Name: Author Spotlight: Advancing Real-Time cAMP Detection in Cells Using cADDis Biosensor
Uploaded: 2024-03-22T13:50:00
Description: Read this Scientific Article Protocol about Author Spotlight: Advancing Real-Time cAMP Detection in Cells Using cADDis Biosensor at JoVE.com

تم دعم هذه الدراسة من قبل المعهد الوطني للقلب والرئة والدم (NHLBI) (HL169522).

يتم سرد تفاصيل جميع الكواشف والمعدات المستخدمة للدراسة في جدول المواد.
1. مقياس الطيف الضوئي لقراءة اللوحة عالي الإنتاجية
<ol><li>بذر خلايا HEK-293 باستخدام ناقل cADDis BacMam في صفيحة 96 بئرا (اليوم 1)<ol><li>انقسام وإصابة الخلايا في غطاء فيروسي.<ol><li>وسائط HEK الدافئة (?...

cAMP Analysis with cADDis: Single-Cell to High-Throughput Screening

<ol>
	<li>Krishna, G., Weiss, B., Brodie, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple,+sensitive+method+for+the+assay+of+adenyl+cyclase.">A simple, sensitive method for the assay of adenyl cyclase.</a> J Pharmacol Exp Ther. 163 (2), 379-385 (1968).</li><li>Post, S. R., Ostrom, R. S., Insel, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemical+methods+for+detection+and+measurement+of+cyclic+amp+and+adenylyl+cyclase+activity.">Biochemical methods for detection and measurement of cyclic amp and adenylyl cyclase activity.</a> Methods Mol Biol. 126, 363-374 (2000).</li><li>Li, I. T., Pham, E., Truong, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+biosensors+based+on+the+principle+of+fluorescence+resonance+energy+transfer+for+monitoring+cellular+dynamics.">Protein biosensors based on the principle of fluorescence resonance energy transfer for monitoring cellular dynamics.</a> Biotechnol Lett. 28 (24), 1971-1982 (2006).</li><li>Deal, J., Pleshinger, D. J., Johnson, S. C., Leavesley, S. J., Rich, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Milestones+in+the+development+and+implementation+of+fret-based+sensors+of+intracellular+signals:+A+biological+perspective+of+the+history+of+fret.">Milestones in the development and implementation of fret-based sensors of intracellular signals: A biological perspective of the history of fret.</a> Cell Signal. 75, 109769 (2020).</li><li>Leavesley, S. J., Rich, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overcoming+limitations+of+fret+measurements.">Overcoming limitations of fret measurements.</a> Cytometry A. 89 (4), 325-327 (2016).</li><li>Zacharias, D. A., Violin, J. D., Newton, A. C., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Partitioning+of+lipid-modified+monomeric+GFPS+into+membrane+microdomains+of+live+cells.">Partitioning of lipid-modified monomeric GFPS into membrane microdomains of live cells.</a> Science. 296 (5569), 913-916 (2002).</li><li>Agarwal, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compartmentalized+cAMP+signaling+associated+with+lipid+raft+and+non-raft+membrane+domains+in+adult+ventricular+myocytes.">Compartmentalized cAMP signaling associated with lipid raft and non-raft membrane domains in adult ventricular myocytes.</a> Front Pharmacol. 9, 332 (2018).</li><li>Tewson, P. H., Martinka, S., Shaner, N. C., Hughes, T. E., Quinn, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+dag+and+cAMP+sensors+optimized+for+live-cell+assays+in+automated+laboratories.">New dag and cAMP sensors optimized for live-cell assays in automated laboratories.</a> J Biomol Screen. 21 (3), 298-305 (2016).</li><li>Tewson, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assay+for+detecting+Galphai-mediated+decreases+in+cAMP+in+living+cells.">Assay for detecting Galphai-mediated decreases in cAMP in living cells.</a> SLAS Discov. 23 (9), 898-906 (2018).</li><li>Nunez, F. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucocorticoids+rapidly+activate+cAMP+production+via+g(alphas)+to+initiate+non-genomic+signaling+that+contributes+to+one-third+of+their+canonical+genomic+effects.">Glucocorticoids rapidly activate cAMP production via g(alphas) to initiate non-genomic signaling that contributes to one-third of their canonical genomic effects.</a> FASEB J. 34 (2), 2882-2895 (2020).</li><li>Condreay, J. P., Witherspoon, S. M., Clay, W. C., Kost, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transient+and+stable+gene+expression+in+mammalian+cells+transduced+with+a+recombinant+baculovirus+vector.">Transient and stable gene expression in mammalian cells transduced with a recombinant baculovirus vector.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 96 (1), 127-132 (1999).</li><li>Insel, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=G+protein-coupled+receptor+(GPCR)+expression+in+native+cells:+&amp;#34;Novel&amp;#34;+endogpcrs+as+physiologic+regulators+and+therapeutic+targets.">G protein-coupled receptor (GPCR) expression in native cells: &amp;#34;Novel&amp;#34; endogpcrs as physiologic regulators and therapeutic targets.</a> Mol Pharmacol. 88 (1), 181-187 (2015).</li><li>Nunez, F. