Name: Author Spotlight: Exploring Cellular Processes by Modeling Ligands in Cryo-EM Maps
Uploaded: 2024-07-19T13:00:00
Description: Deciphering the protein-ligand interactions in a macromolecular complex is crucial for understanding the molecular mechanism, underlying biological ...

SJ, DAE-TIFR'den doktora öğrencisi unvanı almıştır ve finansman kabul edilmektedir. KRV, DBT B-Life hibesi DBT/PR12422/MED/31/287/2014 ve Hindistan Hükümeti Atom Enerjisi Departmanı'nın Proje Kimlik No'lu kapsamında desteğini kabul eder. RTI4006.

1. Mycobacterium tuberculosis'ten enolazda fosfoenolpiruvat (PEP) modellenmesi
<ol><li>PEP-enolaz kompleksinin kriyoEM haritasında ligand yoğunluğunun tanımlanması<ol><li>EMDB'deki ek verilerden apo-enolazın keskinleştirilmemiş yarı haritalarını (emd_30988_additional_1.map ve emd_30988_additional_2.map) indirin (bkz. Malzeme Tablosu).</li>
		<li>ChimeraX'ı açın ( Malzeme Tablosu'na bakın). Araç çubuğundan Aç'a tıklayarak ve...

Modeling Small Molecule Ligands in CryoEM Maps of Macromolecules

Mikroskop donanım ve yazılımındaki gelişmeler, son yıllarda cryoEM yapılarının sayısında artışa neden olmuştur. Tek parçacıklı cryoEM'de şu anda elde edilen en yüksek çözünürlük 1.2 Å57,58,59 olmasına rağmen, yapıların çoğu 3-4 şçözünürlük civarında belirlenmektedir. Orta ila düşük çözünürlüklü haritalarda ligandları modellemek zor olabilir ve genellikle belirsizliklerle dolu olabi...

