SJ er modtager af ph.d.-stipendiet fra DAE-TIFR, og bevillingen er anerkendt. KRV anerkender DBT B-Life-tilskuddet DBT/PR12422/MED/31/287/2014 og støtten fra Department of Atomic Energy, Indiens regering, under projektidentifikation nr. RTI4006.

1. Modellering af phosphoenolpyruvat (PEP) i enolase fra Mycobacterium tuberculosis
<ol><li>Identifikation af ligandtæthed i kryoEM-kortet over PEP-enolase-komplekset<ol><li>Download de uskarpe halvkort (emd_30988_additional_1.map og emd_30988_additional_2.map) af apo-enolase fra de yderligere data i EMDB (se materialefortegnelsen).</li>
		<li>Åbn ChimeraX (se materialefortegnelsen). Åbn halvkortene af apo-enolase ved at klikke på Åbn fra...

Modellering af små molekyleligander i CryoEM-kort over makromolekyler

Forfatterne har intet at afsløre.

Forbedringerne i mikroskophardware og -software har resulteret i en stigning i antallet af cryoEM-strukturer i de senere år. Selvom den højeste opløsning, der opnås i øjeblikket i enkeltpartikelkryoEM, er 1,2 Å 57,58,59, bestemmes størstedelen af strukturerne omkring 3-4 Å opløsning. Modellering af ligander i kort med medium til lav opløsning kan være vanskelig og ofte fyldt med tvetydighed. I betragtning af den udbre...

