Die Autoren der vorliegenden Arbeit danken den Autoren der ursprünglichen Arbeit, die die AQRNA-seq-Technologie7 beschreibt. Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse der National Institutes of Health (ES002109, AG063341, ES031576, ES031529, ES026856) und der National Research Foundation of Singapore über die Singapore-MIT Alliance for Research and Technology Antimicrobial Resistance IRG unterstützt.

HINWEIS: Abbildung 1 zeigt eine grafische Darstellung der Verfahren, die bei der Vorbereitung der AQRNA-seq-Bibliothek erforderlich sind. Detaillierte Informationen zu den Reagenzien, Chemikalien und Säulen/Kits, die in dem Verfahren verwendet werden, finden Sie in der Materialtabelle. Es wird empfohlen, eine umfassende Bewertung der Reinheit, Integrität und Menge der Eingabe-RNA-Proben mit (i) 3%iger Agarose-Gelelektrophorese, (ii) automatisierten Elektrophoresewerkzeugen...

Analyse der tRNA-Dynamik mit AQRNA-seq

<ol>
	<li>Byron, S. A., Van Keuren-Jensen, K. R., Engelthaler, D. M., Carpten, J. D., Craig, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translating+RNA+sequencing+into+clinical+diagnostics:+opportunities+and+challenges.">Translating RNA sequencing into clinical diagnostics: opportunities and challenges.</a> Nat Rev Gen. 17 (5), 257-271 (2016).</li><li>Grillone, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-coding+RNAs+in+cancer:+platforms+and+strategies+for+investigating+the+genomic+&amp;#34;dark+matter.&amp;#34.">Non-coding RNAs in cancer: platforms and strategies for investigating the genomic &amp;#34;dark matter.&amp;#34.</a> J Exp Clin Cancer Res. 39 (1), 117 (2020).</li><li>Hwang, B., Lee, J. H., Bang, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+RNA+sequencing+technologies+and+bioinformatics+pipelines.">Single-cell RNA sequencing technologies and bioinformatics pipelines.</a> Exp Mol Med. 50 (8), 1-14 (2018).</li><li>Goh, J. J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+specific+multiplexed+RNA+imaging+in+tissues+with+split-FISH.">Highly specific multiplexed RNA imaging in tissues with split-FISH.</a> Nat Methods. 17 (7), 689-693 (2020).</li><li>Moses, L., Pachter, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Museum+of+spatial+transcriptomics.">Museum of spatial transcriptomics.</a> Nat Methods. 19 (5), 534-546 (2022).</li><li>Cummings, B. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+genetic+diagnosis+in+Mendelian+disease+with+transcriptome+sequencing.">Improving genetic diagnosis in Mendelian disease with transcriptome sequencing.</a> Sci Transl Med. 9 (386), 5209 (2017).</li><li>Hu, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+mapping+of+the+cellular+small+RNA+landscape+with+AQRNA-seq.">Quantitative mapping of the cellular small RNA landscape with AQRNA-seq.</a> Nat Biotech. 39 (8), 978-988 (2021).</li><li>Alon, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Barcoding+bias+in+high-throughput+multiplex+sequencing+of+miRNA.">Barcoding bias in high-throughput multiplex sequencing of miRNA.</a> Genome Res. 21 (9), 1506-1511 (2011).</li><li>Fuchs, R. T., Sun, Z., Zhuang, F., Robb, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bias+in+ligation-based+small+RNA+sequencing+library+construction+is+determined+by+adaptor+and+RNA+structure.">Bias in ligation-based small RNA sequencing library construction is determined by adaptor and RNA structure.