Hücreler, sayısız kimyasal reaksiyonu aynı anda ve bağımsız olarak gerçekleştirerek işlevlerini yerine getirirler, her biri çevresel ipuçlarına yanıt olarak hayatta kalmalarını ve uyum sağlamalarını sağlamak için titizlikle düzenlenir. Bu, biyomoleküllerin, özellikle proteinlerin, diğer makromoleküllerin yanı sıra küçük moleküller veya ligandlar ile geçici veya kararlı kompleksler oluşturmasını sağlayan moleküler tanıma ile elde edilir1. Bu nedenle, protein-ligand etkileşimleri, protein ekspresyonunun ve aktivitesinin düzenlenmesini, substratların ve kofaktörlerin enzimler tarafından tanınmasını ve ayrıca hücrelerin sinyalleri nasıl algıladığını ve ilettiğiniiçeren biyolojideki tüm süreçler için temeldir 1,2. Protein-ligand kompleksinin kinetik, termodinamik ve yapısal özelliklerinin daha iyi anlaşılması, ligand etkileşiminin moleküler temelini ortaya çıkarır ve ayrıca ilaç etkileşimini ve özgüllüğünü optimize ederek rasyonel ilaç tasarımını kolaylaştırır. Protein-ligand etkileşimini incelemek için ekonomik ve daha hızlı bir yaklaşım, çok çeşitli küçük molekülleri sanal olarak tarayan ve bu ligandların hedef proteinlere bağlanma modunu ve afinitesini tahmin eden bir hesaplama yöntemi olan moleküler yerleştirmeyi kullanmaktır3. Bununla birlikte, X-ışını Kırınımı (XRD), Nükleer Manyetik Rezonans (NMR) veya elektron kriyomikroskopisi (cryoEM) ile belirlenen yüksek çözünürlüklü yapılardan elde edilen deneysel kanıtlar, bu tür tahminler için temel kanıtı sağlar ve belirli bir hedef için daha yeni ve daha etkili aktivatörlerin veya inhibitörlerin geliştirilmesine yardımcı olur. Bu makale, tekniğe yaygın olarak atıfta bulunulduğu için 'cryoEM' kısaltmasını kullanır. Bununla birlikte, doğru isimlendirmenin seçilmesi konusunda devam eden bir tartışma vardır ve son zamanlarda, numunenin kriyojenik sıcaklıkta olduğunu ve elektronlarlagörüntülendiğini belirtmek için kriyojeniknumune Elektron Mikroskopisi (cryoEM) terimi önerilmiştir. Benzer şekilde, cryoEM'den türetilen haritalar elektron potansiyeli, elektrostatik potansiyel veya Coulomb potansiyeli olarak adlandırılmıştır ve basitlik için burada cryoEM haritaları 5,6,7,8,9,10 kullanıyoruz.
XRD, protein-ligand komplekslerinin yüksek çözünürlüklü yapı tayininde altın standart teknik olmasına rağmen, son birkaç yılda Elektron Mikroskobu Veritabanında (EMDB)12,13 biriken Coulomb potansiyel haritalarının veya kriyoEM haritalarının dalgalanmasıyla gösterildiği gibi, çözünürlük devrimisonrası 11 kriyoEM ivme kazanmıştır14. Numune hazırlama, görüntüleme ve veri işleme yöntemlerindeki ilerlemeler sayesinde, kriyoEM kullanan Protein Veri Bankası (PDB)14 birikimlerinin sayısı 2010 ve 2020 yılları arasında %0,7'den %17'ye yükselmiştir ve 2020'de rapor edilen yapıların yaklaşık %50'si 3,5 şveya daha iyi çözünürlükte belirlenmiştir15,16. CryoEM, farmasötik endüstrisi de dahil olmak üzere yapısal biyoloji topluluğu tarafından hızla benimsenmiştir, çünkü esnek ve kristal olmayan biyolojik makromoleküllerin, özellikle membran proteinlerinin ve çoklu protein komplekslerinin, atoma yakın çözünürlükte çalışılmasına izin verir, kristalleşme sürecinin üstesinden gelir ve XRD ile yüksek çözünürlüklü yapı tayini için gerekli olan iyi kırınım kristalleri elde eder.
CryoEM haritasındaki ligandın doğru modellenmesi, moleküler düzeyde protein-ligand kompleksinin bir planı olarak hizmet ettiği için çok önemlidir. X-ışını kristalografisinde kullanılan, ligandı elektron yoğunluğu 17,18,19,20'ye sığdırmak veya inşa etmek için ligand yoğunluğunun şekline ve topolojisine bağlı olan birkaç otomatik ligand oluşturma aracı vardır. Bununla birlikte, çözünürlük 3 Å'den düşükse, bu yaklaşımlar daha az arzu edilen sonuçlar üretme eğilimindedir, çünkü tanıma ve oluşturma için bağlı oldukları topolojik özellikler daha az tanımlanmış hale gelir. Birçok durumda, bu haritalar düşük-orta çözünürlük aralığında, tipik olarak 3.5 Å-5 Å17 arasında belirlendiğinden, bu yöntemlerin ligandları cryoEM haritalarına doğru bir şekilde modellemede etkisiz olduğu kanıtlanmıştır.