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agonist-specific+desensitization+of+PGE(2)-stimulated+cAMP+signaling+due+to+upregulated+phosphodiesterase+expression+in+human+lung+fibroblasts.">Agonist-specific desensitization of PGE(2)-stimulated cAMP signaling due to upregulated phosphodiesterase expression in human lung fibroblasts.</a> Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol. 393 (2), 843-856 (2020).</li><li>Ojiaku, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transforming+growth+factor-beta1+decreases+beta(2)-agonist-induced+relaxation+in+human+airway+smooth+muscle.">Transforming growth factor-beta1 decreases beta(2)-agonist-induced relaxation in human airway smooth muscle.</a> Am J Respir Cell Mol Biol. 61 (2), 209-218 (2019).</li><li>Zuo, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cigarette+smoke+up-regulates+pde3+and+pde4+to+decrease+cAMP+in+airway+cells.">Cigarette smoke up-regulates pde3 and pde4 to decrease cAMP in airway cells.</a> Br J Pharmacol. 175 (14), 2988-3006 (2018).</li><li>Cullum, S. A., Veprintsev, D. B., Hill, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetic+analysis+of+endogenous+beta(2)+-adrenoceptor-mediated+cAMP+glosensor+responses+in+hek293+cells.">Kinetic analysis of endogenous beta(2) -adrenoceptor-mediated cAMP glosensor responses in hek293 cells.</a> Br J Pharmacol. 180 (2), 1304-1315 (2023).</li><li>Liu, X., Sun, S. Q., Ostrom, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibrotic+lung+fibroblasts+show+blunted+inhibition+by+cAMP+due+to+deficient+cAMP+response+element-binding+protein+phosphorylation.">Fibrotic lung fibroblasts show blunted inhibition by cAMP due to deficient cAMP response element-binding protein phosphorylation.</a> J Pharmacol Exp Ther. 315 (2), 678-687 (2005).</li><li>Bogard, A. S., Birg, A. V., Ostrom, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-raft+adenylyl+cyclase+2+defines+a+cAMP+signaling+compartment+that+selectively+regulates+il-6+expression+in+airway+smooth+muscle+cells:+Differential+regulation+of+gene+expression+by+ac+isoforms.">Non-raft adenylyl cyclase 2 defines a cAMP signaling compartment that selectively regulates il-6 expression in airway smooth muscle cells: Differential regulation of gene expression by ac isoforms.</a> Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol. 387 (4), 329-339 (2014).</li><li>Schmidt, M., Cattani-Cavalieri, I., Nunez, F. J., Ostrom, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphodiesterase+isoforms+and+cAMP+compartments+in+the+development+of+new+therapies+for+obstructive+pulmonary+diseases.">Phosphodiesterase isoforms and cAMP compartments in the development of new therapies for obstructive pulmonary diseases.</a> Curr Opin Pharmacol. 51, 34-42 (2020).</li><li>Ostrom, K. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiological+roles+of+mammalian+transmembrane+adenylyl+cyclase+isoforms.">Physiological roles of mammalian transmembrane adenylyl cyclase isoforms.</a> Physiol Rev. 102 (2), 815-857 (2022).</li><li>Auld, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+chemical+libraries+for+luciferase+inhibitory+activity.">Characterization of chemical libraries for luciferase inhibitory activity.</a> J Med Chem. 51 (8), 2372-2386 (2008).</li><li>De Logu, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Schwann+cell+endosome+CGRP+signals+elicit+periorbital+mechanical+allodynia+in+mice.">Schwann cell endosome CGRP signals elicit periorbital mechanical allodynia in mice.</a> Nat Commun. 13 (1), 646 (2022).</li><li>Wray, N. H., Schappi, J. M., Singh, H., Senese, N. B., Rasenick, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NMDAR-independent,+cAMP-dependent+antidepressant+actions+of+ketamine.">NMDAR-independent, cAMP-dependent antidepressant actions of ketamine.</a> Mol Psychiatry. 24 (12), 1833-1843 (2019).</li><li>Thornquist, S. C., Pitsch, M. J., Auth, C. S., Crickmore, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemical+evidence+accumulates+across+neurons+to+drive+a+network-level+eruption.">Biochemical evidence accumulates across neurons to drive a network-level eruption.</a> Mol Cell. 81 (4), 675-690 (2021).</li><li>Zhang, S. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypothalamic+dopamine+neurons+motivate+mating+through+persistent+cAMP+signalling.">Hypothalamic dopamine neurons motivate mating through persistent cAMP signalling.</a> Nature. 597 (7875), 245-249 (2021).</li><li>Lutas, A., Fernando, K., Zhang, S. X., Sambangi, A., Andermann, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=History-dependent+dopamine+release+increases+cAMP+levels+in+most+basal+amygdala+glutamatergic+neurons+to+control+learning.">History-dependent dopamine release increases cAMP levels in most basal amygdala glutamatergic neurons to control learning.</a> Cell Rep. 38 (4), 110297 (2022).</li><li>Zhang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Area+postrema+cell+types+that+mediate+nausea-associated+behaviors.">Area postrema cell types that mediate nausea-associated behaviors.</a> Neuron. 109 (3), 461-472 (2021).</li></ol>