</a> PLoS One. 10 (5), e0126049 (2015).</li><li>Pang, Y. L. J., Abo, R., Levine, S. S., Dedon, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diverse+cell+stresses+induce+unique+patterns+of+tRNA+up-+and+down-regulation:+tRNA-seq+for+quantifying+changes+in+tRNA+copy+number.">Diverse cell stresses induce unique patterns of tRNA up- and down-regulation: tRNA-seq for quantifying changes in tRNA copy number.</a> Nuc Acids Res. 42 (22), e170 (2014).</li><li>Machnicka, M. A., Olchowik, A., Grosjean, H., Bujnicki, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distribution+and+frequencies+of+post-transcriptional+modifications+in+tRNAs.">Distribution and frequencies of post-transcriptional modifications in tRNAs.</a> RNA Biol. 11 (12), 1619-1629 (2014).</li><li>Li, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulatory+impact+of+RNA+secondary+structure+across+the+Arabidopsis+transcriptome.">Regulatory impact of RNA secondary structure across the Arabidopsis transcriptome.</a> Plant Cell. 24 (11), 4346-4359 (2012).</li><li>Garc&#237;a-Nieto, P. E., Wang, B., Fraser, H. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptome+diversity+is+a+systematic+source+of+variation+in+RNA-sequencing+data.">Transcriptome diversity is a systematic source of variation in RNA-sequencing data.</a> PLOS Comput Biol. 18 (3), e1009939 (2022).</li><li>. FASTQC: a quality control tool for high throughput sequence data Available from: <a target="_blank" href="https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/">https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/</a> (2010)</li><li>Chen, S., Zhou, Y., Chen, Y., Gu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fastp:+an+ultra-fast+all-in-one+FASTQ+preprocessor.">Fastp: an ultra-fast all-in-one FASTQ preprocessor.</a> Bioinformatics. 34 (17), i884-i890 (2018).</li><li>Love, M. I., Huber, W., Anders, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Moderated+estimation+of+fold+change+and+dispersion+for+RNA-seq+data+with+DESeq2.">Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2.</a> Genome Biol. 15 (12), 550 (2014).</li><li>R Core Team. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=R:+a+language+and+environment+for+statistical+computing.">R: a language and environment for statistical computing.</a> R Foundation for Statistical Computing. , (2022).</li><li>Ougland, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AlkB+restores+the+biological+function+of+mRNA+and+tRNA+inactivated+by+chemical+methylation.">AlkB restores the biological function of mRNA and tRNA inactivated by chemical methylation.</a> Mol Cell. 16 (1), 107-116 (2004).</li><li>Bernhardt, H. S., Tate, W. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primordial+soup+or+vinaigrette:+did+the+RNA+world+evolve+at+acidic+pH.">Primordial soup or vinaigrette: did the RNA world evolve at acidic pH.</a> Biol Direct. 7, 4 (2012).</li><li>Altschul, S. F., Gish, W., Miller, W., Myers, E. W., Lipman, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+local+alignment+search+tool.">Basic local alignment search tool.</a> J Mol Biol. 215 (3), 403-410 (1990).</li><li>Martin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cutadapt+removes+adapter+sequences+from+high-throughput+sequencing+reads.">Cutadapt removes adapter sequences from high-throughput sequencing reads.</a> EMBnet. J. 17 (1), 10-12 (2011).</li></ol>

