celler og som et reservoir af vækstfaktorer, der er involveret i vævsreparation2. På samme måde kan dysregulering i ECM føre til en stigning i sværhedsgraden af forskellige sygdomme såsom fibrose og kræft 3,4. Under embryonal udvikling styrer ECM vævsmorfogenese. For eksempel spiller ECM-komponenter i udviklingen af hjertet en rolle i at skabe den korrekte arkitektur og funktion af hjertevævet5. Over et årtis forskning har vist, at stivheden af mikromiljøetalene 6,7 kan kontrollere stamcelleafstamningsspecifikationen. Derfor er det ikke overraskende, at ECM under in vitro-celledifferentiering påvirker stamcellernes skæbne ved at give signaler til differentiering.
Organoider kan genereres fra inducerede pluripotente stamceller (iPSC'er). Det er nødvendigt at starte med en korrekt karakteriseret iPSC-linje for at generere organoider med succes. Manglen på fysiologiske signaler i klassiske cellekulturmaterialer hindrer imidlertid effektiv iPSC-differentiering og organoidgenerering. Desuden har nyere forskning understreget betydningen af sammensætningen af den ekstracellulære matrix (ECM), interaktioner mellem celler og ECM8 samt mekaniske og geometriske signaler 9,10,11 i forbindelse med organoid ekspansion og differentiering12. At fremme organoidteknologi ved at forbedre reproducerbarheden vil involvere inkorporering af vævsspecifikke fysiske og kemiske signaler.
Organoider sigter mod at rekapitulere det oprindelige væv i et fysiologisk lignende mikromiljø. At vælge et ECM-system, der nøje efterligner det oprindelige vævs ECM, er afgørende for at opnå fysiologisk relevans med hensyn til celleadfærd, funktion og respons på stimuli13. Valget af ECM-komponenter kan påvirke differentieringen af stamceller til specifikke celletyper i organoiden. Forskellige ECM-proteiner og deres kombinationer kan give signaler, der styrer cellens skæbne14. For eksempel har undersøgelser vist, at brug af specifikke ECM-komponenter kan fremme differentieringen af tarmstamceller til modne tarmcelletyper, hvilket resulterer i fysiologisk relevante tarmorganoider15. Mens organoider er et værdifuldt værktøj under sygdomsmodellering og lægemiddeltestning, er det afgørende for denne applikation at vælge et passende ECM-system. Et passende ECM-system kan forbedre nøjagtigheden af sygdomsmodellering ved at skabe et mikromiljø, der ligner det berørte væv16. Desuden kan vævsspecifik ECM hjælpe med at generere organoider, der bedre rekapitulerer sygdomsassocierede fænotyper og lægemiddelresponser17. Optimering af ECM-systemet, der bruges til organoiddifferentiering, er afgørende for at opnå de ønskede differentieringsresultater.
Kommercielt tilgængelige basalmembransystemer afledt af animalske ECM-kilder (f.eks. Matrigel, Cultrex) og xenofri hydrogel (f.eks. VitroGel) bruges i vid udstrækning i iPSC og organoidforskning. Virksomheder, der kommercialiserer dem, og forskere, der bruger dem, har lagt mange instruktioner til deres specifikke produkter og applikationer gennem årene. Mange af disse instruktioner tjente som en vejledning til genereringen af denne protokol. Desuden er fordelene og tilbageslagene forbundet med deres iboende egenskaber blevet bemærket individuelt af mange 18,19,20,21. Der er dog ingen systematisk arbejdsgang til at guide udvælgelsen af optimale systemer til iPSC- og organoidarbejde. Her er der en arbejdsgang til systematisk evaluering af ækvivalensen af ECM-systemer fra forskellige kilder til iPSC- og organoidarbejde. Dette er en sammenlignende undersøgelse af vedligeholdelsen af to forskellige humane iPSC-linjer (hiPSC) og humane tarmorganoider (hIO) i fire forskellige matricer: Matrigel (Matrix 1-AB), Geltrex (Matrix 2-AB), Cultrex (Matrix 3-AB) og VitroGel (Matrix 4-XF). Til organoiddyrkning blev der anvendt fire versioner af den xenofrie matrix VitroGel, der tidligere var optimeret til organoidkultur: ORGANOID 1 (Matrix 4-O1), ORGANOID 2 (Matrix 4-O2), ORGANOID 3 (Matrix 4-O3), ORGANOID 4 (Matrix 4-O4). Der blev også anvendt animalske afledte matricer, der er optimeret til organoider: Matrigel High Concentration (Matrix 1-ABO) og Cultrex Type 2 (Matrix 3-ABO). Kommercielt tilgængelige stamcellekulturmedier (mTeSR Plus) og organoiddifferentieringssæt (STEMdiff intestinal organoid kit) blev brugt. Denne protokol kombinerer de individuelle instruktioner fra produktproducenterne med laboratorieerfaringer for at guide læseren mod en vellykket optimering af ECM til deres specifikke iPSC- og organoidarbejde. Alt i alt understreger denne protokol og repræsentative resultater vigtigheden af at vælge det optimale mikromiljø til stamcellearbejde og organoiddifferentiering.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>24-Well Plate (Culture treated, sterile)</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>37 &#176;C water bath</td>