يعد القياس الدقيق والحساس ل cAMP أمرا بالغ الأهمية لفهم دوره في العمليات الخلوية المختلفة ولدراسة نشاط مسارات الإشارات المعتمدة على cAMP. هناك العديد من الطرق المستخدمة بشكل شائع لقياس مستويات cAMP ، بما في ذلك ELISA ، والمقايسة المناعية الإشعاعية ، وأجهزة الاستشعار الحيوية FRET ، ومقايسة GloSensor cAMP<s...

الأدينوزين 3 ′ ، 5 ′ أحادي الفوسفات الدوري ، cAMP ، يلعب دورا مركزيا في الاتصالات الخلوية وتنسيق العمليات الفسيولوجية المختلفة. يعمل cAMP كرسول ثان ، ينقل الإشارات الخارجية من الهرمونات أو الناقلات العصبية أو الجزيئات الأخرى خارج الخلية لبدء سلسلة من الأحداث داخل الخلايا1. علاوة على ذلك ، يشارك cAMP بشكل معقد في مسارات الإشارات المختلفة ، بما في ذلك تلك المرتبطة بمستقبلات البروتين G (GPCRs) وسيكلاز الأدينيل. يعد فهم دور cAMP في الإشارات الخلوية أمرا أساسيا لكشف الآليات المعقدة التي تكمن وراء الوظائف الخلوية الطبيعية وتطوير العلاجات المحتملة لمجموعة واسعة من الحالات الطبية2.
في الماضي ، تم استخدام طرق مختلفة لقياس cAMP بشكل مباشر أو غير مباشر. وشمل ذلك وضع العلامات الإشعاعية لتجمعات ATP الخلوية متبوعة بتنقية العمود ، HPLC ، المقايسات المناعية الإشعاعية ، والمقايسات المناعية المرتبطة بالإنزيم 1,2. هذه المقايسات القديمة محدودة بحقيقة أنها مقاييس نقطة النهاية ، وتتطلب عددا كبيرا من العينات لبناء استجابات تعتمد على الوقت. في الآونة الأخيرة ، تم تطوير مستشعرات نقل الطاقة بالرنين الفلوري (FRET) لإنشاء مقايسات في الخلايا الحية ، وإنتاج بيانات ديناميكية في الوقت الفعلي والسماح باستهداف أجهزة الاستشعار في مواقع تحت خلوية مختلفة3. تستفيد FRET من اثنين من الفلوروفورات ، ومانح فلوري واحد ، ومستقبل فلوري واحد عندما يكون على مقربة ، فإن الفلوروفور المتقبل سيكون متحمسا لناتج الفلورسنت المانح. الفلوروفوران الأكثر استخداما هما بروتين الفلورسنت السماوي (CFP) والبروتين الفلوري الأصفر (YFP) نظرا لأن لهما خصائص إثارة وانبعاث متوافقة. بالإضافة إلى CFP و YFP ، يشيع استخدام البروتين الفلوري الأخضر (GFP) والبروتين الفلوري الأحمر (RFP) لأجهزة الاستشعار الحيوية FRET. تعمل المستشعرات الحيوية cAMP FRET من خلال وجود متبرع ومتقبل على طرفي نقيض من بروتين ربط Epac2 cAMP. يغير ربط cAMP تأكيد Epac ويزيد المسافة بين الفلوروفورات المانحة والمستقبلة 3,4. يتم الكشف عن هذا التغيير المطابق عن طريق فقدان FRET ، أي إثارة الفلوروفور المستقبلة بواسطة الطاقة المنقولة من قطرات الفلوروفور المانحة3. في حين أنها عملية تبدو بسيطة ، إلا أن هناك وفرة من القيود والمشكلات المتعلقة بالمستشعر الحيوي FRET لأبحاث cAMP5. أحدها هو اختيار البروتينات الفلورية ، على سبيل المثال ، GFP ، والتي يمكن أن تخفي بشكل طبيعي ، وبالتالي تقليل الحساسية6. تم استهداف أجهزة الاستشعار الحيوية cAMP القائمة على FRET إلى مجالات دقيقةمحددة 7 ، ولكن قد تكون هناك قيود بسبب الحجم الكبير للبناء مع اثنين من الفلوروفورات6. وثمة مسألة هامة أخرى تتمثل في انخفاض نسبة الإشارة إلى الضوضاء لإشارات FRET الناتجة عن التداخل بين إثارة وانبعاث الفلوروفور ، مما يؤدي إلى ارتفاع وتيرة أخذ العينات وتعقيد تحليل النتائج 4,5.