P.C.D. ist Erfinder von zwei Patenten (PCT/US2019/013714, US 2019/0284624 A1), die sich auf das veröffentlichte Werk beziehen.

Der Arbeitsablauf zur Vorbereitung der AQRNA-seq-Bibliothek wurde entwickelt, um die Erfassung von RNAs in einer Probe zu maximieren und den Polymeraseabfall während der reversen Transkriptionzu minimieren 7. Durch eine zweistufige Linker-Ligation werden neuartige DNA-Oligos (Linker 1 und Linker 2) im Überschuss ligiert, um die RNA in der Probe vollständig zu ergänzen. Überschüssige Linker können effizient mit RecJf, einer 5'- bis 3'-Exonuklease, die für einzelsträngige DNAs spezifisch is...

Next-Generation-Sequencing (NGS), auch bekannt als massiv parallele Sequenzierung, ist eine DNA-Sequenzierungstechnologie, die DNA-Fragmentierung, Ligation von Adapter-Oligonukleotiden, Polymerase-Kettenreaktion (PCR)-basierte Amplifikation, Sequenzierung der DNA und Reassemblierung der Fragmentsequenzen zu einem Genom umfasst. Die Anpassung von NGS an Sequenz-RNA (RNA-seq) ist ein leistungsfähiger Ansatz zur Identifizierung und Quantifizierung von RNA-Transkripten und deren Varianten1. Innovative Entwicklungen bei Arbeitsabläufen zur Vorbereitung von RNA-Bibliotheken und bioinformatischen Analysepipelines, gepaart mit Fortschritten bei Laborinstrumenten, haben das Repertoire an RNA-Seq-Anwendungen erweitert und sind über die Exomsequenzierung hinaus zu fortschrittlichen funktionellen Omics-Anwendungen wie nicht-kodierendem RNA-Profiling2, Einzelzellanalyse3, räumlicher Transkriptomik 4,5 und alternativer Spleißanalyse6 vorangeschrittenunter anderem. Diese fortschrittlichen RNA-seq-Methoden decken komplexe RNA-Funktionen durch quantitative Analyse des Transkriptoms in normalen und erkrankten Zellen und Geweben auf.
Trotz dieser Fortschritte in der RNA-seq schränken mehrere wichtige technische Merkmale die quantitative Leistungsfähigkeit der Methode ein. Während die meisten RNA-seq-Methoden eine präzise und genaue Quantifizierung von Änderungen der RNA-Spiegel zwischen experimentellen Variablen (d. h. biologischen Proben und/oder physiologischen Zuständen) ermöglichen, können sie keine quantitativen Vergleiche der Konzentrationen von RNA-Molekülen in einer Probe liefern. Zum Beispiel können die meisten RNA-seq-Methoden die relative Anzahl der Kopien einzelner tRNA-Isoakzeptormoleküle in einem zellulären Pool exprimierter tRNAs nicht genau quantifizieren. Wie in der Begleitpublikation7 hervorgehoben, ergibt sich diese Einschränkung des RNA-seq aus mehreren Merkmalen der RNA-Struktur und der Biochemie der Bibliotheksvorbereitung. Zum Beispiel wird die Aktivität der Ligationsenzyme, die zum Anhängen der 3'- und 5'-End-Sequenzierungslinker an RNA-Moleküle verwendet werden, stark von der Identität der terminalen Nukleotide der RNA und der Sequenzierungslinker beeinflusst. Dies führt zu großen Schwankungen in der Effizienz von Linker-Ligationen und zu tiefgreifenden künstlichen Steigerungen der Sequenzierungs-Reads 8,9,10.
Eine zweite Reihe von Einschränkungen ergibt sich aus den inhärenten strukturellen Eigenschaften von RNA-Molekülen. Insbesondere die Bildung der RNA-Sekundärstruktur und dynamische Veränderungen in den Dutzenden von posttranskriptionellen RNA-Modifikationen des Epitranskriptoms können zu einem Polymeraseabfall oder einer Mutation während der reversen Transkription führen. Diese Fehler führen zu einer unvollständigen oder verkürzten cDNA-Synthese oder einer veränderten RNA-Sequenz. Während diese beiden Phänomene ausgenutzt werden können, um Sekundärstrukturen oder einige Modifikationen zu kartieren, verschlechtern sie die quantitative Genauigkeit von RNA-seq, wenn nachfolgende Bibliotheksvorbereitungsschritte keine verkürzten cDNAs erfassen oder wenn die Datenverarbeitung mutierte Sequenzen auswirft, die nicht mit einem Referenzdatensatz übereinstimmen11,12. Darüber hinaus verringert die immense chemische, längen- und strukturelle Vielfalt von RNA-Transkripten sowie der Mangel an Werkzeugen zur gleichmäßigen Fragmentierung langer RNAs die Anwendbarkeit der meisten RNA-seq-Methoden auf alle RNA-Spezies13.
Die AQRNA-seq-Methode (absolute Quantifizierung RNA-Sequenzierung) wurde entwickelt, um mehrere dieser technischen und biologischen Einschränkungen zu beseitigen, die die quantitative Genauigkeit einschränken7. Durch die Minimierung sequenzabhängiger Verzerrungen bei der Erfassung, Ligation und Amplifikation während der Vorbereitung der RNA-Sequenzierungsbibliotheken erreicht AQRNA-seq eine überlegene Linearität im Vergleich zu anderen Methoden und quantifiziert 75 % einer Referenzbibliothek von 963 miRNAs mit 2-facher Genauigkeit. Diese lineare Korrelation von Sequenzierung, Lesezahl und RNA-Abundanz wird auch bei der Analyse eines Pools variabler Länge von RNA-Oligonukleotidstandards und in Bezug auf orthogonale Methoden wie Northern Blot beobachtet. Die Etablierung der Linearität zwischen der Anzahl der Sequenzierungs-Reads und der RNA-Abundanz ermöglicht AQRNA-seq eine genaue, absolute Quantifizierung aller RNA-Spezies innerhalb einer Probe.