			<td>VWR</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plate&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB012931</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Advanced DMEM/F12</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>12634</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-adherence Rinsing Solutio</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>7010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biological safety cabinet (BSC)</td>
			<td>Labconco&#160;</td>
			<td>Logic</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brightfield Microscope</td>
			<td>Echo Rebel</td>
			<td>REB-01-E2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BXS0116</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>ACS-1030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge with temperature control (4 &#176;C capabilities)</td>
			<td>ThermoScientific</td>
			<td>75002441</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical tubes, 15 mL, sterile</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>339650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical tubes, 50 mL, sterile</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>339652</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cultrex RGF BME, Type 2</td>
			<td>Bio-techne</td>
			<td>3533-005-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cultrex Stem Cell Qualified RGF BME&#160;</td>
			<td>Bio-techne</td>
			<td>3434-010-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-PBS (Without Ca++ and Mg++)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14190144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeltrexLDEV-Free, hESC-Qualified Reduce Growth Factor</td>
			<td>Gibco&#160;</td>
			<td>A14133-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX Supplement</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>35050-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guava Muse Cell Analyzer or another flow cytometry equipment (optional)</td>
			<td>Luminex</td>
			<td>0500-3115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES buffer solution</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>15630-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heralcell Vios Cell culture incubator (37 &#176;C, 5% CO2)</td>
			<td>Thermo Scientific&#160;</td>
			<td>51033775</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>JMP Software</td>
			<td>SAS Institute</td>
			<td>JMP 16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MATLAB</td>
			<td>MathWorks, Inc</td>
			<td>R2022b</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix LDEV free</td>
			<td>Corning&#160;</td>
			<td>356231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel Matrix High Concentration (HC), Growth Factor Reduced (GFR) LDEV-free</td>
			<td>Corning&#160;</td>
			<td>354263</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mTeSR Plus Medium</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>100-0276</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunclon Delta surface treated 24-well plate</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>144530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE Mouse Anti-human CD326 (EpCAM)</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td>566841</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE Mouse Anti-human CDX2&#160;</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td>563428</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE Mouse Anti-human FOXA2</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td>561589</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PerCP-Cy 5.5 Mouse Anti-human SSEA4&#160;</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td>561565</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ReLeSR</td>
			<td>STEMCELL</td>
			<td>5872</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SCTi003-A</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>200-0510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipettes (10 mL)&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-678-11E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipettes (5 mL)&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-678-11D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>STEMdiff Intestinal Organoid Growth Medium</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>5145</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>STEMdiff Intestinal Organoid Kit</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>5140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitrogel Hydrogel Matrix</td>
			<td>TheWell Bioscience</td>
			<td>VHM01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VitroGel ORGANOID Discovery Kit</td>
			<td>TheWell Bioscience</td>
			<td>VHM04-K</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