في الآونة الأخيرة ، قام المستشعر الحيوي الجديد (كاشف فرق cAMP في الموقع) ، cADDis بحل هذه القيود وغيرها عندما يتعلق الأمر بدراسة تنظيم إشارات cAMP8. أحد التحسينات المهمة هو الاعتماد على فلوروفور واحد. وهذا يسمح بإشارة سريعة وفعالة مع نطاق ديناميكي أوسع ونسبة إشارة إلى ضوضاء عالية. نتيجة لذلك ، يمكن أن يكون هناك المزيد من الدقة نظرا لوجود نطاق أقل اتساعا من الأطوال الموجية للتمشيط منخلال 8. مثل مجسات FRET ، تم استهداف المستشعر الحيوي للمواقع تحت الخلوية ، مما يسمح بالبحث في نظرية التقسيم والاستكشاف في الطوافات الدهنية وغير الطوافات ، وغيرها من المجالات تحت الخلوية9. ولعل الأهم من ذلك هو مدى ملاءمة جهاز استشعار حيوي فلوروفور واحد للفحص عالي الإنتاجية ، مما أدى إلى تحسين الحساسية والتكاثر على أجهزة الاستشعار الحيوية القائمة على FRET. يتم تعبئة المستشعر الحيوي في ناقل BacMam لسهولة نقل مجموعة واسعة من أنواع الخلايا والتحكم الدقيق في تعبير البروتين.
يمكن أن يكون التحكم في التعبير عبر ناقل BacMam مفيدا بشكل خاص في المقايسات باستخدام تقويم GPCR من أنواع مختلفة لتسهيل تفسير البيانات من الدراسات على. علاوة على ذلك ، فإن التحكم في تعبير المستقبلات أمر بالغ الأهمية لقياس الدرجات المختلفة لفعالية الدواء (على سبيل المثال ، الناهضات العكسية والناهضات الجزئية) ، والمستويات المنخفضة من تعبير المستقبلات مفيدة لتقليد المستويات المنخفضة الموجودة في الأنسجة الحيوانية. BacMam هو ناقل للفيروس البقعي تم تعديله لتحويل خلايا الثدييات مثل مزارع الخلايا الأولية وخطوط HEK-29310. تسمح العلامات المهيمنة القابلة للاختيار ل BacMam بتوفير مزيد من الاستقرار مقارنة بعدوى البلازميد التقليدية11. تسمح هذه المروجين الانتقائيين بتوصيل الجينات والتعبير عنها بشكل أكثر كفاءة. بالإضافة إلى ذلك ، فإن إضافة الترايكوستاتين A (مثبط هيستون ديسيتيلاز) يعزز مستويات البروتين المراسل11. يمكن التحكم في مستويات التعبير عن طريق عيار فيروس BacMam المستخدم ويجب تحسينه لكل نوع خلية. في حالة هذا المستشعر الحيوي ، يرتبط بروتين الفلورسنت الأحمر أو الأخضر ب Epac في N- و C-termini. عندما يرتبط cAMP ، يؤدي التغيير المطابق في المستشعر الحيوي إلى تحريك الأحماض الأمينية المجاورة للبروتين الفلوري. مثل هذا التحول ينقل الامتصاص من الحالة الأنيونية إلى الحالة المحايدة عند 400 نانومتر ، وبالتالي يقلل من التألق.
هناك 90-120 GPCRs يتم التعبير عنها في خلية واحدة تستجيب لمجموعة واسعة من الإشارات العصبيةالعضلية 12. لذلك ، يمكن افتراض أن ما لا يقل عن عدة عشرات من GPCRs لكل خلية يمكن أن تحفز أو تمنع cAMP من خلال اقتران Gs أو Gi ، على التوالي. بينما كان هناك تقدم في مراقبة هذا الرسول الثاني في الوقت الفعلي ، مثل FRET ، هناك حاجة إلى طرق أكثر كفاءة. يتم عرض منهجية مراقبة توليف وتدهور إشارات cAMP باستخدام cADDis في الوقت الفعلي هنا. يمكن مراقبة التغير في التألق في الوقت الفعلي باستخدام قارئ لوحة مضان للمقايسات عالية الإنتاجية أو باستخدام مجهر الفلورسنت لفحوصات الخلية الواحدة. هذه الطرق مفيدة لمجموعة واسعة من الأسئلة البيولوجية المتعلقة بإشارات GPCR عبر cAMP.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>96-well plate (clear)</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>21-377-203</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm dish</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>627870</td>