Im Folgenden finden Sie eine Beschreibung des Protokolls für den Workflow zur Vorbereitung von AQRNA-seq-Bibliotheken und der zugehörigen nachgelagerten Datenanalyse-Pipeline. Die Methode wurde angewendet, um die Dynamik der tRNA-Abundanz während der hungerinduzierten Ruhephase und der anschließenden Wiederbelebung im Mycobacterium bovis bacilli de Calmette et Guérin (BCG) Modell der Tuberkulose aufzuklären. Die Ergebnisse wurden für die explorative Visualisierung der Sequenzierungsdaten vorgestellt, zusammen mit anschließenden Clustering- und differentiellen Expressionsanalysen, die erkennbare Muster in der tRNA-Abundanz aufdeckten, die mit verschiedenen Phänotypen assoziiert sind.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-ketoglutarate&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>75890</td>
			<td>Prepare a working solution (1 M) and store it at -20&#186;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2100 Bioanalyzer Instrument</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G2938C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5&#39;-deadenylase (50 U/&#956;L)&#160;</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0331S&#160;(component #: M0331SVIAL)</td>
			<td>Store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenosine 5&#39;-Triphosphate (ATP)&#160;</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0437M (component #: N0437AVIAL)</td>
			<td>NEB M0437M contains T4 RNA Ligase 1 (30 U/&#956;L), T4 RNA Ligase Reaction Buffer (10X), PEG 8000 (1X), and ATP (100 mM); prepare a working solution (10 mM) and store it at -20&#186;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AGAROSE GPG/LE</td>
			<td>AmericanBio</td>
			<td>AB00972-00500</td>
			<td>Store at ambient temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium iron(II) sulfate hexahydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F2262</td>
			<td>Prepare a working solution (0.25 M) and store it at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioanalyzer Small RNA Analysis</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5067-1548&#160;</td>
			<td>The Small RNA Analysis is used for checking the quality of input RNAs and the efficiency of enzymatic reactions (e.g., Linker 1 ligation)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA; 10 mg/mL)&#160;</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B9000</td>
			<td>This product was discontinued on 12/15/2022 and is replaced with Recombinant Albumin, Molecular Biology Grade (NEB B9200).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform&#160;</td>
			<td>Macron Fine Chemicals</td>
			<td>4441-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Demethylase&#160;</td>
			<td>ArrayStar</td>
			<td>AS-FS-004</td>
			<td>Demethylase comes with the rtStar tRNA Pretreatment &#38; First-Strand cDNA Synthesis Kit (AS-FS-004)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deoxynucleotide (dNTP) Solution Mix</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>N0447L (component #: N0447LVIAL)</td>
			<td>This dNTP Solution Mix contains equimolar concentrations of dATP, dCTP, dGTP and dTTP (10 mM each)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital Dual Heat Block</td>
			<td>VWR Scientific Products</td>
			<td>13259-052</td>
			<td>Heating block is used with the QIAquick&#160;Gel Extraction Kit&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DyeEx&#160;2.0 Spin Kit&#160;</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>63204&#160;</td>
			<td>Effective at removing short remnants (e.g., oligos less than 10 bp in length)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrophoresis Power Supply</td>
			<td>Bio-Rad Labrotories</td>
			<td>PowerPac 300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf PCR Tubes (0.5 mL)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>0030124537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Safe-Lock Tubes (0.5 mL)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>022363611</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Safe-Lock Tubes (1.5 mL)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>022363204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Safe-Lock Tubes (2 mL)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>022363352</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl alcohol (Ethanol), Pure</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E7023&#160;</td>
			<td>The pure ethanol is used with the Oligo Clean and Concentrator Kit from Zymo Research</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel Imaging System</td>
			<td>Alpha Innotech</td>
			<td>FluorChem 8900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel Loading Dye, Purple (6X), no SDS</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>N0556S (component #: B7025SVIAL)</td>
			<td>NEB N0556S contains Quick-Load Purple 50 bp DNA Ladder and Gel Loading Dye, Purple (6X), no SDS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GENESYS 180 UV-Vis Spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>840-309000</td>
			<td>The spectrophotometer is used for measuring the oligo concentrations using the Beer&#39;s law</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H4034</td>
			<td>Prepare a working solution (1 M; pH = 8 with NaOH) and store it at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid (HCl)&#160;</td>
			<td>VWR Scientific Products</td>
			<td>BDH3028&#160;</td>
