Name: Pleins feux sur l’auteur : Isolement efficace des virus adéno-associés pour les applications précliniques
Uploaded: 2024-02-09T14:30:00
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La composition des solutions et des tampons utilisés dans ce protocole est fournie dans le tableau 1.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Solution</td>
			<td colspan="2">Composition</td>
		</tr><tr><td rowspan="4">Tampon de lyse AAV</td>
			<td colspan="2">1,2 mL de solution de NaCl 5 M</td>
		</tr><tr><td colspan="2">2 mL de solution de 1 M de Tris-HCl pH 8,5</td>
		</tr><tr><td colspan="2">80 μL de solutio...

Isolation AAV par centrifugation à double gradient de densité iodixanol

<ol>
	<li>Strauss, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Onasemnogene+abeparvovec+for+presymptomatic+infants+with+three+copies+of+SMN2+at+risk+for+spinal+muscular+atrophy:+the+Phase+III+SPR1NT+trial.">Onasemnogene abeparvovec for presymptomatic infants with three copies of SMN2 at risk for spinal muscular atrophy: the Phase III SPR1NT trial.</a> Nat Med. 28 (7), 1390-1397 (2022).</li><li>Fuller-Carter, P. I., Basiri, H., Harvey, A. R., Carvalho, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Focused+update+on+AAV-based+gene+therapy+clinical+trials+for+inherited+retinal+degeneration.">Focused update on AAV-based gene therapy clinical trials for inherited retinal degeneration.</a> BioDrugs. 34 (6), 763-781 (2020).</li><li>George, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiyear+factor+VIII+expression+after+AAV+gene+transfer+for+hemophilia+A.">Multiyear factor VIII expression after AAV gene transfer for hemophilia A.</a> N Engl J Med. 385 (21), 1961-1973 (2021).</li><li>Naso, M. F., Tomkowicz, B., Perry, W. L., Strohl, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adeno-Associated+Virus+(AAV)+as+a+vector+for+gene+therapy.">Adeno-Associated Virus (AAV) as a vector for gene therapy.</a> Biodrugs. 31 (4), 317-334 (2017).</li><li>Atchison, R. W., Casto, B. C., Hammon, W. M. c. 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M., Dib, P., Smith, J. K., Zolotukhin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Helper-free+production+of+laboratory+grade+AAV+and+purification+by+iodixanol+density+gradient+centrifugation.">Helper-free production of laboratory grade AAV and purification by iodixanol density gradient centrifugation.</a> Mol Ther - Methods Clin Dev. 10, 1-7 (2018).</li><li>Chan, C., Harris, K. K., Zolotukhin, S., Keeler, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rational+design+of+AAV-rh74,+AAV3B,+and+AAV8+with+limited+liver+targeting.">Rational design of AAV-rh74, AAV3B, and AAV8 with limited liver targeting.</a> Viruses. 15 (11), 2168 (2023).</li><li>Schmidt, O. W., Cooney, M. K., Foy, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adeno-associated+virus+in+adenovirus+type+3+conjunctivitis.">Adeno-associated virus in adenovirus type 3 conjunctivitis.</a> Infect Immun. 11 (6), 1362-1370 (1975).</li><li>Grimm, D., Kern, A., Rittner, K., Kleinschmidt, J. 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M., Weber, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expressing+transgenes+that+exceed+the+packaging+capacity+of+adeno-associated+virus+capsids.">Expressing transgenes that exceed the packaging capacity of adeno-associated virus capsids.</a> Hum Gene Ther Methods. 27 (1), 1-12 (2016).</li><li>Green, E. A., Hamaker, N. K., Lee, K. 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J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane-associated+heparan+sulfate+proteoglycan+is+a+receptor+for+adeno-associated+virus+type+2+virions.">Membrane-associated heparan sulfate proteoglycan is a receptor for adeno-associated virus type 2 virions.</a> J Virol. 72 (2), 1438-1445 (1998).</li><li>Wright, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+factors+that+contribute+to+recombinant+AAV2+particle+aggregation+and+methods+to+prevent+its+occurrence+during+vector+purification+and+formulation.">Identification of factors that contribute to recombinant AAV2 particle aggregation and methods to prevent its occurrence during vector purification and formulation.</a> Mol Ther. 12 (1), 171-178 (2005).</li><li>Gruntman, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stability+and+compatibility+of+recombinant+adeno-associated+virus+under+conditions+commonly+encountered+in+human+gene+therapy+trials.">Stability and compatibility of recombinant adeno-associated virus under conditions commonly encountered in human gene therapy trials.</a> Hum Gene Ther Methods. 26 (2), 71-76 (2015).</li><li>Srivastava, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rationale+and+strategies+for+the+development+of+safe+and+effective+optimized+AAV+vectors+for+human+gene+therapy.">Rationale and strategies for the development of safe and effective optimized AAV vectors for human gene therapy.</a> Mol Ther Nucleic Acids. 32, 949-959 (2023).</li><li>Mullard, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FDA+approves+first+gene+therapy+for+Duchenne+muscular+dystrophy,+despite+internal+objections.">FDA approves first gene therapy for Duchenne muscular dystrophy, despite internal objections.</a> Nat Rev Drug Discov. 22 (8), 610-610 (2023).</li><li>Center for Biologics Evaluation and Research. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Approved+Cellular+and+Gene+Therapy+Products.">Approved Cellular and Gene Therapy Products.