			<td>Cell culture dishes with glass bottom</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plate&#160;</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3904</td>
			<td>Black with clear flat bottom</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic (100x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15240062</td>
			<td>For HEK and HASM media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BZ-X fluorescence microscope</td>
			<td>Keyence</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride (IM)</td>
			<td>Quality Biological Inc</td>
			<td>E506</td>
			<td>For HASM media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tube (15 mL)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>339651</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM (1x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11965092</td>
			<td>HEK media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS with Mg2+ and Ca2+&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14040-133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS without Mg2+ and Ca2+</td>
			<td>Corning</td>
			<td>14040-133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>R&#38;D systems</td>
			<td>S11195</td>
			<td>For HEK and HASM media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forskolin</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>344270</td>
			<td>Drug</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Green Down cADDis cAMP Assay Kit</td>
			<td>Montana Molecular</td>
			<td>#D0200G</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ham&#39;s F-12K&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21127022</td>
			<td>For HASM media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES (1M)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630080</td>
			<td>For HASM media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoproterenol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I6504</td>
			<td>Drug</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine 200 mM (100x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25030-081</td>
			<td>For HASM media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tube (2 mL)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22363352</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primocin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>ant-pm-1</td>
			<td>Antibiotic for HASM media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAse away</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>700511</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S2770</td>
			<td>For HASM media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrmax M5 plate reader</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trichostatin A</td>
			<td>TCI America</td>
			<td>T2477</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200-056</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