			<td>Prepare a working solution (5 M) and store it at ambient temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl Alcohol (Isopropanol), Pure</td>
			<td>Macron Fine Chemicals</td>
			<td>3032-16</td>
			<td>Isopropanol is used with the QIAquick&#160;Gel Extraction Kit&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Ascorbic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5960</td>
			<td>Prepare a working solution (0.5 M) and store it at -20&#186;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5415D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop 2000 Spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>ND-2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBuffer 2 (10X)</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0264L (component #: B7002SVIAL)</td>
			<td>NEB M0264L contains RecJf (30 U/&#956;L) and NEBuffer 2 (10X); store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-Free Water (not DEPC-Treated)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM9938&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligo Clean &#38; Concentrator Kit&#160;</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>D4061&#160;</td>
			<td>Store at ambient temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEG 8000 (50% solution)&#160;</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0437M (component #: B1004SVIAL)</td>
			<td>NEB M0437M contains T4 RNA Ligase 1 (30 U/&#956;L), T4 RNA Ligase Reaction Buffer (10X), PEG 8000 (1X), and ATP (100 mM); prepare a working solution (10 mM) and store it at -20&#186;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peltier Thermal Cycler</td>
			<td>MJ Research</td>
			<td>PTC-200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol:choloroform:isoamyl&#160;alcohol 25:24:1 pH = 5.2&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>J62336&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PrimeScript Buffer (5X)</td>
			<td>TaKaRa</td>
			<td>2680A&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PrimeScript Reverse Transcriptase</td>
			<td>TaKaRa</td>
			<td>2680A&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAquick&#160;Gel Extraction Kit&#160;</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28704</td>
			<td>This kit requires a heating block and isopropanol to work with</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quick-Load Purple 100 bp DNA Ladder</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>N0551S (component #: N0551SVIAL)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quick-Load Purple 50 bp DNA Ladder</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>N0556S (component #: N0556SVIAL)</td>
			<td>NEB N0556S contains Quick-Load Purple 50 bp DNA Ladder and Gel Loading Dye, Purple (6X), no SDS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RecJf&#160;(30 U/&#956;L)&#160;</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0264L (component #: M0264LVIAL)</td>
			<td>NEB M0264L contains RecJf (30 U/&#956;L) and NEBuffer 2 (10X); store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase Inhibitor (murine; 40 U/&#956;L)&#160;</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0314L&#160;(component #: M0314LVIAL)</td>
			<td>Store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SeqAMP&#160;DNA Polymerase&#160;</td>
			<td>TaKaRa</td>
			<td>638509&#160;</td>
			<td>TaKaRa 638509 contains SeqAMP&#160;DNA Polymerase&#160;and SeqAMP&#160;PCR Buffer (2X)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SeqAMP&#160;PCR Buffer (2X)&#160;</td>
			<td>TaKaRa</td>
			<td>638509&#160;</td>
			<td>TaKaRa 638509 contains SeqAMP&#160;DNA Polymerase&#160;and SeqAMP&#160;PCR Buffer (2X)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shrimp Alkaline Phosphatase (1 U/&#956;L)&#160;</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0371L&#160;(component #: M0371LVIAL)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide (NaOH)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;S5881</td>
			<td>Prepare a working solution (5 M) and store it at ambient temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA Ligase (400 U/&#956;L)&#160;</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0202L&#160;(component #: M0202LVIAL)</td>
			<td>NEB M0202L contains T4 DNA Ligase (400 U/&#956;L) and T4 DNA Ligase Reaction Buffer (10X)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA Ligase Reaction Buffer (10X)&#160;</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0202L&#160;(component #: B0202SVIAL)</td>
			<td>NEB M0202L contains T4 DNA Ligase (400 U/&#956;L) and T4 DNA Ligase Reaction Buffer (10X)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 RNA Ligase 1 (30 U/&#956;L)&#160;</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0437M (component #: M0437MVIAL)</td>
			<td>NEB M0437M contains T4 RNA Ligase 1 (30 U/&#956;L), T4 RNA Ligase Reaction Buffer (10X), PEG 8000 (1X), and ATP (100 mM)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 RNA Ligase Reaction Buffer (10X)&#160;</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0437M (component #: B0216SVIAL)</td>
			<td>NEB M0437M contains T4 RNA Ligase 1 (30 U/&#956;L), T4 RNA Ligase Reaction Buffer (10X), PEG 8000 (1X), and ATP (100 mM)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