Celler udfører deres funktioner ved at udføre utallige kemiske reaktioner samtidigt og uafhængigt, hver omhyggeligt reguleret for at sikre deres overlevelse og tilpasningsevne som reaktion på miljømæssige signaler. Dette opnås ved molekylær genkendelse, som gør det muligt for biomolekyler, især proteiner, at danne forbigående eller stabile komplekser med andre makromolekyler såvel som små molekyler eller ligander1. Således er protein-ligand-interaktioner grundlæggende for alle processer i biologien, som omfatter regulering af proteinekspression og aktivitet, enzymers genkendelse af substrater og cofaktorer, samt hvordan celler opfatter og videresender signaler 1,2. En bedre forståelse af de kinetiske, termodynamiske og strukturelle egenskaber af protein-ligand-komplekset afslører det molekylære grundlag for ligandinteraktion og letter også rationelt lægemiddeldesign ved at optimere lægemiddelinteraktion og specificitet. En økonomisk og hurtigere tilgang til at studere protein-ligand-interaktion er at bruge molekylær docking, som er en beregningsmetode, der virtuelt screener en bred vifte af små molekyler og forudsiger bindingstilstanden og affiniteten af disse ligander til målproteiner3. Imidlertid giver eksperimentelle beviser fra højopløselige strukturer bestemt ved røntgendiffraktion (XRD), kernemagnetisk resonans (NMR) eller elektronkryomikroskopi (cryoEM) det væsentlige bevis for sådanne forudsigelser og hjælper med udviklingen af nyere og mere effektive aktivatorer eller hæmmere for et givet mål. Denne artikel bruger forkortelsen 'cryoEM', som teknikken almindeligvis omtales. Der er dog en igangværende debat om valg af den korrekte nomenklatur, og for nylig er udtrykket kryogeniskprøve Electron Microscopy (cryoEM) blevet foreslået for at indikere, at prøven er ved kryogen temperatur og afbilledet med elektroner4. På samme måde er kortene afledt af cryoEM blevet kaldt elektronpotentiale, elektrostatisk potentiale eller Coulomb-potentiale, og for nemheds skyld bruger vi her cryoEM-kort 5,6,7,8,9,10.
Selvom XRD har været guldstandardteknikken til højopløsningsstrukturbestemmelse af protein-ligandkomplekser, har11 cryoEM efter opløsningsrevolution taget fart, som indikeret af stigningen i Coulomb-potentialekort eller kryoEM-kort deponeret i Electron Microscopy Database (EMDB)12,13 i løbet af de sidste par år14. På grund af fremskridt inden for prøveforberedelse, billeddannelse og databehandlingsmetoder steg antallet af Protein Data Bank (PDB)14-aflejringer, der anvender cryoEM, fra 0,7 % til 17 % mellem 2010 og 2020, hvor ca. 50 % af de rapporterede strukturer i 2020 blev bestemt ved 3,5 Å opløsning eller bedre15,16. CryoEM er hurtigt blevet vedtaget af det strukturelle biologiske samfund, herunder medicinalindustrien, da det tillader undersøgelse af fleksible og ikke-krystallinske biologiske makromolekyler, især membranproteiner og multiproteinkomplekser, ved næsten atomar opløsning, overvinde krystallisationsprocessen og opnå veldiffrakterende krystaller, der kræves til højopløsningsstrukturbestemmelse ved XRD.
Nøjagtig modellering af liganden i cryoEM-kortet er altafgørende, da det fungerer som en plan for protein-ligandkomplekset på molekylært niveau. Der er flere automatiserede ligandbygningsværktøjer, der bruges i røntgenkrystallografi, der afhænger af formen og topologien af ligandtætheden for at passe eller bygge liganden ind i elektrontætheden 17,18,19,20. Ikke desto mindre, hvis opløsningen er lavere end 3 Å, har disse tilgange en tendens til at give mindre ønskværdige resultater, fordi de topologiske træk, som de er afhængige af for at blive anerkendt og opbygget, bliver mindre definerede. I mange tilfælde har disse metoder vist sig at være ineffektive til nøjagtig modellering af ligander til kryoEM-kort, da disse kort er blevet bestemt i området lav til medium opløsning, typisk mellem 3,5 Å-5 Å17.
Det første trin i 3D-strukturbestemmelse af et protein-ligandkompleks ved cryoEM involverer enten samoprensning af liganden med proteinet (når liganden har en høj bindingsaffinitet til proteinet) eller inkubering af proteinopløsningen med liganden i en bestemt varighed før gitterforberedelse. Efterfølgende placeres et lille prøvevolumen på et plasmarenset hullet TEM-gitter, efterfulgt af flashfrysning i flydende ethan og til sidst billeddannelse med en kryo-TEM. 2D-projektionsbillederne fra hundredtusinder til millioner af individuelle partikler er gennemsnittet for at rekonstruere et 3-dimensionelt (3D) Coulomb-potentialekort over makromolekylet. Identifikation og modellering af ligander og opløsningsmiddelmolekyler i disse kort udgør betydelige udfordringer i mange tilfælde på grund af den anisotrope opløsning på tværs af kortet (dvs. opløsningen er ikke ensartet på tværs af makromolekylet), fleksibilitet i det område, hvor liganden er bundet, og støjen i dataene. Mange af de modellerings-, forfinings- og visualiseringsværktøjer, der blev udviklet til XRD, bliver nu tilpasset til brug i cryoEM til samme formål 18,19,20,21. I denne artikel præsenteres en oversigt over forskellige metoder og software, der i øjeblikket bruges til at identificere ligander, bygge modeller og forfine koordinaterne afledt af cryoEM. En trin-for-trin protokol er blevet leveret for at illustrere de processer, der er involveret i modellering af ligander ved hjælp af specifikke protein-ligandkomplekser med varierende opløsning og kompleksitet.
Det første trin i modellering af ligander i cryoEM-kort inkluderer identifikation af ligandtætheden (ikke-protein) i kortet. Hvis ligandbinding ikke inducerer nogen konformationsændring i proteinet, så fremhæver beregning af et simpelt forskelskort mellem protein-ligandkomplekset og apo-proteinet i det væsentlige regionerne med ekstra tæthed, hvilket tyder på tilstedeværelsen af liganden. Sådanne forskelle kan observeres med det samme, da det kun kræver to kort, og selv mellemliggende kort under 3D-forfiningsprocessen kan bruges til at kontrollere, om liganden er til stede. Derudover, hvis opløsningen er høj nok (<3,0 Å), kan forskelskortet også give indsigt i placeringen af vandmolekyler såvel som ioner, der interagerer med liganden og proteinresterne.