comparative study of basement-membrane matrices for human stem cell maintenance and intestinal organoid generation

Ekstracellulær matrix (ECM) spiller en afgørende rolle i cellernes adfærd og udvikling. Organoider genereret fra humant inducerede pluripotente stamceller (hiPSC'er) er i søgelyset på mange forskningsområder. Manglen på fysiologiske signaler i klassiske cellekulturmaterialer hindrer imidlertid effektiv iPSC-differentiering. Inkorporering af kommercielt tilgængelig ECM i stamcellekultur giver fysiske og kemiske signaler, der er gavnlige for cellevedligeholdelse. Animalske kommercielt tilgængelige basalmembranprodukter er sammensat af ECM-proteiner og vækstfaktorer, der understøtter cellevedligeholdelse. Da ECM har vævsspecifikke egenskaber, der kan modulere celleskæbne, bruges xeno-frie matricer til at streame oversættelse til kliniske undersøgelser. Mens kommercielt tilgængelige matricer er meget udbredt i hiPSC- og organoidarbejde, er ækvivalensen af disse matricer endnu ikke blevet evalueret. Her blev der udført en sammenlignende undersøgelse af hiPSC-vedligeholdelse og generering af humane tarmorganoider (hIO) i fire forskellige matricer: Matrigel (Matrix 1-AB), Geltrex (Matrix 2-AB), Cultrex (Matrix 3-AB) og VitroGel (Matrix 4-XF). Selvom kolonierne manglede en perfekt rund form, var der minimal spontan differentiering, hvor over 85 % af cellerne udtrykte stamcellemarkøren SSEA-4. Matrix 4-XF førte til dannelsen af 3D-runde klumper. Forøgelse af koncentrationen af tilskuds- og vækstfaktorer i de medier, der bruges til at fremstille Matrix 4-XF-hydrogelopløsningen, forbedrede også hiPSC-ekspressionen af SSEA-4 med 1,3 gange. Differentiering af Matrix 2-AB-vedligeholdt hiPSC førte til færre sfæroidudslip i midt-/bagtarmsstadiet sammenlignet med de andre dyreafledte basalmembraner. Sammenlignet med andre fører den xeno-fri organoidmatrix (Matrix 4-O3) til større og mere moden hIO, hvilket tyder på, at de fysiske egenskaber af xeno-frie hydrogeler kan udnyttes til at optimere organoidgenerering. Alt i alt tyder resultaterne på, at variationer i sammensætningen af forskellige matricer påvirker stadier af IO-differentiering. Denne undersøgelse øger bevidstheden om forskellene i kommercielt tilgængelige matricer og giver en guide til matrixoptimering under iPSC- og IO-arbejde.

The extracellular matrix (ECM) is a dynamic and multifunctional component of tissues that plays a central role in regulating cell behavior and development. As a complex network, it provides structural support, cell adhesive ligands1, and storage of growth factors and cytokines that regulate cell signaling. For example, during wound healing, the ECM serves as a scaffold for migrating cells and as a reservoir of growth factors involved in tissue repair2. Similarly, dysregulation in the ECM can lead to an increase in the severity of various diseases such as fibrosis and cancer3,4. During embryonic development, the ECM guides tissue morphogenesis. For example, in the development of the heart, ECM components play a role in creating the correct architecture and function of the heart tissue5. Over a decade of research has shown that the stiffness of the microenvironment alone6,7 can control stem cell lineage specification. Therefore, it is not surprising that during in vitro cell differentiation, ECM influences stem cell fate by providing signals for differentiation.
Organoids can be generated from induced pluripotent stem cells (iPSCs). Starting with a properly characterized iPSC line is required to generate organoids successfully. However, the lack of physiological cues in classical cell culture materials hinders efficient iPSC differentiation and organoid generation. Moreover, recent research has emphasized the significance of the composition of the extracellular matrix (ECM), interactions between cells and the ECM8, as well as mechanical and geometrical cues9,10,11 in the context of organoid expansion and differentiation12. Advancing organoid technology by improving reproducibility will involve incorporating tissue-specific physical and chemical cues.
Organoids aim to recapitulate the native tissue within a physiologically similar microenvironment. Choosing an ECM system that closely mimics the native tissue ECM is crucial for achieving physiological relevance regarding cell behavior, function, and response to stimuli13. The choice of ECM components can influence the differentiation of stem cells into specific cell types within the organoid. Different ECM proteins and their combinations can provide cues that guide cell fate14. For example, studies have shown that using specific ECM components can promote the differentiation of intestinal stem cells into mature intestinal cell types, resulting in physiologically relevant intestinal organoids15. While organoids are a valuable tool during disease modeling and drug testing, selecting an appropriate ECM system is pivotal to this application. An appropriate ECM system can enhance the accuracy of disease modeling by creating a microenvironment that resembles the affected tissue16. Furthermore, tissue-specific ECM can help generate organoids that better recapitulate disease-associated phenotypes and drug responses17. Optimizing the ECM system used in organoid differentiation is critical for achieving desired differentiation outcomes.
Commercially available basement membrane systems derived from animal ECM sources (e.g., Matrigel, Cultrex) and xeno-free hydrogel (e.g., VitroGel) are widely used in iPSC and organoid research. Companies that commercialize them and researchers that use them have laid out many instructions for their specific products and applications over the years. Many of these instructions served as a guide for the generation of this protocol. Furthermore, the benefits and setbacks associated with their intrinsic properties have been individually noted by many18,19,20,21. However, there is no systematic workflow to guide the selection of optimal systems for iPSC and organoid work. Here, a workflow to systematically evaluate the equivalency of ECM systems from various sources for iPSC and organoid work is provided. This is a comparative study of the maintenance of two different human iPSC lines (hiPSC) and human intestinal organoids (hIO) generation in four different matrices: Matrigel (Matrix 1-AB), Geltrex (Matrix 2-AB), Cultrex (Matrix 3-AB), and VitroGel (Matrix 4-XF). For organoid culture, four versions of the xeno-free matrix VitroGel that were previously optimized for organoid culture were used: ORGANOID 1 (Matrix 4-O1), ORGANOID 2 (Matrix 4-O2), ORGANOID 3 (Matrix 4-O3), ORGANOID 4 (Matrix 4-O4). Also, animal-derived matrices optimized for organoids were used: Matrigel High Concentration (Matrix 1-ABO) and Cultrex Type 2 (Matrix 3-ABO). Commercially available stem cell culture media (mTeSR Plus) and organoid differentiation kit (STEMdiff intestinal organoid kit) were used. This protocol combines the individual instructions from the products&#39; manufacturers with lab experiences to guide the reader toward a successful optimization of ECM for their specific iPSC and organoid work. Altogether, this protocol and representative results emphasize the importance of selecting the optimal microenvironment for stem cell work and organoid differentiation.