CryoEM ile bir protein-ligand kompleksinin 3D yapı tayinindeki ilk adım, ligandın protein ile birlikte saflaştırılmasını (ligandın proteine yüksek bir bağlanma afinitesine sahip olduğunda) veya protein çözeltisinin ızgara hazırlığından önce belirli bir süre ligand ile inkübe edilmesini içerir. Daha sonra, plazma ile temizlenmiş delikli bir TEM ızgarasına küçük bir numune hacmi yerleştirilir, ardından sıvı etan içinde hızlı dondurma ve son olarak bir kriyo-TEM ile görüntüleme yapılır. Yüz binlerce ila milyonlarca bireysel parçacıktan gelen 2D projeksiyon görüntülerinin ortalaması, makromolekülün 3 boyutlu (3D) Coulomb potansiyel haritasını yeniden oluşturmak için alınır. Bu haritalardaki ligandların ve çözücü moleküllerinin tanımlanması ve modellenmesi, harita boyunca anizotropik çözünürlük (yani, çözünürlük makromolekül boyunca aynı değildir), ligandın bağlı olduğu bölgedeki esneklik ve verilerdeki gürültü nedeniyle birçok durumda önemli zorluklar ortaya çıkarmaktadır. XRD için geliştirilen modelleme, iyileştirme ve görselleştirme araçlarının çoğu şimdi aynı amaçlar için cryoEM'de kullanılmak üzere uyarlanmaktadır 18,19,20,21. Bu makalede, ligandları tanımlamak, modeller oluşturmak ve cryoEM'den türetilen koordinatları iyileştirmek için şu anda kullanılan çeşitli yöntemlere ve yazılımlara genel bir bakış sunulmaktadır. Değişen çözünürlük ve karmaşıklığa sahip spesifik protein-ligand kompleksleri kullanılarak ligandların modellenmesinde yer alan süreçleri göstermek için adım adım bir protokol sağlanmıştır.
CryoEM haritalarında ligandların modellenmesindeki ilk adım, haritadaki ligand yoğunluğunun (protein olmayan) tanımlanmasını içerir. Ligand bağlanması proteinde herhangi bir konformasyonel değişikliğe neden olmazsa, protein-ligand kompleksi ile apo-protein arasındaki basit bir fark haritasının hesaplanması, ligandın varlığını düşündüren ekstra yoğunluk bölgelerini esasen vurgular. Bu tür farklılıklar hemen gözlemlenebilir, çünkü sadece iki harita gerektirir ve hatta ligandın mevcut olup olmadığını kontrol etmek için 3D iyileştirme işlemi sırasında ara haritalar bile kullanılabilir. Ek olarak, çözünürlük yeterince yüksekse (<3.0 Å), fark haritası, su moleküllerinin yanı sıra ligand ve protein kalıntıları ile etkileşime giren iyonların konumu hakkında da bilgi sağlayabilir.
Apo-protein haritasının yokluğunda, bağımsız bir araç olarak mevcut olan ve ayrıca Refmac iyileştirmesinin bir parçası olarak CCP-EM yazılım paketi 23,24'e ve CCP4 8.0 sürüm 25,26'ya entegre edilmiş olan Servalcat22'yi kullanmak artık mümkün. Servalcat, keskinleştirilmemiş yarım haritaları ve apoprotein modelini girdi olarak kullanarak bir FSC ağırlıklı fark (Fo-Fc) haritasının hesaplanmasına izin verir. Fo-Fc atlama haritası, deneysel harita (Fo) ile modelden türetilen harita (Fc) arasındaki eşitsizliği temsil eder. Modelde bir ligandın yokluğunda, deneysel EM haritasıyla örtüşen bir Fo-Fc haritasındaki pozitif bir yoğunluk tipik olarak ligandın varlığını gösterir. Buradaki varsayım, protein zincirinin haritaya iyi bir şekilde oturduğu ve kalan pozitif yoğunluğun ligandın yerini gösterdiğidir. Bununla birlikte, pozitif yoğunluğun, bir protein yan zincirinin yanlış döndürücüsü gibi modelleme hatalarından kaynaklanıp kaynaklanmadığını titizlikle incelemek önemlidir.
İkinci adım, mevcut kimyasal bilgilerden iyi tanımlanmış geometriye sahip ligandın kartezyen koordinat dosyasının elde edilmesini veya oluşturulmasını içerir. CCP4 monomer kütüphanesinde zaten mevcut olan standart ligandlar (örneğin, ATP ve NADP+), koordinat ve geometri dosyalarını monomer erişim kodları aracılığıyla alarak iyileştirme için kullanılabilir. Bununla birlikte, bilinmeyen veya standart olmayan ligandlar için, geometri dosyalarını oluşturmak için çeşitli araçlar mevcuttur. Örneklerden bazıları arasında Phenix28'deki eLBOW27 - (elektronik ligand oluşturucu ve optimizasyon tezgahı), Lidia - Coot29, JLigand/ACEDRG30,31, CCP-EM23,24, Schrödinger paketi içindeki Glide'ın Ligprep32-a modülünde yerleşik bir araç bulunmaktadır. Ligand koordinat