Name: Author Spotlight: Exploring the Relationship Between Lipotoxicity and HFpEF
Uploaded: 2024-03-29T13:50:00
Duration: 1 min 59 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Author Spotlight: Exploring the Relationship Between Lipotoxicity and HFpEF at JoVE.com

We danken het Penncore en NHLBI Gene Therapy Resource Program (GTRP) voor het financieren van de generatie van het Adeno-geassocieerde virus dat in dit project wordt gebruikt. Dit onderzoek werd gefinancierd door subsidies van het National Institute of Health (NIH) (1R01HL140468) en het Miami Heart Research Institute aan LS. MW ontving van 2020 - 2022 (R01HL140468- 03S1) de NIH Diversity Supplement Award. JH wordt gefinancierd door 1R01 HL13735, 1R01 HL107110, 5UM1 HL113460, 1R01 HL134558, 5R01 CA136387 (van de NIH), W81XWH-19-PRMRPCTA (van het ministerie van Defensie) en de Starr, Lipson en Soffer Family Foundations.

Het dierprotocol is goedgekeurd door het Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) van de Universiteit van Miami, in overeenstemming met de richtlijnen van het National Institute of Health (NIH) (IACUC-protocol 23-103-ad03). Voor de huidige studie werden wild-type (WT) muizen met een 129J-achtergrond verworven uit een commerciële bron (zie Materiaaltabel) en in eigen huis gefokt. Alle muizen waren nestgenoten op 129J achtergrond. Experimenten omvatten zowel mannelijke als vrouwelijke muizen. De LDLR/P-407 HFpEF-muis werd vastgesteld door toediening van een enkele dosis AAV9-cTnT-LDLR in week één en tweewekelijks p407 gedurende vier weken.
1. Bereiding en toediening van AAV9-cTnT-LDLR
OPMERKING: AAV9-cTNT-hLDLR-plasmide (zie materiaaltabel) codeert voor het volledige humane LDLR-eiwit (2664bp) (Figuur 1).
<ol><li>Bereiding van AAV-LDLR-virale vectoren<ol><li>Ontdooi op basis van het aantal dieren AAV9-voorraadflesjes op ijs gedurende 20 minuten en verdun vervolgens AAV-deeltjes in Dulbecco's fosfaatgebufferde zoutoplossing (DPBS) om een concentratie van 1 x10 12 vectorgenomen/muis in 100 μL te krijgen.</li>
		<li>Plaats de virale oplossing in een naald van 28-30 G op een spuit van 1 ml. Zorg ervoor dat er geen luchtbellen in de naald trekken.</li>
	</ol></li>
	<li>Intraveneuze (i.v.) injectieprocedures voor staartaders<ol><li>Zet de zuurstof aan tot 0,5 l/min en stel het isofluraan-anesthesiesysteem in op 4%-5%. Plaats de muis ~2 minuten in de inductiekamer, totdat het dier niet meer reageert.</li>
		<li>Plaats het dier op een muisstaartverlichtingstrainer (bijv. Braintree Scientific, Inc. (Braintree, MA)) en plaats het dier dat op zijn zij ligt. Gebruik isofluraan anesthesie tot 2%-3% voor onderhoud. OPMERKING: De verhitting door het restrainer-apparaat zal verwijding van de staartader van de muis veroorzaken en daardoor aanzienlijk gemakkelijker te injecteren.</li>
		<li>Identificeer de laterale staartader. Reinig het injectiegebied met een antisepticum met behulp van een gaasje.</li>
		<li>Houd het uiteinde van de staart vast om deze uit te strekken en masseer de muisstaart met de vingers totdat de ader zichtbaar is. Steek de naald onder een lage hoek in (hoek van 10-15 graden) en injecteer 100 μL verdunde AAV in de staartader (Figuur 2A).</li>
		<li>Trek de naald terug en oefen onmiddellijk druk uit met een vinger totdat het bloeden stopt. Plaats de muis terug in de originele kooi.</li>
	</ol></li>
</ol>2. P-407 Voorbereiding en toediening
<ol><li>P-407 voorbereiding<ol><li>Bereid de oplossing voor door het middel P-407 (zie materiaaltabel) te verdunnen met DPBS tot een eindconcentratie van 100 mg/ml in een zuurkast. Zet de oplossing een nacht in de koelkast bij 4 °C op een rotator om het oplossen van de P-40710 te vergemakkelijken.</li>
	</ol></li>
	<li>Tweewekelijkse intraperitoneale (i.p.) injectieprocedure<ol><li>Weeg elke muis op de eerste dag van de i.p.-injecties. Bereken aan de hand van de formule 1 g/kg de juiste dosis voor elke muis op basis van het gewicht en de voorvulspuiten.</li>
		<li>Houd de muis onder een zuurkast handmatig vast met het hoofd en het lichaam naar beneden gekanteld om de inwendige organen craniaal te verplaatsen. Deze techniek vermijdt het doorboren van vitale structuren in de omgeving.</li>
		<li>Identificeer de linker buikholte in het onderste kwadrant van de buik, lateraal van de middellijn. Reinig de site met een antisepticum.</li>