I mangel af apo-protein-kortet er det nu muligt at bruge Servalcat22, som er tilgængeligt som et selvstændigt værktøj og også er blevet integreret i CCP-EM-softwarepakken23,24 som en del af Refmac-forfiningen og i CCP4 8.0 version25,26. Servalcat tillader beregning af et FSC-vægtet forskelskort (Fo-Fc) ved hjælp af de uskarpe halvafbildninger og apoproteinmodellen som input. Fo-Fc udeladelseskortet repræsenterer forskellen mellem det eksperimentelle kort (Fo) og det kort, der er afledt af modellen (Fc). I mangel af en ligand i modellen antyder en positiv tæthed i et Fo-Fc-kort, der overlapper med det eksperimentelle EM-kort, typisk tilstedeværelsen af liganden. Antagelsen her er, at proteinkæden passer godt ind på kortet, og den resterende positive tæthed angiver ligandens placering. Det er dog vigtigt omhyggeligt at undersøge, om den positive tæthed stammer fra modelleringsunøjagtigheder, såsom den forkerte rotamer af en proteinsidekæde.
Det andet trin involverer opnåelse eller oprettelse af en kartesisk koordinatfil af liganden med veldefineret geometri fra den tilgængelige kemiske information. Standardligander (f.eks. ATP og NADP+), der allerede er tilgængelige i CCP4-monomerbiblioteket, kan bruges til forfining ved at hente koordinat- og geometrifilerne via deres monomertiltrædelseskode. For ukendte eller ikke-standardiserede ligander er der dog forskellige værktøjer til rådighed til at oprette geometrifilerne. Nogle af eksemplerne omfatter eLBOW27 - (elektronisk ligandbygger og optimeringsarbejdsbord) i Phoenix28, Lidia - et indbygget værktøj i Coot29, JLigand/ACEDRG 30,31, CCP-EM23,24, Ligprep32-et modul af Glide i Schrödinger-pakken. Ligandkoordinatfilen monteres derefter i tætheden, styret af både det eksperimentelle kryoEM-kort og differenskortet i Coot. Dette efterfølges af forfining i det virkelige rum i Phoenix28 eller gensidig forfining i Refmac33. En Linux-arbejdsstation eller en bærbar computer udstyret med et godt grafikkort og ovennævnte software er påkrævet. De fleste af disse programmer er inkluderet i forskellige suiter. CCP-EM24 og Phenix28 er frit tilgængelige for akademiske brugere og inkluderer en række værktøjer, der bruges i denne artikel, herunder Coot, Refmac5 33,34,35,36, Servalcat, phenix.real_space_refine osv. På samme måde giver Chimera37 og ChimeraX38 gratis licenser til akademiske brugere.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>CCP4-8.0</td>
			<td>Consortium of several institutes</td>
			<td>https://www.ccp4.ac.uk</td>
			<td>Free for academic users and includes Coot and list of tools developed for X-ray crystallography</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCP-EM</td>
			<td>Consortium of several institutes</td>
			<td>https://www.ccpem.ac.uk/download.php</td>
			<td>Free for academic users and includes Coot, Relion and many others</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coot&#160;</td>
			<td>Paul Emsley, LMB, Cambridge</td>
			<td>https://www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/personal/pemsley/coot/</td>
			<td>General software for model building but also available with other suites described above</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DockinMap (Phenix)</td>
			<td>Consortium of several institutes</td>
			<td>https://phenix-online.org/documentation/reference/dock_in_map.html</td>
			<td>Software inside the Phenix suite for docking model into cryoEM maps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electron Microscopy Data Bank&#160;</td>
			<td>Consortium of several institutes</td>
			<td>https://www.ebi.ac.uk/emdb/</td>
			<td>Public Repository for Electron Microscopy maps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/MSD/Technical-Notes/Falcon-3EC-Datasheet.pdf</td>
			<td>Commercial, camera from Thermo Fisher&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenix&#160;</td>
			<td>Consortium of several institutes</td>
			<td>https://phenix-online.org/download</td>
			<td>Free for academic users and includes Coot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein Data Bank</td>
			<td>Consortium of several institutes</td>
			<td>https://rcsb.org</td>
			<td>Public database of macromolecular structures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pymol</td>
			<td>Schrodinger</td>
			<td>https://pymol.org/2/</td>
			<td>Molecular viusalization tool. Educational version is free but comes with limitation. The full version can be obtained with a small fee.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Relion</td>
			<td>MRC-LMB, Cambridge</td>
			<td>https://relion.readthedocs.io/en/release-4.0/Installation.html</td>
			<td>Software for cryoEM image processing, also available with CCP-EM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Titan Krios</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>https://www.thermofisher.com/in/en/home/electron-microscopy/products/transmission-electron-microscopes/krios-g4-cryo-tem.html?cid=msd_ls_xbu_xmkt_tem-krios_285811_gl_pso_gaw_tpne1c&#38; 
			gad_source=1&#38;gclid=CjwKCAiA-P-rBhBEEiwAQEXhHyw5c8MKThmdA 
			AkZesWC4FYQSwIQRk 
			ZApkj08MfYG040DtiiuL8 
			RihoCebEQAvD_BwE</td>
			<td>Commercial, cryoTEM from Thermo Fisher</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UCSF Chimera</td>
			<td>UCSF, USA</td>
			<td>https://www.cgl.ucsf.edu/chimera/download.html</td>
			<td>General purpose software for display, analysis and more</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UCSF Chimera X</td>
			<td>UCSF, USA</td>
			<td>https://www.cgl.ucsf.edu/chimerax/</td>
			<td>General purpose software for display, analysis and more</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