real-time camp dynamics in live cells using the fluorescent camp difference detector in situ

كاشف الفرق cAMP في الموقع (cADDis) هو مستشعر حيوي جديد يسمح بالقياس المستمر لمستويات cAMP في الخلايا الحية. يتم إنشاء المستشعر الحيوي من بروتين فلوري دائري مرتبط بمنطقة المفصلات في Epac2. يؤدي هذا إلى إنشاء مستشعر حيوي فلوروفور واحد يعرض إما زيادة أو نقصان التألق عند ربط cAMP. يوجد المستشعر الحيوي في إصدارات تصاعدية حمراء وخضراء ، بالإضافة إلى إصدارات خضراء هابطة ، والعديد من الإصدارات الحمراء والخضراء التي تستهدف المواقع دون الخلوية. لتوضيح فعالية المستشعر الحيوي ، تم استخدام النسخة الخضراء الهابطة ، والتي تتناقص في التألق عند ربط cAMP. تم عرض بروتوكولين يستخدمان هذا المستشعر: أحدهما يستخدم مقياس الطيف الضوئي لقراءة الألواح ذات 96 بئرا المتوافق مع الفحص عالي الإنتاجية والآخر يستخدم التصوير أحادي الخلية على مجهر الفلورسنت. على قارئ اللوحة ، تم تحفيز خلايا HEK-293 المزروعة في 96 لوحة جيدة باستخدام 10 ميكرومتر فورسكولين أو 10 نانومتر إيزوبروتيرينول ، مما أدى إلى انخفاض سريع وكبير في التألق في النسخة الخضراء الهابطة. تم استخدام المستشعر الحيوي لقياس مستويات cAMP في خلايا العضلات الملساء في مجرى الهواء البشري (HASM) التي تتم مراقبتها تحت مجهر الفلورسنت. أظهر المستشعر الحيوي الأخضر الهابط استجابات مماثلة لمجموعات الخلايا عند تحفيزه باستخدام فورسكولين أو إيزوبروتيرينول. يسمح هذا الفحص أحادي الخلية بتصور موقع المستشعر الحيوي بتكبير 20x و 40x. وبالتالي ، فإن هذا المستشعر الحيوي cAMP حساس ومرن ، مما يسمح بقياس cAMP في الوقت الفعلي في كل من الخلايا الخالدة والأولية ، ومع الخلايا المفردة أو مجموعات الخلايا. هذه السمات تجعل cADDis أداة قيمة لدراسة ديناميكيات إشارات cAMP في الخلايا الحية.