aqrna-seq for quantifying small rnas

AQRNA-seq bietet eine direkte lineare Beziehung zwischen den Lesezahlen der Sequenzierung und der Anzahl kleiner RNA-Kopien in einer biologischen Probe und ermöglicht so eine genaue Quantifizierung des Pools kleiner RNAs. Das hier beschriebene Verfahren zur Vorbereitung der AQRNA-seq-Bibliothek beinhaltet die Verwendung von kundenspezifisch entwickelten Sequenzierungslinkern und einen Schritt zur Reduzierung von Methylierungs-RNA-Modifikationen, die die Prozessivität der reversen Transkription blockieren, was zu einer erhöhten Ausbeute an cDNAs in voller Länge führt. Darüber hinaus wird eine detaillierte Implementierung der begleitenden Bioinformatik-Pipeline vorgestellt. Diese Demonstration von AQRNA-seq wurde durch eine quantitative Analyse der 45 tRNAs in Mycobacterium bovis BCG durchgeführt, die an 5 ausgewählten Tagen über einen Zeitraum von 20 Tagen mit Nährstoffentzug und 6 Tagen Wiederbelebung entnommen wurden. Die laufenden Bemühungen zur Verbesserung der Effizienz und Strenge von AQRNA-seq werden hier ebenfalls erörtert. Dazu gehört die Erforschung von Methoden zur Vermeidung der Gelaufreinigung, zur Minderung von Primer-Dimer-Problemen nach der PCR-Amplifikation und zur Erhöhung des Anteils von Reads in voller Länge, um ein genaueres Read-Mapping zu ermöglichen. Zukünftige Verbesserungen von AQRNA-seq werden sich auf die Erleichterung der Automatisierung und Hochdurchsatzimplementierung dieser Technologie zur Quantifizierung aller kleinen RNA-Spezies in Zell- und Gewebeproben verschiedener Organismen konzentrieren.