modeling ligands into maps derived from electron cryomicroscopy

Dechifrering af protein-ligand-interaktionerne i et makromolekylært kompleks er afgørende for at forstå den molekylære mekanisme, underliggende biologiske processer og lægemiddeludvikling. I de senere år er kryogen prøveelektronmikroskopi (cryoEM) dukket op som en kraftfuld teknik til at bestemme makromolekylers strukturer og til at undersøge ligandbindingstilstanden ved næsten atomar opløsning. Identifikation og modellering af ikke-proteinmolekyler i cryoEM-kort er ofte udfordrende på grund af anisotropisk opløsning på tværs af molekylet af interesse og iboende støj i dataene. I denne artikel introduceres læserne til forskellige software og metoder, der i øjeblikket bruges til ligandidentifikation, modelopbygning og forfining af atomare koordinater ved hjælp af udvalgte makromolekyler. En af de enkleste måder at identificere tilstedeværelsen af en ligand på, som illustreret med enolase-enzymet, er at trække de to kort opnået med og uden liganden. Den ekstra tæthed af liganden vil sandsynligvis skille sig ud i forskelskortet selv ved en højere tærskel. Der er tilfælde, som vist i tilfældet med metabotrop glutamatreceptor mGlu5, hvor sådanne simple forskelskort ikke kan genereres. Den nyligt introducerede metode til at udlede Fo-Fc udeladelseskortet kan tjene som et værktøj til at validere og demonstrere tilstedeværelsen af liganden. Endelig, ved hjælp af den velundersøgte β-galactosidase som eksempel, analyseres effekten af opløsning på modellering af ligander og opløsningsmiddelmolekyler i cryoEM-kort, og et syn på, hvordan cryoEM kan bruges til lægemiddelopdagelse, præsenteres.