Adenosine 3&#8242;,5&#8242;-cyclic monophosphate, cAMP, plays a central role in cellular communication and the coordination of various physiological processes. cAMP acts as a second messenger, relaying external signals from hormones, neurotransmitters, or other extracellular molecules to initiate a cascade of intracellular events1. Moreover, cAMP is intricately involved in various signaling pathways, including those associated with G-protein-coupled receptors (GPCRs) and adenylyl cyclases. Understanding the role of cAMP in cellular signaling is fundamental to unraveling the complex mechanisms that underlie normal cellular functions and the development of potential therapies for a wide range of medical conditions2.
In the past, various methods have been employed to measure cAMP directly or indirectly. These included radiolabeling of cellular ATP pools followed by column purification, HPLC, radioimmunoassays, and enzyme-linked immunoassays1,2. These legacy assays are limited by the fact that they are end-point measures, requiring a large number of samples to construct time-dependent responses. More recently, Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) sensors were developed to create assays in living cells, producing real-time, dynamic data and allowing sensors to be targeted in different subcellular locations3. FRET leverages two fluorophores, one fluorescent donor, and one fluorescent acceptor that when in close proximity, the acceptor fluorophore will be excited by the donor fluorescent output. The two fluorophores most used are cyan fluorescent protein (CFP) and yellow fluorescent protein (YFP) since these have compatible excitation and emission properties. In addition to CFP and YFP, the utilization of the green fluorescent protein (GFP) and red fluorescent protein (RFP) is commonly used for FRET biosensors. cAMP FRET biosensors operate by having a donor and acceptor on opposite ends of the Epac2 cAMP binding protein. cAMP binding alters the confirmation of Epac and increases the distance between donor and acceptor fluorophores3,4. This conformational change is detected by a loss of FRET, that is, the excitation of the acceptor fluorophore by energy transferred from the donor fluorophore drops3. While a seemingly simple process, there are an abundance of limitations and issues with the FRET biosensor for cAMP research5. One of which is the selection of fluorescent proteins, for example, GFP, which can dimerize naturally, thus reducing sensitivity6. FRET-based cAMP biosensors have been targeted to specific microdomains7, but there may be limitations owing to the large size of a construct with two fluorophores6. Another significant issue is the low signal-to-noise ratio of FRET signals resulting from the overlap between excitation and emission of the fluorophore, resulting in high sampling frequency and complicating analysis of the results4,5.
Most recently, the novel biosensor (cAMP Difference Detector In Situ), cADDis has solved these and other limitations when it comes to studying the regulation of cAMP signaling8. One important improvement is the dependence on a single fluorophore. This allows for a rapid and efficient signal with a wider dynamic range and a high signal-to-noise ratio. As a result, there can be more accuracy as there is a less broad scope of wavelengths to comb through8. Like FRET probes, the biosensor has been targeted to subcellular locations, allowing research into the compartmentation theory and exploration in lipid rafts and non-rafts, and other subcellular domains9. Perhaps most important is the suitability of a single fluorophore biosensor for high-throughput screening, which has improved sensitivity and reproducibility over FRET-based biosensors. The biosensor is packaged into a BacMam vector for easy transduction of a wide array of cell types and precise control over protein expression.
Expression control via the BacMam vector can be particularly useful in assays using GPCR orthologs from different species to facilitate the interpretation of data from animal studies. Furthermore, control over receptor expression is critical for measuring the different degrees of drug efficacy (e.g., inverse agonists and partial agonists), and low levels of receptor expression are useful to mimic the low levels found in animal tissue. BacMam is a baculovirus vector that has been modified to transduce mammalian cells such as primary cell cultures and HEK-293 lines10. Dominant selectable markers allow for BacMam to provide more stability over traditional plasmid infections11. Such selective promoters allow for more efficient gene delivery and expression. In addition, adding trichostatin A (a histone deacetylase inhibitor) enhances the reporter protein levels11. Expression levels can be controlled via the titer of the BacMam virus used and should be optimized for each cell type. In the case of this biosensor, a red or green fluorescent protein is linked to the Epac at the N- and C-termini. When cAMP binds, a conformational change in the biosensor moves amino acids adjacent to the fluorescent protein. Such a shift moves the absorbance from the anionic state to the neutral state at 400 nm, thus decreasing the fluorescence.
There are 90-120 GPCRs expressed in a single cell that respond to a wide variety of neurohumoral signals12. Therefore, it can be hypothesized that at least several dozen GPCRs per cell can stimulate or inhibit cAMP through Gs or Gi coupling, respectively. While there has been progress in monitoring this second messenger in real-time, such as FRET, more efficient methods are needed. The methodology for monitoring the synthesis and degradation of cAMP signals using cADDis in real-time is presented here. The change in fluorescence can be monitored in real-time using a fluorescence plate reader for high throughput assays or using a fluorescent microscope for single-cell assays. These methods are useful for a wide array of biological questions regarding GPCR signaling via cAMP.