Next-generation sequencing (NGS), also known as massively parallel sequencing, is a DNA sequencing technology that involves DNA fragmentation, ligation of adaptor oligonucleotides, polymerase chain reaction (PCR)-based amplification, sequencing of the DNA, and reassembly of the fragment sequences into a genome. The adaptation of NGS to sequence RNA (RNA-seq) is a powerful approach to identify and quantify RNA transcripts and their variants1. Innovative developments in RNA library preparation workflows and bioinformatic analysis pipelines, coupled with advancements in laboratory instrumentation, have expanded the repertoire of RNA-seq applications, progressing beyond exome sequencing into advanced functional omics like non-coding RNA profiling2, single cell analysis3, spatial transcriptomics4,5, alternative splicing analysis6, among others. These advanced RNA-seq methods reveal complex RNA functions through quantitative analysis of the transcriptome in normal and diseased cells and tissue.
Despite these advances in RNA-seq, several key technical features limit the quantitative power of the method. While most RNA-seq methods allow precise and accurate quantification of changes in the levels of RNAs between experimental variables (i.e., biological samples and/or physiological states), they cannot provide quantitative comparisons of the levels of RNA molecules within a sample. For example, most RNA-seq methods cannot accurately quantify the relative number of copies of individual tRNA isoacceptor molecules in a cellular pool of expressed tRNAs. As highlighted in the companion publication7, this limitation to RNA-seq arises from several features of RNA structure and the biochemistry of library preparation. For example, the activity of the ligation enzymes used to attach the 3&#39;- and 5&#39;-end sequencing linkers to RNA molecules is strongly influenced by the identity of the terminal nucleotides of the RNA and the sequencing linkers. This leads to large variations in efficiencies of linker ligations and profound artifactual increases in sequencing reads8,9,10.
A second set of limitations arise from the inherent structural properties of RNA molecules. Specifically, RNA secondary structure formation and dynamic changes in the dozens of post-transcriptional RNA modifications of the epitranscriptome&#160;can cause polymerase fall-off or mutation during reverse transcription. These errors result in incomplete or truncated cDNA synthesis or altered RNA sequence. While both of these phenomena can be exploited to map secondary structures or some modifications, they degrade the quantitative accuracy of RNA-seq if subsequent library preparation steps fail to capture truncated cDNAs or if data processing throws out mutated sequences not matching a reference dataset11,12. Furthermore, the immense chemical, length, and structural diversity of RNA transcripts, as well as the lack of tools to uniformly fragment long RNAs, diminishes the applicability of most RNA-seq methods to all RNA species13.
The AQRNA-seq (absolute quantification RNA sequencing) method has been developed to remove several of these technical and biological constraints that limit quantitative accuracy7. By minimizing sequence-dependent biases in capture, ligation, and amplification during RNA sequencing library preparation, AQRNA-seq achieves superior linearity compared to other methods, accurately quantifying 75% of a reference library of 963 miRNAs within 2-fold accuracy. This linear correlation of sequencing read count and RNA abundance is also observed in an analysis of a variable length pool of RNA oligonucleotide standards and in reference to orthogonal methods like northern blotting. Establishing linearity between sequencing read count and RNA abundance enables AQRNA-seq to achieve accurate, absolute quantification of all RNA species within a sample.
Here is a description of the protocol for AQRNA-seq library preparation workflow and the accompanying downstream data analytics pipeline. The method was applied to elucidate the dynamics of tRNA abundance during starvation-induced dormancy and subsequent resuscitation in&#160;the Mycobacterium bovis bacilli de Calmette et Gu&#233;rin (BCG) model of tuberculosis. Results were presented for the exploratory visualization of the sequencing data, along with subsequent clustering and differential expression analyses that unveiled discernable patterns in tRNA abundance associated with various phenotypes.

Autor im Rampenlicht: Die Rolle von AQRNA-seq bei der Kartierung kleiner RNAs und der Entschlüsselung von Protein-Translationsmechanismen

AQRNA-seq zur Quantifizierung kleiner RNAs

AQRNA sequencing quantitatively maps small RNAs such as microRNAs, tRNAs, and tRNA fragments in virtually any cell or tissue sample. It can be used to map some of the 170 known tRNA modifications, but there are other methods that are more specific for mapping. You can use AQRNA-seq to discover disease biomarkers in the RNome and explore protein translation mechanisms at the systems level.Most RNA-seq methods can't accurately quantify the abundance of individual RNA molecules in a sample. This is caused by both structural properties of the RNA, such as secondary structures, post transcriptional modifications, as well as the biochemistry of library preparation such as ligation biases of a thousand fold induced by the terminal nucleotides on the RNAs. AQRNA-seq was developed to overcome several technical and biological challenges, limiting the accurate quantification of RNA abundance in the sample.Compared to other matters, it achieves linearity between recounts and copy numbers of RNA molecules, accurately, it quantifies 75%of a reference library, compressing 963 microRNAs with twofold accuracy. AQRNA-seq is unique in providing absolute quantification of small RNAs. This links the sequencing recounts directly to the number of copies of an RNA molecule in the sample.This level of accuracy is crucial for comparing dozens to hundreds of tRNAs in a sample, and it's unlike regular small RNA-seq, which only permits relative quantification across conditions and samples. We designed AQRNA-seq for an unmet need in understanding protein translation. We found that cells reprogrammed dozens of tRNA modifications in the number of copies of the modified tRNAs, to allow selective translation of messenger RNAs that are enriched with codons matching those tRNAs.AQRNA-seq allows us to quantify changes in the tRNA pool as part of this mechanism. We've used it extensively to validate this new model for protein translation.

Mycobacterium bovis BCG (bacilli de Calmette et Guérin) Stamm 1173P2, die exponentiell wuchsen, wurden einer Zeitreihe (0, 4, 10 und 20 Tage) von Nährstoffmangel unterzogen, gefolgt von einer 6-tägigen Wiederbelebung in nährstoffreichem Medium, wie zuvor in Hu et al.7 beschrieben. Kleine RNAs wurden aus Bakterienkulturen mit drei biologischen Replikaten zu jedem der fünf festgelegten Zeitpunkte isoliert. Die Illumina-Bibliotheken wurden unter Verwendung des oben beschriebenen AQRNA-s...