		<li>Steek de naald in een hoek van 45 graden of minder in de peritoneale holte (Figuur 2B). Zuig de spuit op om ervoor te zorgen dat de spuit adequaat wordt ingebracht.</li>
		<li>Als er bloed of weefsel aanwezig is bij het inademen, trek dan de naald terug en herhaal stap 2.2.2 -2.2.4 totdat de spuit helder is. Gooi de naald weg in de daarvoor bestemde naaldcontainer en plaats de muis terug in de originele kooi.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Beoordeling echocardiografie
<ol><li>Voorbereiding<ol><li>Breng de dag ervoor of enkele uren voor de beeldvorming ontharingscrème aan op de borst en bovenbuik van de muis. Verwijder de crème met een nat gaasje na 2 min.</li>
		<li>Verdoof de muis met 2,5%-3,0% isofluraan bij een debiet van 0,8 l/min en onderhoud met 1%-1,5% isofluraan. Zet de muis vervolgens vast op het juiste platform in rugligging met de poten op elektrodepads met geleidende gel en bedek de neus en mond met een neuskegel om continue anesthesie met isofluraan te garanderen.</li>
	</ol></li>
	<li>Parasternale aanzicht op de lange as<ol><li>Kantel de rechterkant van het platform, terwijl de muis in rugligging ligt, 45 graden.</li>
		<li>Lijn vervolgens de transducersonde diagonaal uit in het railsysteem en kantel deze 30-40 graden met de klok mee van de rechter bovenste extremiteit naar de linkerbuik om beelden in de B-modus te verkrijgen en op te slaan.</li>
		<li>Analyseer de beelden in de B-modus met behulp van ultrasone analysesoftware (zie Tabel met materialen) om de ejectiefractie te verkrijgen (Figuur 3A).</li>
	</ol></li>
	<li>Parasternale korte-asweergave<ol><li>Draai de transducersonde in het railsysteem 90 graden met de klok mee om beelden in B-modus en M-modus te verkrijgen en op te slaan.</li>
	</ol></li>
	<li>Apicale weergave<ol><li>Kantel de linkerbovenhoek van het platform naar beneden en naar rechts. Richt de transducer op de rechterschouder van het dier.</li>
		<li>Visualiseer de mitralisklep in B-modus en kleurendopplermodus. Verkrijg en bewaar gepulseerde golf (PW) Doppler- en weefsel-Doppler-beelden5.</li>
		<li>Analyseer de PW Doppler- en weefsel-Doppler-beelden met behulp van de ultrasone analysesoftware om de IVRT, E/E' en E/A te verkrijgen (Figuur 3B-E).</li>
	</ol></li>
</ol>4. Registratie van druk-volume (PV) lusgegevens
<ol><li>Voer hemodynamische analyses uit aan het einde van het onderzoek om de systolische en diastolische functie van de linkerventrikel (LV) te beoordelen, volgens de eerder beschreven procedure11,12.<ol><li>Begin met het induceren van de muis met isofluraan (3-5%, inductiekamer).</li>
		<li>Wanneer de verdovende werking begint, brengt u het dier over naar de operatiekamer en handhaaft u de anesthesie met isofluraan (1-3%, gezichtsmasker).</li>
		<li>Maak een kleine incisie in de huid boven de nek om endotracheale intubatie (via de mond) mogelijk te maken.</li>
		<li>Beadem het dier met een mengsel van zuurstof en isofluraan met behulp van een knaagdierventilator (bijv. Micro vent model 848, Harvard-apparaat) ingesteld op ~ 0,15-0,2 ml volume en de ademhalingsfrequentie op 120-170 ademhalingen/min.</li>
		<li>Bewaak de lichaamstemperatuur op ~37 °C ± 1 °C gedurende de hele procedure met behulp van een operatietafel met temperatuurregeling.</li>
		<li>Leg de linker interne halsader bloot en kannuleer deze met een naald van 30 G voor toediening van vloeistofondersteuning.</li>
		<li>Snijd de huid over de plaats van de mediane ventrale hals en leg de halsslagader bloot. Maak na occlusie van het distale deel van de rechter halsslagader een kleine snee in de slagader om de inbreng van een micro-getipte druk-volume (PV) katheter (zie Materiaaltabel) in de linker ventrikel (gesloten thoraxbenadering).</li>
		<li>Neem PV-lussen op tijdens steady-state en inferieure vena cava-occlusie.</li>
		<li>Aan het einde van het experiment euthanaseert u het dier op humane wijze (onder diepe verdoving) met behulp van een goedgekeurde AVMA-methode (bijv. Isofluraan gevolgd door cervicale dislocatie).</li>
		<li>Analyseer de PV-gegevens met behulp van LabChart-software (zie Materiaaltabel) en kalibreer volumes met behulp van echocardiografische metingen.</li>
	</ol></li>
</ol>