dosyası daha sonra hem deneysel cryoEM haritası hem de Coot'taki fark haritası tarafından yönlendirilen yoğunluğa yerleştirilir. Bunu, Phoenix28'de gerçek alan iyileştirmesi veya Refmac33'te karşılıklı iyileştirme takip eder. İyi bir grafik kartı ve yukarıda belirtilen yazılımla donatılmış bir Linux iş istasyonu veya dizüstü bilgisayar gereklidir. Bu programların çoğu çeşitli süitlere dahil edilmiştir. CCP-EM24 ve Phenix28, akademik kullanıcılar tarafından ücretsiz olarak kullanılabilir ve Coot, Refmac5 33,34,35,36, Servalcat, phenix.real_space_refine, vb. dahil olmak üzere bu makalede kullanılan çeşitli araçları içerir. Benzer şekilde, Chimera37 ve ChimeraX38 akademik kullanıcılara ücretsiz lisanslar sağlar.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>CCP4-8.0</td>
			<td>Consortium of several institutes</td>
			<td>https://www.ccp4.ac.uk</td>
			<td>Free for academic users and includes Coot and list of tools developed for X-ray crystallography</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCP-EM</td>
			<td>Consortium of several institutes</td>
			<td>https://www.ccpem.ac.uk/download.php</td>
			<td>Free for academic users and includes Coot, Relion and many others</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coot&#160;</td>
			<td>Paul Emsley, LMB, Cambridge</td>
			<td>https://www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/personal/pemsley/coot/</td>
			<td>General software for model building but also available with other suites described above</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DockinMap (Phenix)</td>
			<td>Consortium of several institutes</td>
			<td>https://phenix-online.org/documentation/reference/dock_in_map.html</td>
			<td>Software inside the Phenix suite for docking model into cryoEM maps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electron Microscopy Data Bank&#160;</td>
			<td>Consortium of several institutes</td>
			<td>https://www.ebi.ac.uk/emdb/</td>
			<td>Public Repository for Electron Microscopy maps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/MSD/Technical-Notes/Falcon-3EC-Datasheet.pdf</td>
			<td>Commercial, camera from Thermo Fisher&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenix&#160;</td>
			<td>Consortium of several institutes</td>
			<td>https://phenix-online.org/download</td>
			<td>Free for academic users and includes Coot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein Data Bank</td>
			<td>Consortium of several institutes</td>
			<td>https://rcsb.org</td>
			<td>Public database of macromolecular structures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pymol</td>
			<td>Schrodinger</td>
			<td>https://pymol.org/2/</td>
			<td>Molecular viusalization tool. Educational version is free but comes with limitation. The full version can be obtained with a small fee.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Relion</td>
			<td>MRC-LMB, Cambridge</td>
			<td>https://relion.readthedocs.io/en/release-4.0/Installation.html</td>
			<td>Software for cryoEM image processing, also available with CCP-EM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Titan Krios</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>https://www.thermofisher.com/in/en/home/electron-microscopy/products/transmission-electron-microscopes/krios-g4-cryo-tem.html?cid=msd_ls_xbu_xmkt_tem-krios_285811_gl_pso_gaw_tpne1c&#38; 
			gad_source=1&#38;gclid=CjwKCAiA-P-rBhBEEiwAQEXhHyw5c8MKThmdA 
			AkZesWC4FYQSwIQRk 
			ZApkj08MfYG040DtiiuL8 
			RihoCebEQAvD_BwE</td>
			<td>Commercial, cryoTEM from Thermo Fisher</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UCSF Chimera</td>
			<td>UCSF, USA</td>
			<td>https://www.cgl.ucsf.edu/chimera/download.html</td>
			<td>General purpose software for display, analysis and more</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UCSF Chimera X</td>
			<td>UCSF, USA</td>
			<td>https://www.cgl.ucsf.edu/chimerax/</td>
			<td>General purpose software for display, analysis and more</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