</a> US Food Drug Adm. , (2023).</li><li>Kang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AAV+vectors+applied+to+the+treatment+of+CNS+disorders:+Clinical+status+and+challenges.">AAV vectors applied to the treatment of CNS disorders: Clinical status and challenges.</a> J Control Release Off J Control Release Soc. 355, 458-473 (2023).</li><li>De Wolf, D., Singh, K., Chuah, M. K., VandenDriessche, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hemophilia+gene+therapy:+The+end+of+the+beginning.">Hemophilia gene therapy: The end of the beginning.</a> Hum Gene Ther. 34 (17-18), 782-792 (2023).</li><li>Simons, E. J., Trapani, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+opportunities+and+challenges+of+gene+therapy+for+treatment+of+inherited+forms+of+vision+and+hearing+loss.">The opportunities and challenges of gene therapy for treatment of inherited forms of vision and hearing loss.</a> Hum Gene Ther. 34 (17-18), 808-820 (2023).</li></ol>

Le protocole de purification à double gradient de densité d’iodixanol est la méthode universelle car il est applicable à tous les variants mutants AAV, quelle que soit leur spécificité de récepteur. Les premières méthodes de purification des AAV reposaient sur la densité des particules et comprenaient la centrifugation isopycnique dans le CsCl et la centrifugation continue par gradient de densité du saccharose19. Plus tard, des approches spécifiques au sérotype ont été développé...

Les vecteurs viraux adéno-associés recombinants (rAAV) sont des outils largement utilisés pour le traitement des maladies génétiques, notamment l’amyotrophie spinale, la dystrophie rétinienne et l’hémophilie A 1,2,3. Les vecteurs rAAV sont conçus pour ne pas contenir de gènes viraux présents dans l’AAV4 de type sauvage, un petit virus icosaédrique sans enveloppe avec un génome linéaire monocaténaire de 4,7 kb. L’AAV a été découvert pour la première fois dans les années 1960 en tant que contaminant des préparations d’adénovirus5. Malgré sa petite taille de capside, qui limite la taille du transgène pouvant être emballé à un maximum de 4,9 kb hors RTI6, l’AAV est utile pour l’administration de transgènes car il est non pathogène chez l’homme, permet l’expression du transgène dans de nombreux types de cellules divisées et non divisées et a des effets immunogènes limités7.
En tant que membres du genre dependoparvovirus, la production de rAAV repose sur l’expression de gènes auxiliaires présents dans l’adénovirus ou le virus de l’herpès simplex8. Plusieurs stratégies de production de rAAV ont été développées, mais la production dans les cellules HEK293 transformées avec les gènes auxiliaires adénoviraux E1A/E1B est la méthode la plus établie utilisée aujourd’hui9. L’approche générale de la production de rAAV commence par la transfection de cellules HEK293 avec trois plasmides contenant le transgène dans des répétitions terminales inversées (ITR), des gènes AAV rep et cap , et des gènes adénoviraux auxiliaires supplémentaires, respectivement. Soixante-douze heures après la transfection, les cellules sont récoltées et traitées pour purifier le rAAV contenant le transgène.
Dans le développement de nouveaux vecteurs rAAV à des fins thérapeutiques, l’un des principaux objectifs est de produire des vecteurs avec une efficacité de transduction accrue. Une augmentation de l’efficacité de transduction des cellules cibles signifierait une diminution de la dose clinique nécessaire de rAAV, diminuant ainsi la probabilité d’effets immunogènes indésirables allant de la neutralisation médiée par les anticorps aux toxicités aiguës10,11. Pour améliorer l’efficacité de la transduction des vecteurs rAAV, des modifications peuvent être apportées au génome emballé ou à la capside. Les méthodes viables pour ajuster l’efficacité de la transduction via la conception de génomes emballés comprennent l’incorporation de promoteurs forts et spécifiques aux tissus, la sélection réfléchie des éléments de traitement de l’ARNm et l’optimisation de la séquence codante pour améliorer l’efficacité de la traduction12. Les modifications de la capside sont effectuées dans le but d’augmenter le tropisme pour les types de cellules humaines cibles. Les efforts visant à développer de nouvelles capsides vectorielles de livraison de transgènes rAAV sont généralement caractérisés par une focalisation sur la conception rationnelle de capsides AAV avec des mutations spécifiques ciblant des récepteurs cellulaires spécifiques ou sur l’évolution dirigée pour identifier des capsides avec tropisme pour des types cellulaires spécifiques à partir de bibliothèques de capsides combinatoires de haute complexité sans cibler un récepteur spécifique (bien que certains groupes combinent ces approches)13, 14,15. Dans l’approche d’évolution dirigée, les banques de capsides combinatoires sont construites à l’aide d’un squelette de sérotype particulier avec des régions variables mutées sur la capside extérieure16. Les banques de capsides combinatoires sont souvent construites à partir de sérotypes AAV non originaires de l’homme, ce qui diminue le risque d’immunité préexistante lors de l’utilisation clinique10. Par conséquent, les méthodes de purification qui peuvent être appliquées à n’importe quel sérotype sont idéales pour éliminer le besoin d’optimisation spécifique au sérotype pour les sérotypes les moins couramment utilisés servant de squelette à ces bibliothèques.