Author Spotlight: Advancing Real-Time cAMP Detection in Cells Using cADDis Biosensor

ديناميكيات cAMP في الوقت الفعلي في الخلايا الحية باستخدام كاشف فرق cAMP الفلوري في الموقع

أثبتت الدراسة الحالية صحة المستشعر الحيوي الخلوي في كل من قارئ الألواح ومقايسات المجهر. بمجرد أن تعبر الخلايا عن المستشعر الحيوي ، يتم تحفيزها إما باستخدام 10 ميكرومتر فورسكولين (منشط مباشر لأدينيل سيكلاز) ، أو 10 نانومتر إيزوبروتيرينول (ناهض عند ß1AR و ß2AR) ، أو مركبة (?...

Read this Scientific Article Protocol about Author Spotlight: Advancing Real-Time cAMP Detection in Cells Using cADDis Biosensor at JoVE.com

يوضح البروتوكول المقدم في هذه الدراسة فعالية كاشف الفرق cAMP في الموقع في قياس cAMP من خلال طريقتين. تستخدم إحدى الطرق مقياس الطيف الضوئي لقراءة الألواح ذات 96 بئرا مع خلايا HEK-293. توضح الطريقة الأخرى خلايا HASM الفردية تحت مجهر الفلورسنت.

cAMP Difference Detector In Situ (cADDis) is a novel biosensor that allows for the continuous measurement of cAMP levels in living cells. The biosensor is ...

نحن نخدم تنظيم مجالات KP الصغيرة لركوب الدراجات مع التركيز على توضيح كيفية تشكيل هذه المقصورات واستدامتها. نسعى للكشف عن المكونات الرئيسية التي تمكن الخلايا من تمييز الإشارات المكانية داخل هذه المجالات ، واستكشاف الاختلاف في تفسيرها ، وكيف يتم تغيير هذه الميزات في أمراض مثل الربو ومرض الانسداد الرئوي المزمن. إن إصابة الخلايا الأولية باستخدام ناقل بيكمان أمر صعب.لهذا ، يجب تحسين الحالة لنوع الخلايا الفردية من أجل تحقيق تعبير كاف عن المستشعر الحيوي. يسمح هذا البروتوكول بالكشف والمراقبة في الوقت الفعلي ، بدءا من دقائق إلى ساعات ، وقياس ديناميكيات سيكلو كامبو داخل الخلايا الحية. يتميز هذا المستشعر الحيوي بخصوصية عالية للالتزام بمعسكر cyclo P.وبالتالي ، فإن الإشارات الناتجة عن هذا المقال ترتبط ارتباطا مباشرا بمستويات P الدورية ، مما يقلل بشكل كبير من التداخل المحتمل من المكونات الخلوية الأخرى ، ويوفر نتائج موثوقة.