Investigating HFpEF Pathophysiology in a Hyperlipidemia&#45;Induced Mouse Model

<ol>
	<li>Roger, V. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidemiology+of+heart+failure:+A+contemporary+perspective.">Epidemiology of heart failure: A contemporary perspective.</a> Circ Res. 128 (10), 1421-1434 (2021).</li><li>Kosiborod, M. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+and+baseline+characteristics+of+step-HFpEF+program+evaluating+semaglutide+in+patients+with+obesity+hfpef+phenotype.">Design and baseline characteristics of step-HFpEF program evaluating semaglutide in patients with obesity hfpef phenotype.</a> JACC Heart Fail. 11 (8), 1000-1010 (2023).</li><li>Borlaug, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+and+management+of+heart+failure+with+preserved+ejection+fraction.">Evaluation and management of heart failure with preserved ejection fraction.</a> Nat Rev Cardiol. 17 (9), 559-573 (2020).</li><li>Badrov, M. B., Mak, S., Floras, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiovascular+autonomic+disturbances+in+heart+failure+with+preserved+ejection+fraction.">Cardiovascular autonomic disturbances in heart failure with preserved ejection fraction.</a> Can J Cardiol. 37 (4), 609-620 (2021).</li><li>Wu, C. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myocardial+adipose+deposition+and+the+development+of+heart+failure+with+preserved+ejection+fraction.">Myocardial adipose deposition and the development of heart failure with preserved ejection fraction.</a> Eur J Heart Fail. 22 (3), 445-454 (2020).</li><li>Hahn, V. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myocardial+gene+expression+signatures+in+human+heart+failure+with+preserved+ejection+fraction.">Myocardial gene expression signatures in human heart failure with preserved ejection fraction.</a> Circulation. 143 (2), 120-134 (2021).</li><li>Korolenko, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early-stage+atherosclerosis+in+poloxamer+407-induced+hyperlipidemic+mice:+Pathological+features+and+changes+in+the+lipid+composition+of+serum+lipoprotein+fractions+and+subfractions.">Early-stage atherosclerosis in poloxamer 407-induced hyperlipidemic mice: Pathological features and changes in the lipid composition of serum lipoprotein fractions and subfractions.</a> Lipids Health Dis. 15, 16 (2016).</li><li>Patel, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteopontin+and+ldlr+are+upregulated+in+hearts+of+sudden+cardiac+death+victims+with+heart+failure+with+preserved+ejection+fraction+and+diabetes+mellitus.">Osteopontin and ldlr are upregulated in hearts of sudden cardiac death victims with heart failure with preserved ejection fraction and diabetes mellitus.</a> Front Cardiovasc Med. 7, 610282 (2020).</li><li>Williams, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+model+of+heart+failure+with+preserved+ejection+fraction+driven+by+hyperlipidemia+and+enhanced+cardiac+low-density+lipoprotein+receptor+expression.">Mouse model of heart failure with preserved ejection fraction driven by hyperlipidemia and enhanced cardiac low-density lipoprotein receptor expression.</a> J Am Heart Assoc. 11 (17), e027216 (2022).</li><li>Colly, A., Marquette, C., Courtial, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Poloxamer/poly(ethylene+glycol)+self-healing+hydrogel+for+high-precision+freeform+reversible+embedding+of+suspended+hydrogel.">Poloxamer/poly(ethylene glycol) self-healing hydrogel for high-precision freeform reversible embedding of suspended hydrogel.</a> Langmuir. 37 (14), 4154-4162 (2021).</li><li>Kanashiro-Takeuchi, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficacy+of+a+growth+hormone-releasing+hormone+agonist+in+a+murine+model+of+cardiometabolic+heart+failure+with+preserved+ejection+fraction.">Efficacy of a growth hormone-releasing hormone agonist in a murine model of cardiometabolic heart failure with preserved ejection fraction.</a> Am J Physiol Heart Circ Physiol. 324 (6), H739-H750 (2023).</li><li>Dulce, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+growth+hormone-releasing+hormone+agonist+ameliorates+the+myocardial+pathophysiology+characteristic+of+heart+failure+with+preserved+ejection+fraction.">Synthetic growth hormone-releasing hormone agonist ameliorates the myocardial pathophysiology characteristic of heart failure with preserved ejection fraction.</a> Cardiovasc Res. 118 (18), 3586-3601 (2023).</li><li>Borlaug, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Obesity+and+heart+failure+with+preserved+ejection+fraction:+New+insights+and+pathophysiological+targets.">Obesity and heart failure with preserved ejection fraction: New insights and pathophysiological targets.</a> Cardiovasc Res. 118 (18), 3434-3450 (2023).</li><li>Noll, N. A., Lal, H., Merryman, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+models+of+heart+failure+with+preserved+or+reduced+ejection+fraction.">Mouse models of heart failure with preserved or reduced ejection fraction.</a> Am J Pathol. 190 (8), 1596-1608 (2020).</li><li>Guarnieri, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Considering+the+risks+and+safety+of+intraperitoneal+injections.">Considering the risks and safety of intraperitoneal injections.</a> Lab Anim (NY). 45 (4), 131 (2016).</li></ol>