modeling ligands into maps derived from electron cryomicroscopy

Bir makromoleküler kompleksteki protein-ligand etkileşimlerinin deşifre edilmesi, moleküler mekanizmayı, altta yatan biyolojik süreçleri ve ilaç geliştirmeyi anlamak için çok önemlidir. Son yıllarda, kriyojenik örnek elektron mikroskobu (cryoEM), makromoleküllerin yapılarını belirlemek ve atoma yakın çözünürlükte ligand bağlanma modunu araştırmak için güçlü bir teknik olarak ortaya çıkmıştır. CryoEM haritalarında protein olmayan moleküllerin tanımlanması ve modellenmesi, ilgilenilen molekül boyunca anizotropik çözünürlük ve verilerdeki doğal gürültü nedeniyle genellikle zordur. Bu makalede, okuyuculara, seçilen makromolekülleri kullanarak ligand tanımlaması, model oluşturma ve atomik koordinatların iyileştirilmesi için şu anda kullanılan çeşitli yazılım ve yöntemler tanıtılmaktadır. Enolaz enzimi ile gösterildiği gibi bir ligandın varlığını tanımlamanın en basit yollarından biri, ligandlı ve ligandsız elde edilen iki haritayı çıkarmaktır. Ligandın ekstra yoğunluğunun, daha yüksek bir eşikte bile fark haritasında öne çıkması muhtemeldir. Metabotropik Glutamat reseptörü mGlu5 durumunda gösterildiği gibi, bu kadar basit fark haritalarının oluşturulamadığı durumlar vardır. Yakın zamanda tanıtılan Fo-Fc atlama haritasını türetme yöntemi, ligandın varlığını doğrulamak ve göstermek için bir araç olarak hizmet edebilir. Son olarak, iyi çalışılmış β-galaktosidaz örnek olarak, çözünürlüğün cryoEM haritalarında ligandların ve çözücü moleküllerinin modellenmesi üzerindeki etkisi analiz edilmekte ve cryoEM'nin ilaç keşfinde nasıl kullanılabileceğine dair bir bakış sunulmaktadır.