Author Spotlight: Advancing Organoid Generation for Drug Development Using iPSCs

Sammenlignende undersøgelse af basalmembranmatricer til vedligeholdelse af humane stamceller og generering af tarmorganoider

Efter denne protokol blev kommercielt tilgængelige basalmembraner og et xeno-frit hydrogelsystem med succes brugt til at dyrke hiPSC-celler og differentiere dem til hIO. Hovedformålet med disse eksperimenter var systematisk at evaluere ækvivalensen af matricer fra forskellige kilder til hiPSC- og hIO-arbejde. Det første afsnit af denne protokol fokuserede på vedligeholdelse og karakterisering af en sund iPSC-kultur, der giver en effektiv tarmorganoidgenerering. Processen med at belægge dyrkningsvaren med animalske ...

Read this Scientific Article Protocol about Author Spotlight: Advancing Organoid Generation for Drug Development Using iPSC at JoVE.com

Organoider er blevet værdifulde værktøjer til sygdomsmodellering. Den ekstracellulære matrix (ECM) styrer cellens skæbne under organoidgenerering, og ved at bruge et system, der ligner det oprindelige væv, kan det forbedre modellens nøjagtighed. Denne undersøgelse sammenligner genereringen af inducerede pluripotente stamceller-afledte humane tarmorganoider i dyreafledte ECM og xeno-frie hydrogeler.

Extracellular matrix (ECM) plays a critical role in cell behavior and development. Organoids generated from human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) ...

Vores forskning sigter mod at integrere vitro- og in silico-modeller for at informere lægemiddelopdagelse og -udvikling på tidlige stadier af udviklingen. I en nøddeskal kombinerer vi stamcelleteknologi, organoider og mikrofluidik for at undersøge lægemiddelsygdomsinteraktioner, membranintegritet og for at forudsige lægemiddelabsorption og lægemiddelmetabolisme. Inden for vores felt omfatter banebrydende teknologier fysiologisk baseret i siliciummodeller i kombination med avancerede in vitro-systemer som mikrofysiologiske systemer, som organer på en chip og organoider.Derudover udforskes 3D-bioprint i øjeblikket for at maksimere skalerbarheden af disse mere komplekse in vitro-modeller. Nuværende eksperimentelle udfordringer omfatter forbedring af vævsmikromiljøer og fysiologisk troværdighed af disse in vitro-modeller, minimering af den eksperimentelle variabilitet og optimering af høj gennemstrømningskapacitet. Etablering af standardiserede protokoller, der er i overensstemmelse med de regulatoriske standarder for lægemiddeludvikling.Med det mål at mindske den eksperimentelle variabilitet, bedre efterligne vævsmikromiljøet og overholde de regulatoriske retningslinjer for udvikling af humane lægemidler, beskriver denne protokol optimeringen af en organoidgenerering og vedligeholdelsen af dette organoidsystem ved hjælp af et cellefrit hydrogelsystem med en kontrolsammensætning og kontrolmekaniske egenskaber. Vi er interesserede i at udvikle mikrofysiologiske systemer til at modellere i særlige populationer, der ikke er godt repræsenteret i kliniske forsøg, som for eksempel mennesker, der lever med Downs syndrom. Vores laboratorium arbejder også på at bringe nye immunonkologibaserede behandlingstilgange til nye miljøer på tværs af mave-tarm- og lungekræft.