Cells accomplish their functions by carrying out innumerable chemical reactions simultaneously and independently, each meticulously regulated to ensure their survival and adaptability in response to environmental cues. This is achieved by molecular recognition, which enables biomolecules, especially proteins, to form transient or stable complexes with other macromolecules as well as small molecules or ligands1. Thus, protein-ligand interactions are fundamental to all processes in biology, which include the regulation of protein expression and activity, the recognition of substrates and cofactors by enzymes, as well as how cells perceive and relay signals1,2. A better understanding of the kinetic, thermodynamic, and structural properties of the protein-ligand complex reveals the molecular basis of ligand interaction and also facilitates rational drug design by optimizing drug interaction and specificity. An economical and faster approach to studying protein-ligand interaction is to use molecular docking, which is a computational method that virtually screens a diverse range of small molecules and predicts the binding mode and affinity of these ligands to target proteins3. However, experimental evidence from high-resolution structures determined by X-ray Diffraction (XRD), Nuclear Magnetic Resonance (NMR), or electron cryomicroscopy (cryoEM) provides the essential proof for such predictions and aids in the development of newer and more effective activators or inhibitors for a given target. This article uses the abbreviation &#39;cryoEM&#39; as the technique is commonly referred to. However, there is an ongoing debate on choosing the correct nomenclature, and recently, the term cryogenic-sample Electron Microscopy (cryoEM) has been proposed to indicate that the sample is at cryogenic temperature and imaged with electrons4. Similarly, the maps derived from cryoEM have been called electron potential, electrostatic potential, or Coulomb potential, and for simplicity, here we use cryoEM maps5,6,7,8,9,10.
Although XRD has been the gold standard technique in high-resolution structure determination of protein-ligand complexes, post resolution-revolution11 cryoEM has gained momentum, as indicated&#160;by the surge of Coulomb potential maps or cryoEM maps deposited in the Electron Microscopy Database (EMDB)12,13 over the last few years14. Owing to advancements in sample preparation, imaging, and data processing methods, the number of Protein Data Bank (PDB)14 depositions employing cryoEM increased from 0.7% to 17% between 2010 and 2020, with approximately 50% of reported structures in 2020 being determined at 3.5&#8197;&#197; resolution or better15,16. CryoEM has been rapidly adopted by the structural biology community, including the pharmaceutical industry, as it allows the study of flexible and non-crystalline biological macromolecules, especially membrane proteins and multi-protein complexes, at near-atomic resolution, overcoming the process of crystallization and obtaining well-diffracting crystals required for high-resolution structure determination by XRD.
Accurate modeling of the ligand in the cryoEM map is paramount, as it serves as a blueprint of the protein-ligand complex at a molecular level. There are several automated ligand-building tools used in X-ray crystallography&#160;that depend on the shape and topology of the ligand density in order to fit or build the ligand into the electron density17,18,19,20. Nevertheless, if the resolution is lower than 3 &#197;, these approaches tend to produce less desirable outcomes because the topological features on which they depend for recognition and building become less defined. In many instances, these methods have proven ineffective in accurately modeling ligands into cryoEM maps, as these maps have been determined in the low-to-medium resolution range, typically between 3.5 &#197;-5 &#197;17.
The first step in 3D structure determination of a protein-ligand complex by cryoEM involves either co-purifying the ligand with the protein (when the ligand has a high binding affinity to the protein) or incubating the protein solution with the ligand for a specific duration before grid preparation. Subsequently, a small sample volume is placed onto a plasma-cleaned holey TEM grid, followed by flash freezing in liquid ethane and ultimately imaging with a cryo-TEM. The 2D projection images from hundreds of thousands to millions of individual particles are averaged to reconstruct a 3-dimensional (3D) Coulomb potential map of the macromolecule. Identifying and modeling ligands and solvent molecules in these maps pose significant challenges in many cases due to the anisotropic resolution across the map (i.e., the resolution is not uniform across the macromolecule), flexibility in the region where the ligand is bound, and the noise in the data. Many of the modeling, refinement, and visualization tools that were developed for XRD are now being adapted for use in cryoEM for the same purposes18, 19, 20, 21. In this article, an overview of various methods and software currently used to identify ligands, build models, and refine the coordinates derived from cryoEM is presented. A step-by-step protocol has been provided to illustrate the processes involved in modeling ligands using specific protein-ligand complexes with varying resolution and complexity.
The first step in modeling ligands in cryoEM maps includes the identification of the ligand density (non-protein) in the map. If ligand binding does not induce any conformational change in the protein, then calculating a simple difference map between the protein-ligand complex and the apo-protein essentially highlights the regions of extra density, suggesting the presence of the ligand. Such differences can be observed immediately, as it just requires two maps, and even intermediate maps during the process of 3D refinement can be used to check if the ligand is present. Additionally, if the resolution is high enough (&#60;3.0 &#197;), then the difference map can also provide insights into the location of water molecules as well as ions interacting with the ligand and the protein residues.
In the absence of the apo-protein map, it is now possible to use Servalcat22, which is available as a standalone tool and has also been integrated into the CCP-EM software suite23,24 as part of the Refmac refinement and in CCP4 8.0 release25,26. Servalcat allows the calculation of an FSC weighted difference (Fo-Fc) map using the unsharpened half-maps and the apoprotein model as input. The Fo-Fc omit map represents the disparity between the experimental map (Fo) and the map derived from the model (Fc). In the absence of a ligand in the model, a positive density in a Fo-Fc map that overlaps with the experimental EM map typically suggests the presence of the ligand. The assumption here is that the protein chain is well-fitted in the map, and the remaining positive density indicates the location of the ligand. However, it is important to meticulously examine whether the positive density stems from modeling inaccuracies, such as the wrong rotamer of a protein side-chain.
The second step involves obtaining or creating a cartesian coordinate file of the ligand with well-defined geometry from the available chemical information. Standard ligands (for example, ATP and NADP+) that are already available in the CCP4 monomer library can be used for refinement by retrieving the coordinate and geometry files via their monomer accession code. However, for unknown or non-standard ligands, various tools are available to create the geometry files. Some of the examples include the eLBOW27 - (electronic ligand builder and optimization workbench) in Phenix28, Lidia - an in-built tool in Coot29, JLigand/ACEDRG30,31, CCP-EM23,24, Ligprep32-a module of Glide within the Schrodinger suite. The ligand coordinate file is then fitted in the density, guided by both the experimental cryoEM map and the difference map in Coot. This is followed by real-space refinement in Phenix28 or reciprocal refinement in Refmac33. A Linux workstation or a laptop equipped with a good graphics card and the above-mentioned software is required. Most of these programs are included in various suites. CCP-EM24&#160;and Phenix28 are freely available to academic users and include a variety of tools that are used in this article, including Coot, Refmac533,34,35,36, Servalcat, phenix.real_space_refine, etc. Similarly,&#160;Chimera37, and ChimeraX38 provide free licenses to academic users.