JH wordt vermeld als mede-uitvinder van patenten op GHRH-analogen, die zijn toegewezen aan de Universiteit van Miami en de afdeling Veteranenzaken. JH bezat eerder aandelen in Biscayne Pharmaceuticals, de licentiehouder van intellectueel eigendom die in deze studie werd gebruikt. Biscayne Pharmaceuticals heeft geen financiering verstrekt voor deze studie. JH meldde een patent te hebben voor therapie op basis van hartcellen. Hij heeft aandelen in Vestion Inc. en onderhoudt een professionele relatie met Vestion Inc. als consultant en lid van de Raad van Bestuur en de Wetenschappelijke Adviesraad. JH is de Chief Scientific Officer, een gecompenseerde consultant en lid van de adviesraad voor Longeveron en heeft aandelen in Longeveron. JH is ook de mede-uitvinder van intellectueel eigendom dat in licentie is gegeven aan Longeveron. Longeveron LLC en Vestion Inc. hebben niet deelgenomen aan de financiering van dit werk. De relaties van JH worden bekendgemaakt aan de Universiteit van Miami en er is een managementplan.

Ondanks de gestage toename van de prevalentie van HFpEF in het afgelopen decennium, blijft een concreet begrip van de onderliggende pathofysiologie ongrijpbaar13. Bovendien bestaat er tot op heden een beperkte evidence-based therapie13. Een beter begrip van de mechanismen die betrokken zijn bij cardio-metabole HFpEF is noodzakelijk. Eerder werd een hyperlipidemisch muismodel geïntroduceerd dat HFpEF nabootst zonder chronische nierziekte (CKD) of hypertensie geïnduceerd door cardiale LDLR-OE- en p407-injecties9. 
Bevindingen toonden aan dat de combinatie van cardiale LDLR OE en hyperlipidemie resulteert in diastolische disfunctie, aritmieën, linkerventrikel (LV) hypertrofie, inspanningsintolerantie, cardiale lipide-accumulatie en fibrose bij muizen na vier weken, zoals eerder gepubliceerd9. Een toename van de opname van LDL-cholesterol in het hart, de lever en de skeletspieren en verlaagde triglyceriden in de harten en lever van deze muizen werden ook waargenomen9. Het voordeel van deze methode ligt in de snelheid voor het onderzoeken van de routes van het cardio-metabool syndroom, die niet goed worden begrepen in vergelijking met andere hyperlipidemische HFpEF-muismodellen, zoals het vetrijke dieet (HFD) dat tot 16 en 20 weken nodig heeft om zich te ontwikkelen14. Dit model heeft vier weken nodig om zich te ontwikkelen en bootst metabole afwijkingen bij mensen na. Daarom is de reproduceerbaarheid van dit model essentieel. 
Het is absoluut noodzakelijk om te zorgen voor een grondige voorbereiding en toediening van AAV9-cTnT-LDLR en P-407. De reproduceerbaarheid van dit model is sterk afhankelijk van nauwkeurige berekeningen van P-407- en AAV9-cTnT-LDLR-concentraties en doses, evenals gewichtsmetingen. Even belangrijk zijn oplossingspreparaten en de juiste intraveneuze en intraperitoneale injectietechnieken. Afwijkingen in deze technieken kunnen leiden tot aanzienlijke wijzigingen en ongewenste resultaten. 
Ondanks de effectiviteit en efficiëntie van dit model, zijn er verschillende beperkingen. Rigoureuze training is nodig om intraveneuze en intraperitoneale injecties uit te voeren. Bovendien is er een potentieel risico op morbiditeit en mortaliteit geassocieerd met intraveneuze en frequente intraperitoneale injecties. Verwondingen aan de muizenstaart kunnen het gevolg zijn bij het uitvoeren van intraveneuze injecties, terwijl cecale punctie kan optreden bij intraperitoneale injecties, wat leidt tot peritonitis15. Deze verwondingen zijn meestal te wijten aan onjuiste technieken en kunnen leiden tot het verlies van proefpersonen en behandeling. Daarom is een uitgebreide training nodig voordat deze procedures worden uitgevoerd. Een andere beperking is de focus van dit model op de 129J soort. De grondgedachte achter de keuze voor de 129J-stam komt voort uit voorlopige studies die snellere diastolische disfunctie en HFpEF-bevindingen opleverden in deze stam in vergelijking met de C57BL/6-muizen die we aanvankelijk bestudeerden in niet-gepubliceerde onderzoeken.
Ongeacht deze beperkingen zal dit model sneller onderzoek mogelijk maken naar de onderliggende mechanismen die betrokken zijn bij HFpEF en mogelijke effectieve behandelingsopties. Eerdere studies hebben geleid tot de ontwikkeling van een pathofysifysiologisch model voor cardiometabool HFpEF-geïnduceerd HFD en N[w]-nitro-l-argininemethylester (L-NAME) gedurende 5-15 weken13. Vanwege de gestage toename van de prevalentie van HFpEF is er echter dringend behoefte aan meer begrip van de pathofysiologie van cardiometabool HFpEF en de ontwikkeling van effectieve therapie. Dit muizenmodel van cardiale LDLR OE en p407-geïnduceerde hyperlipidemie is een snelle en haalbare methode om cardiometabolisch HFpEF te induceren voor toekomstige onderzoeksinspanningen.