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Die absolute Quantifizierung der RNA-Sequenzierung (AQRNA-seq) ist eine Technologie, die entwickelt wurde, um die Landschaft aller kleinen RNAs in biologischen Gemischen zu quantifizieren. Hier werden sowohl die Bibliotheksvorbereitung als auch die Datenverarbeitungsschritte von AQRNA-seq demonstriert, wobei Veränderungen im Transfer-RNA (tRNA)-Pool in Mycobacterium bovis BCG während der hungerinduzierten Dormanzphase quantifiziert werden.

AQRNA-seq provides a direct linear relationship between sequencing read counts and small RNA copy numbers in a biological sample, thus enabling accurate ...

Bei der AQRNA-Sequenzierung werden kleine RNAs wie microRNAs, tRNAs und tRNA-Fragmente in praktisch jeder Zell- oder Gewebeprobe quantitativ abgebildet. Es kann verwendet werden, um einige der 170 bekannten tRNA-Modifikationen zu kartieren, aber es gibt auch andere Methoden, die spezifischer für die Kartierung sind. Sie können AQRNA-seq verwenden, um Krankheitsbiomarker im RNome zu entdecken und Proteintranslationsmechanismen auf Systemebene zu untersuchen.Die meisten RNA-Seq-Methoden können die Häufigkeit einzelner RNA-Moleküle in einer Probe nicht genau quantifizieren. Dies wird sowohl durch strukturelle Eigenschaften der RNA, wie z.B. Sekundärstrukturen, posttranskriptionelle Modifikationen, als auch durch die Biochemie der Bibliotheksvorbereitung verursacht, wie z.B. tausendfache Ligationsverzerrungen, die durch die terminalen Nukleotide auf den RNAs induziert werden. AQRNA-seq wurde entwickelt, um mehrere technische und biologische Herausforderungen zu überwinden und die genaue Quantifizierung der RNA-Häufigkeit in der Probe einzuschränken.Im Vergleich zu anderen Themen erreicht es eine Linearität zwischen Nachzählungen und Kopienzahlen von RNA-Molekülen, es quantifiziert 75% einer Referenzbibliothek und komprimiert 963 microRNAs mit zweifacher Genauigkeit. AQRNA-seq ist einzigartig in der absoluten Quantifizierung kleiner RNAs. Dadurch werden die Sequenzierungszählungen direkt mit der Anzahl der Kopien eines RNA-Moleküls in der Probe verknüpft.Dieses Maß an Genauigkeit ist entscheidend für den Vergleich von Dutzenden bis Hunderten von tRNAs in einer Probe und unterscheidet sich von regulären kleinen RNA-seq, die nur eine relative Quantifizierung über Bedingungen und Proben hinweg ermöglicht. Wir haben AQRNA-seq für einen ungedeckten Bedarf an Verständnis der Proteintranslation entwickelt. Wir fanden heraus, dass Zellen Dutzende von tRNA-Modifikationen in der Anzahl der Kopien der modifizierten tRNAs umprogrammierten, um eine selektive Translation von Boten-RNAs zu ermöglichen, die mit Codons angereichert sind, die zu diesen tRNAs passen.AQRNA-seq ermöglicht es uns, Veränderungen im tRNA-Pool als Teil dieses Mechanismus zu quantifizieren. Wir haben es ausgiebig genutzt, um dieses neue Modell für die Proteintranslation zu validieren.

Research

JoVE Journal

Genetics

AQRNA-seq for Quantifying Small RNAs

499 Views.  Massachusetts Institute of Technology. AQRNA sequencing quantitatively maps small RNAs such as microRNAs, tRNAs, and tRNA fragments in virtually any cell or tissue sample. It can be used to map some of the 170 known tRNA modifications, but there are other methods that are more specific for mapping. You can use AQRNA-seq to discover disease biomarkers in the RNome and explore protein translation mechanisms at the systems level.Most RNA-seq methods can't accurately quantify the abundance of individual RNA molecules in a sampl...