Forfatter Spotlight: Udforskning af cellulære processer ved modellering af ligander i Cryo-EM-kort

Modellering af ligander til kort afledt af elektronkryomikroskopi

We are interested in understanding the physiological processes that occur across the cell, particularly at the membrane interface. We use Cryo-EM as a main technique and work on various interesting and challenging biological problems studying multiple macromolecular complexes. Determining the structures of membrane proteins and other labile complexes was challenging couple of decades ago.However, technical advances in Cryo-EM, a novel detergent and lipid mimetic and with endowments paved the way for rapid structure determination of these complexes. These structures can now be obtained at high resolution and potentially used in drug discovery. In single particle Cryo-EM, challenges include acquiring stable and homogeneous sample, embedding the sample in random orientation in thin ice, processing a large number of images with low signal to noise ratio, and accurately determining the angular orientation and classification during 3D reconstruction.Identifying and modeling small molecules in cryo-EM maps of ligand protein complexes is challenging due to inherent noise in the data and isotropic and low map resolution, sample heterogeneity, and ligand flexibility. This protocol is a step-by-step guide for identifying and modeling ligands and solvent molecules in low to medium resolution Cryo-EM.

Eksempel 1 Enzymet enolase fra M. tuberculosis katalyserer det næstsidste trin i glykolyse og omdanner 2-phosphoglycerat til phosphoenolpyruvat (PEP), som er et essentielt mellemprodukt for flere metaboliske veje44,45. CryoEM-data for apo-enolase- og PEP-bundne enolase-prøver blev indsamlet ved samme pixelstørrelse på 1,07 Å, og billedbehandling blev udført med Relion 3,146,47...

Denne protokol introducerer de tilgængelige værktøjer til modellering af småmolekyleligander i cryoEM-kort over makromolekyler.

Deciphering the protein-ligand interactions in a macromolecular complex is crucial for understanding the molecular mechanism, underlying biological ...

Vi er interesserede i at forstå de fysiologiske processer, der forekommer på tværs af cellen, især ved membrangrænsefladen. Vi bruger Cryo-EM som hovedteknik og arbejder med forskellige interessante og udfordrende biologiske problemer, der studerer flere makromolekylære komplekser. At bestemme strukturerne af membranproteiner og andre labile komplekser var udfordrende for et par årtier siden.Tekniske fremskridt inden for Cryo-EM, et nyt vaskemiddel og lipidmimetisk middel og med begavelser, banede imidlertid vejen for hurtig strukturbestemmelse af disse komplekser. Disse strukturer kan nu opnås i høj opløsning og potentielt bruges til lægemiddelopdagelse. I enkeltpartikel-Cryo-EM omfatter udfordringerne at erhverve en stabil og homogen prøve, indlejre prøven i tilfældig orientering i tynd is, behandle et stort antal billeder med lavt signal/støj-forhold og nøjagtigt bestemme vinkelorienteringen og klassificeringen under 3D-rekonstruktion.Identifikation og modellering af små molekyler i cryo-EM-kort af ligandproteinkomplekser er udfordrende på grund af iboende støj i dataene og isotrop og lav kortopløsning, prøveheterogenitet og ligandfleksibilitet. Denne protokol er en trin-for-trin guide til identifikation og modellering af ligander og opløsningsmiddelmolekyler i Cryo-EM med lav til medium opløsning.

modeling-ligands-into-maps-derived-from-electron-cryomicroscopy

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Modeling Ligands into Maps Derived from Electron Cryomicroscopy

732 Views.  Tata Institute of Fundamental Research. We are interested in understanding the physiological processes that occur across the cell, particularly at the membrane interface. We use Cryo-EM as a main technique and work on various interesting and challenging biological problems studying multiple macromolecular complexes. Determining the structures of membrane proteins and other labile complexes was challenging couple of decades ago.However, technical advances in Cryo-EM, a novel detergent and lipid mimetic and with endowments pav...