Hartfalen met behouden ejectiefractie (HFpEF) duidt op een cardiometabool syndroom dat gepaard gaat met meerdere comorbiditeiten en vormt meer dan 50% van alle gevallen van hartfalen 1,2. Bovendien is de frequentie van HFpEF de afgelopen tien jaar gestaag gestegen3. Met beperkte behandelingsopties vertegenwoordigt HFpEF de belangrijkste onvervulde medische noodzaak bij hart- en vaatziekten, gezien de veelzijdige pathofysiologie4. Er bestaat dus een dringende behoefte om het begrip van de onderliggende mechanismen en pathofysiologie van HFpEF te verbeteren om effectieve therapieën te ontwikkelen.
Ondanks aanzienlijke vooruitgang in de afgelopen jaren, blijft de pathofysiologie van HFpEF toegeschreven aan lipotoxiciteit onvolledig begrepen. Het is vastgesteld dat patiënten met HFpEF een opmerkelijke myocardiale lipideaccumulatie vertonen in vergelijking met patiënten met hartfalen met verminderde ejectiefractie (HFrEF) en gezonde controles. RNA-sequentiegegevens van hartbiopten toonden neerwaartse regulatie van het lipoproteïnelipase (LPL)-gen in de HFpEF-groep in vergelijking met de gezonde en HFrEF-patiënten6. Poloxamer-407 (P-407) is een blokcopolymeer dat hyperlipidemie induceert door LPL te blokkeren en vervolgens plasmatriglyceriden en LDL-cholesterol (low-density lipoproteïne) te verhogen7. Eerdere studies toonden een hoge expressie van LDL-receptoren (LDLR) aan in de harten van HFpEF-muizen8. 
Voortbouwend op deze bevindingen en in het besef van de dringende behoefte aan diermodellen die cardio-metabolisch HFpEF nauwkeurig nabootsen, werd een door hyperlipidemie geïnduceerd muizenmodel ontwikkeld en gepresenteerd. Dit model is op maat gemaakt om HFpEF te onderzoeken, waarbij expliciet de nadruk ligt op de betrokkenheid van lipotoxiciteit naast metabool syndroom. Geïnduceerd door hyperlipidemie/LPL-blokkade en verbeterde cardiale LDLR-expressie, werd dit model vastgesteld bij WT-129-muizen met een 129J-achtergrond door middel van tweewekelijkse intraperitoneale (i.p.) injecties van P-407 in combinatie met een enkele intraveneuze (i.v.) injectie van adeno-geassocieerd virus 9-cardiale troponine T-LDLR (AAV9-cTnT-LDLR)9.
Tussen 4 en 8 weken na de behandeling werd een uitgebreid scala aan beoordelingen uitgevoerd, waaronder echocardiografie, bloeddrukregistraties, plethysmografie van het hele lichaam (WBP), continue elektrocardiografie (ECG) telemetrie, monitoring van het activiteitenwiel (AWM), evenals biochemische en histologische analyses9. Na vier weken vertoonden de LDLR/P407- of "dubbele behandeling"-muizen duidelijke HFpEF-kenmerken, waaronder diastolische disfunctie, behouden ejectiefractie en verhoogde dikte van de linkerventrikelwand9. Bovendien onthulden ECG-telemetrie en AWM respectievelijk hartblokkades en verminderde activiteit. Met name de bloeddruk en de nierfunctie bleven normaal9. Na acht weken verslechterde de diastolische functie en WBP-metingen onthulden verminderde ademhalingsfrequenties9.
Verdere verkenning van het dubbele behandelingsmodel onthulde fibrose, verhoogde nat/droge longverhoudingen en hartgewicht/lichaamsgewichtverhoudingen9. Autopsie onthulde ascites, cardiale ischemie en xanthelasmas. Intrigerend genoeg werden plotselinge sterfgevallen gedocumenteerd tussen 6 en 12 weken na de behandeling9. Dit door hyperlipidemie gedreven HFpEF-model van muizen biedt een snel, waardevol en veelbelovend experimenteel hulpmiddel voor het ontrafelen van de complexiteit van het metabool syndroom dat bijdraagt aan diastolische disfunctie met lipotoxiciteit-gemedieerde HFpEF.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Adeno-associated virus 9-cardiac troponin T-LDLR (AAV9-cTnT-LDLR)</td>
			<td>U. Penn Vector Core, funded by the NHLBI Gene Therapy Program (GTRP)</td>
			<td></td>
			<td>Transgene plasmids and AAVs particles were generated by the U. Penn Vector Core, funded by the NHLBI Gene Therapy Program (GTRP). AAV were provided in Dulbecco&#8217;s phosphate-buffered saline (PBS) with 0.001% Pluronic F68. The Core determined AAV titers by digital droplet polymerase chain reaction (ddPCR) and assessed all preparations for capsid protein ratio by SDS-PAGE and for the presence of endotoxin. Constructs include the human (h) transcripts tagged by 3X HA, Penn Vector Core (RRID: SCR_022432). AAV9-cTNT-hLDLR plasmid encodes the full human LDLR protein (2664bp).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaging systems with a high frequency transducer probe MS400&#160;</td>
			<td>(VisualSonics, Toronto, ON, Canada)</td>
			<td>Vevo 2100 or 3100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Akorn Animal Health, Inc.</td>
			<td>NDC: 59399-106-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LabChart&#160; software</td>
			<td>ADInstruments</td>
			<td>Pro version 8.1.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poloxamer 407</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>16758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PV catheter</td>
			<td>Millar Instrument</td>
			<td>PVR 1035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasound analysis software&#160;</td>
			<td>Vevo Lab</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wild-type (WT) mice on 129J background&#160;</td>
			<td>Jackson Laboratory&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a murine model of hyperlipidemia&#45;induced heart failure with preserved ejection fraction