Cells accomplish their functions by carrying out innumerable chemical reactions simultaneously and independently, each meticulously regulated to ensure their survival and adaptability in response to environmental cues. This is achieved by molecular recognition, which enables biomolecules, especially proteins, to form transient or stable complexes with other macromolecules as well as small molecules or ligands1. Thus, protein-ligand interactions are fundamental to all processes in biology, which include the regulation of protein expression and activity, the recognition of substrates and cofactors by enzymes, as well as how cells perceive and relay signals1,2. A better understanding of the kinetic, thermodynamic, and structural properties of the protein-ligand complex reveals the molecular basis of ligand interaction and also facilitates rational drug design by optimizing drug interaction and specificity. An economical and faster approach to studying protein-ligand interaction is to use molecular docking, which is a computational method that virtually screens a diverse range of small molecules and predicts the binding mode and affinity of these ligands to target proteins3. However, experimental evidence from high-resolution structures determined by X-ray Diffraction (XRD), Nuclear Magnetic Resonance (NMR), or electron cryomicroscopy (cryoEM) provides the essential proof for such predictions and aids in the development of newer and more effective activators or inhibitors for a given target. This article uses the abbreviation &#39;cryoEM&#39; as the technique is commonly referred to. However, there is an ongoing debate on choosing the correct nomenclature, and recently, the term cryogenic-sample Electron Microscopy (cryoEM) has been proposed to indicate that the sample is at cryogenic temperature and imaged with electrons4. Similarly, the maps derived from cryoEM have been called electron potential, electrostatic potential, or Coulomb potential, and for simplicity, here we use cryoEM maps5,6,7,8,9,10.
Although XRD has been the gold standard technique in high-resolution structure determination of protein-ligand complexes, post resolution-revolution11 cryoEM has gained momentum, as indicated&#160;by the surge of Coulomb potential maps or cryoEM maps deposited in the Electron Microscopy Database (EMDB)12,13 over the last few years14. Owing to advancements in sample preparation, imaging, and data processing methods, the number of Protein Data Bank (PDB)14 depositions employing cryoEM increased from 0.7% to 17% between 2010 and 2020, with approximately 50% of reported structures in 2020 being determined at 3.5&#8197;&#197; resolution or better15,16. CryoEM has been rapidly adopted by the structural biology community, including the pharmaceutical industry, as it allows the study of flexible and non-crystalline biological macromolecules, especially membrane proteins and multi-protein complexes, at near-atomic resolution, overcoming the process of crystallization and obtaining well-diffracting crystals required for high-resolution structure determination by XRD.
Accurate modeling of the ligand in the cryoEM map is paramount, as it serves as a blueprint of the protein-ligand complex at a molecular level. There are several automated ligand-building tools used in X-ray crystallography&#160;that depend on the shape and topology of the ligand density in order to fit or build the ligand into the electron density17,18,19,20. Nevertheless, if the resolution is lower than 3 &#197;, these approaches tend to produce less desirable outcomes because the topological features on which they depend for recognition and building become less defined. In many instances, these methods have proven ineffective in accurately modeling ligands into cryoEM maps, as these maps have been determined in the low-to-medium resolution range, typically between 3.5 &#197;-5 &#197;17.
The first step in 3D structure determination of a protein-ligand complex by cryoEM involves either co-purifying the ligand with the protein (when the ligand has a high binding affinity to the protein) or incubating the protein solution with the ligand for a specific duration before grid preparation. Subsequently, a small sample volume is placed onto a plasma-cleaned holey TEM grid, followed by flash freezing in liquid ethane and ultimately imaging with a cryo-TEM. The 2D projection images from hundreds of thousands to millions of individual particles are averaged to reconstruct a 3-dimensional (3D) Coulomb potential map of the macromolecule. Identifying and modeling ligands and solvent molecules in these maps pose significant challenges in many cases due to the anisotropic resolution across the map (i.e., the resolution is not uniform across the macromolecule), flexibility in the region where the ligand is bound, and the noise in the data. Many of the modeling, refinement, and visualization tools that were developed for XRD are now being adapted for use in cryoEM for the same purposes18, 19, 20, 21. In this article, an overview of various methods and software currently used to identify ligands, build models, and refine the coordinates derived from cryoEM is presented. A step-by-step protocol has been provided to illustrate the processes involved in modeling ligands using specific protein-ligand complexes with varying resolution and complexity.
The first step in modeling ligands in cryoEM maps includes the identification of the ligand density (non-protein) in the map. If ligand binding does not induce any conformational change in the protein, then calculating a simple difference map between the protein-ligand complex and the apo-protein essentially highlights the regions of extra density, suggesting the presence of the ligand. Such differences can be observed immediately, as it just requires two maps, and even intermediate maps during the process of 3D refinement can be used to check if the ligand is present. Additionally, if the resolution is high enough (&#60;3.0 &#197;), then the difference map can also provide insights into the location of water molecules as well as ions interacting with the ligand and the protein residues.
In the absence of the apo-protein map, it is now possible to use Servalcat22, which is available as a standalone tool and has also been integrated into the CCP-EM software suite23,24 as part of the Refmac refinement and in CCP4 8.0 release25,26. Servalcat allows the calculation of an FSC weighted difference (Fo-Fc) map using the unsharpened half-maps and the apoprotein model as input. The Fo-Fc omit map represents the disparity between the experimental map (Fo) and the map derived from the model (Fc). In the absence of a ligand in the model, a positive density in a Fo-Fc map that overlaps with the experimental EM map typically suggests the presence of the ligand. The assumption here is that the protein chain is well-fitted in the map, and the remaining positive density indicates the location of the ligand. However, it is important to meticulously examine whether the positive density stems from modeling inaccuracies, such as the wrong rotamer of a protein side-chain.
The second step involves obtaining or creating a cartesian coordinate file of the ligand with well-defined geometry from the available chemical information. Standard ligands (for example, ATP and NADP+) that are already available in the CCP4 monomer library can be used for refinement by retrieving the coordinate and geometry files via their monomer accession code. However, for unknown or non-standard ligands, various tools are available to create the geometry files. Some of the examples include the eLBOW27 - (electronic ligand builder and optimization workbench) in Phenix28, Lidia - an in-built tool in Coot29, JLigand/ACEDRG30,31, CCP-EM23,24, Ligprep32-a module of Glide within the Schrodinger suite. The ligand coordinate file is then fitted in the density, guided by both the experimental cryoEM map and the difference map in Coot. This is followed by real-space refinement in Phenix28 or reciprocal refinement in Refmac33. A Linux workstation or a laptop equipped with a good graphics card and the above-mentioned software is required. Most of these programs are included in various suites. CCP-EM24&#160;and Phenix28 are freely available to academic users and include a variety of tools that are used in this article, including Coot, Refmac533,34,35,36, Servalcat, phenix.real_space_refine, etc. Similarly,&#160;Chimera37, and ChimeraX38 provide free licenses to academic users.