De pathofysiologie van hartfalen met behouden ejectiefractie (HFpEF) aangedreven door lipotoxiciteit wordt onvolledig begrepen. Gezien de dringende behoefte aan diermodellen die cardio-metabolisch HFpEF nauwkeurig nabootsen, werd een hyperlipidemie-geïnduceerd muizenmodel ontwikkeld door reverse engineering van fenotypes die werden gezien bij HFpEF-patiënten. Dit model was gericht op het onderzoeken van HFpEF, met de nadruk op de wisselwerking tussen lipotoxiciteit en metabool syndroom. Hyperlipidemie werd geïnduceerd bij wildtype (WT) muizen op een achtergrond van 129J-stam door middel van tweewekelijkse intraperitoneale injecties van poloxamer-407 (P-407), een blokcopolymeer dat lipoproteïnelipase blokkeert, gecombineerd met een enkele intraveneuze injectie van adeno-geassocieerd virus 9-cardiale troponine T-lipoproteïnereceptor met lage dichtheid (AAV9-cTnT-LDLR). Tussen 4 en 8 weken na de behandeling werden uitgebreide beoordelingen uitgevoerd, waaronder echocardiografie, bloeddrukregistratie, plethysmografie van het hele lichaam, echocardiografie (ECG) telemetrie, monitoring van het activiteitenwiel (AWM) en biochemische en histologische analyses. De LDLR/P-407-muizen vertoonden na vier weken onderscheidende kenmerken, waaronder diastolische disfunctie, behouden ejectiefractie en verhoogde dikte van de linkerventrikelwand. Met name de bloeddruk en de nierfunctie bleven binnen normale waarden. Bovendien onthulden ECG en AWM respectievelijk hartblokkades en verminderde activiteit. De diastolische functie verslechterde na acht weken, wat gepaard ging met een aanzienlijke afname van de ademhalingsfrequentie. Verder onderzoek naar het dubbele behandelingsmodel onthulde verhoogde fibrose, nat/droge longverhoudingen en hartgewicht/lichaamsgewichtverhoudingen. De LDLR/P-407-muizen vertoonden xanthelasmas, ascites en cardiale ischemie. Interessant is dat plotselinge sterfgevallen plaatsvonden tussen 6 en 12 weken na de behandeling. Het HFpEF-model van muizen biedt een waardevolle en veelbelovende experimentele bron voor het ophelderen van de fijne kneepjes van het metabool syndroom dat bijdraagt aan diastolische disfunctie binnen de context van lipotoxiciteit-gemedieerde HFpEF.

Heart failure with preserved ejection fraction (HFpEF) denotes a cardiometabolic syndrome accompanied by multiple comorbidities and constitutes over 50% of all heart failure cases1,2. Moreover, the frequency of HFpEF has steadily risen over the past decade3. With limited treatment options, HFpEF represents the most significant unmet medical necessity in cardiovascular disease, given its multifaceted pathophysiology4. Thus, an urgent need exists to enhance comprehension of the underlying mechanisms and pathophysiology of HFpEF to develop effective therapies.
Despite significant advancements in recent years, the pathophysiology of HFpEF attributed to lipotoxicity remains incompletely understood. It is established that patients with HFpEF exhibit notable myocardial lipid accumulation compared to those with heart failure with reduced ejection fraction (HFrEF) and healthy controls5. RNA sequencing data from cardiac biopsies showed downregulation of the lipoprotein lipase (LPL) gene in the HFpEF group compared to the healthy and HFrEF patients6. Poloxamer-407 (P-407) is a block co-polymer that induces hyperlipidemia by blocking LPL and subsequently increasing plasma triglycerides and low-density lipoprotein (LDL) cholesterol7. Previous studies demonstrated high LDL-Receptor (LDLR) expression in the hearts of HFpEF mice8. 
Building upon these findings and recognizing the pressing need for animal models accurately mimicking cardio-metabolic HFpEF, a hyperlipidemia-induced murine model was developed and presented. This model was tailored to explore HFpEF, explicitly focusing on the involvement of lipotoxicity alongside metabolic syndrome. Induced by hyperlipidemia/LPL blockade and enhanced cardiac LDLR expression, this model was established in WT-129 mice on 129J background through biweekly intraperitoneal (i.p.) injections of P-407 combined with a single intravenous (i.v.) injection of adeno-associated virus 9-cardiac troponin T-LDLR (AAV9-cTnT-LDLR)9.
Between 4 and 8 weeks post-treatment, an extensive array of assessments was conducted, encompassing echocardiography, blood pressure recordings, whole-body plethysmography (WBP), continuous electrocardiography (ECG) telemetry, activity wheel monitoring (AWM), as well as biochemical and histological analyses9. At four weeks, the LDLR/P407 or "double treatment" mice exhibited distinct HFpEF features, including diastolic dysfunction, preserved ejection fraction, and increased left ventricular wall thickness9. Additionally, ECG telemetry and AWM revealed heart blocks and reduced activity, respectively. Notably, blood pressure and renal function remained normal9. By eight weeks, diastolic function deteriorated, and WBP measurements unveiled reduced respiratory rates9. 
Further exploration of the double treatment model revealed fibrosis, elevated wet/dry lung ratios, and heart weight/body weight ratios9. Necropsy revealed ascites, cardiac ischemia, and xanthelasmas. Intriguingly, sudden deaths were documented between 6 and 12 weeks post-treatment9. This murine hyperlipidemia-driven HFpEF model provides a rapid, valuable, and promising experimental tool for unraveling the complexities of metabolic syndrome contributing to diastolic dysfunction with lipotoxicity-mediated HFpEF.

Author Spotlight: Exploring the Relationship Between Lipotoxicity and HFpEF 

Een muizenmodel van door hyperlipidemie geïnduceerd hartfalen met behouden ejectiefractie