Author Spotlight: Exploring Cellular Processes by Modeling Ligands in Cryo-EM Maps

Ligandların Elektron Kriyomikroskopisinden Türetilen Haritalara Modellenmesi

Örnek 1 M. tuberculosis'ten elde edilen enolaz enzimi, glikolizin sondan bir önceki adımını katalize eder ve 2-fosfogliseriatı, çeşitli metabolik yollar için temel bir ara madde olan fosfoenolpiruvata (PEP) dönüştürür44,45. Apo-enolaz ve PEP'e bağlı enolaz örnekleri için CryoEM verileri aynı piksel boyutu olan 1.07 Å'de toplandı ve Relion 3.146,47 ile gör...

Bu protokol, makromoleküllerin kriyoEM haritalarında küçük moleküllü ligandları modellemek için mevcut araçları tanıtır.

Deciphering the protein-ligand interactions in a macromolecular complex is crucial for understanding the molecular mechanism, underlying biological ...

Hücre boyunca, özellikle zar arayüzünde meydana gelen fizyolojik süreçleri anlamakla ilgileniyoruz. Cryo-EM'yi ana teknik olarak kullanıyoruz ve çoklu makromoleküler kompleksleri inceleyerek çeşitli ilginç ve zorlu biyolojik problemler üzerinde çalışıyoruz. Zar proteinlerinin ve diğer kararsız komplekslerin yapılarını belirlemek birkaç on yıl önce zordu.Bununla birlikte, yeni bir deterjan ve lipid taklitçisi olan Cryo-EM'deki teknik gelişmeler ve sahip olunan donanımlar, bu komplekslerin hızlı yapı tayininin yolunu açmıştır. Bu yapılar artık yüksek çözünürlükte elde edilebilir ve potansiyel olarak ilaç keşfinde kullanılabilir. Tek parçacıklı Cryo-EM'deki zorluklar arasında kararlı ve homojen numune elde edilmesi, numunenin ince buza rastgele yönde gömülmesi, düşük sinyal-gürültü oranına sahip çok sayıda görüntünün işlenmesi ve 3D rekonstrüksiyon sırasında açısal yönelim ve sınıflandırmanın doğru bir şekilde belirlenmesi yer alır.Ligand protein komplekslerinin kriyo-EM haritalarındaki küçük moleküllerin tanımlanması ve modellenmesi, verilerdeki doğal gürültü ve izotropik ve düşük harita çözünürlüğü, numune heterojenliği ve ligand esnekliği nedeniyle zordur. Bu protokol, düşük ila orta çözünürlüklü Cryo-EM'de ligandları ve çözücü moleküllerini tanımlamak ve modellemek için adım adım bir kılavuzdur.