Na 4 weken gecombineerde enkelvoudige dosis i.v. AAV9-cTnT-LDLR en tweewekelijkse i.p. P-407-injecties, echocardiografie toonde HFpEF aan, zoals blijkt uit de behouden ejectiefractie, verlengde intraventriculaire relaxatietijd (IVRT) en E/E', evenals verminderde E/A (figuur 3A-E). Ergere diastolische disfunctie werd waargenomen na 8 weken in vergelijking met gegevens na 4 weken. Druk-volume (PV) lusanalyse na 8 weken behandeling toonde een verhoogde helling van de einddiastolische druk-volumerelatie, wat de echocardiografiebevindingen van diastolische disfunctie bevestigt (Figuur 3F). Met name bij een aanzienlijk aantal muizen die met LDLR/P-407 werden behandeld tussen 6 en 12 weken na de behandeling met LDLR/P-407 trad een plotselinge dood op bij een aanzienlijk aantal muizen die met LDLR/P-407 werden behandeld (Figuur 3G). Deze resultaten duiden op cardio-metabolisch HFpEF, wat de effectiviteit van dit protocol en experimenteel ontwerp bevestigt. Hyperlipidemie werd opgemerkt bij muizen die na 4 en 8 weken werden behandeld met LDLR/P407, zoals blijkt uit verhoogd totaal cholesterol, triglyceriden, lipoproteïne met zeer lage dichtheid (VLDL), lipoproteïne met lage dichtheid (LDL) cholesterol en normale lipoproteïne-cholesterolspiegels met hoge dichtheid, wat onze bevindingen van hyperlipidemie bevestigt (Figuur 3H).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66442/66442fig01.jpg"> Figuur 1: Plasmidekaart voor AAV9-cTnT-LDLR. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66442/66442fig01large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66442/66442fig02v2.jpg"> Figuur 2: Injectieprocedures. (A) Representatief beeld van de intraveneuze (i.v.) staartaderinjectie van AAV9-cTnT-LDLR in WT-muis op de achtergrond van de 129J-stam. (B) Illustratie van intraperitoneale injectie van P-407 in WT-muis op een achtergrond van 129J-stam die eerder is behandeld met een enkelvoudige i.v.-dosis AAV9-cTnT-LDLR. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66442/66442fig02largev2.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66442/66442fig03.jpg"> Figuur 3: Cardio-metabole HFpEF. (A-E) Echocardiografieparameters die wijzen op hartfalen met behouden ejectiefractie (HFpEF) na 4 (n = 17) en 8 weken (n = 11) LDLR/P-407-behandeling in vergelijking met onbehandelde muizen (n = 15). Dit wordt bewezen door een behouden ejectiefractie, verlengde isovolumische relaxatietijd (IVRT), verhoogde E/E' en verminderde E/A, allemaal indicatoren van diastolische disfunctie. (F) Druk-volume lusacquisitie en analyses toonden een verhoogde end-diastolische druk-volume relatie (EDPVR) helling aan na 8 weken behandeling. (G) Plotselinge dood trad op tussen 6 en 12 weken na behandeling met LDLR/P-407. (H) Een lipidenpanel ondersteunde de bevindingen van hyperlipidemie bij muizen behandeld met LDLR/P407 na 4 (n = 4) en 8 weken (n = 3), zoals blijkt uit verhoogd totaal cholesterol, triglyceriden, lipoproteïne met zeer lage dichtheid (VLDL), lipoproteïne met lage dichtheid (LDL) cholesterol en normale lipoproteïne-cholesterolwaarden met hoge dichtheid in vergelijking met onbehandelde muizen (n = 5). De gegevens worden weergegeven als gemiddelde ± SD. *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001, ****P < 0,0001. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66442/66442fig03large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Author Spotlight: Exploring the Relationship Between Lipotoxicity and HFpEF at JoVE.com

Dit protocol presenteert een gedetailleerde benadering voor het repliceren van een muizenmodel van door hyperlipidemie geïnduceerd hartfalen met behouden ejectiefractie (HFpEF). Het ontwerp combineert de toediening van adeno-geassocieerd virus, 9-cardiaal troponine, T-lipoproteïnereceptor met lage dichtheid (AAV9-cTnT-LDLR) en poloxamer-407 (P-407).

The pathophysiology of heart failure with preserved ejection fraction (HFpEF) driven by lipotoxicity is incompletely understood. Given the urgent need for ...

Ons onderzoek is gericht op het onderzoeken van hartfalen met behouden ejectiefractie, bekend als HFpEF, waarbij specifiek de effecten van lipotoxiciteit worden onderzocht. We proberen de ingewikkelde relatie tussen metabool syndroom en lipotoxiciteit bij het stimuleren van HFpEF-progressie op te helderen en de onderliggende mechanismen bloot te leggen die HFpEF-pathofysiologie aansturen met behulp van dit experimentele muizenmodel. Ondanks de stijgende prevalentie en beperkte behandelingsopties voor HFpEF, blijven de pathofysiologische mechanismen die voornamelijk verband houden met het metabool syndroom slecht begrepen.Dit model biedt een unieke kans om deze kloof te overbruggen en mogelijk nieuwe therapieën voor HFpEF te ontwikkelen. Het belangrijkste voordeel van ons model is het vermogen om significante verkeerde behandeling van lipiden na te bootsen die is waargenomen bij HFpEF-patiënten. Dit muismodel biedt waardevolle inzichten in de pathofysiologie van HFpEF, met name het hartmetabolisme.Onze bevindingen onderstrepen het belang van verkeerde behandeling van vetzuren en cholesterol bij cardiometabole HFpEF. Dit model laat perfect zien hoe vetzuurdeprivatie de stofwisseling op verschillende niveaus verstoort. Het biedt onderzoekers potentiële mogelijkheden om nieuwe valkuilen voor HFpEF-patiënten te ontdekken.Hier in het Shahada-laboratorium zullen we ons concentreren op het vertalen van dit model naar grote dieren. We zullen vragen onderzoeken met betrekking tot de pathogenese, plotselinge dood en mogelijke therapeutische interventies gericht op lipotoxiciteit, ontsteking en cardiale remodellering.