La centrifugation par gradient de densité d’iodixanol est utilisée pour purifier des titres élevés de rAAV à forte infectiosité17. Dans ce protocole, le rAAV est produit en culture cellulaire en suspension pour réduire la quantité de travail nécessaire pour produire de gros titres d’AAV. Une étape de centrifugation est également incluse pour éliminer le lysat cellulaire afin de réduire la présence de protéines contaminantes et de diminuer le risque de précipitation virale. Ce protocole est une méthode rentable pour produire des préparations de rAAV de haute pureté adaptées à un usage préclinique.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>5810 R benchtop centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22625501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-channel peristaltic pump&#160;</td>
			<td>Watson-Marlow</td>
			<td>020.3708.00A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automated cell counter&#160;</td>
			<td>NanoEntek</td>
			<td>EVE-MC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Avanti J-E high-speed centrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>369001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzonase</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>88701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biological safety cabinet</td>
			<td>Labconco</td>
			<td>322491101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 incubator with shaker&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Set at 8% CO2 and 37 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical centrifuge tubes</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>339652</td>
			<td>50 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical centrifuge tubes</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>339650</td>
			<td>15 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable micro-pipets</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>21-164-2G</td>
			<td>Capillaries</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s phosphate buffered saline without CaCl2 and MgCl2&#160; (DPBS) (10x)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D1408</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECLIPSE Ts2R-FL inverted microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Expi293 Expression Medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A1435101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Expi293F cells</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A14527</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter tips</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1126-7810</td>
			<td>1000 &#181;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter tips</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1120-8810</td>
			<td>200 &#181;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter tips</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1120-1810</td>
			<td>20 &#181;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter tips</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1121-3810</td>
			<td>10 &#181;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hypodermic needles</td>
			<td>Tyco Healthcare</td>
			<td>820112</td>
			<td>20 GA x 1-1/2 A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice bucket with lid</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10146-184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>JS-5.3 rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>368690</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride solution (1 M)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>M1028-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metal stand and clamp&#160;</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>05-769-6Q</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22600028</td>
			<td>1.5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle nose pliers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optima XE-90 ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A94471</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM I Reduced-Serum Medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31985062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OptiPrep density gradient media (iodixanol)</td>
			<td>Serumwerk</td>
			<td>AXS-1114542</td>
			<td>60% iodixanol solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P1000 Pipet</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F144059M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P2 Pipet</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F144054M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P20 Pipet</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F144056M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P200 Pipet</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F144058M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol red&#160;solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P0290</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4474</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipet-Aid XP pipette controller</td>
			<td>Drummond Scientific</td>
			<td>4-000-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid pCapsid</td>
			<td>De novo or Addgene, etc.&#160;</td>
			<td>N/A</td>
			<td>We used pACGrh74.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid pHelper</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>112867</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid pTransgene</td>
			<td>De novo or Addgene, etc.&#160;</td>
			<td>N/A</td>
			<td>We used pdsAAV-GFP.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pluronic F-68 polyol solution (10%)</td>
			<td>Mp Biomedicals</td>
			<td>92750049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene glycol 8000</td>
			<td>Research Products International</td>
			<td>P48080-500.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylenimine HCl Max (PEI-Max)</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>NC1038561</td>
			<td>Dilute in water to 40 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polypropylene centrifuge tubes, sterile</td>
			<td>Corning</td>
			<td>431123</td>
			<td>500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polypropylene centrifuge tubes, sterile</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430776</td>
			<td>250 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polypropylene Optiseal tubes</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>361625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipettes</td>
			<td>Alkali Scientific</td>
			<td>SP250-B</td>
			<td>50 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipettes</td>
			<td>Alkali Scientific</td>
			<td>SP225-B</td>
			<td>25 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipettes</td>
			<td>Alkali Scientific</td>
			<td>SP210-B</td>
			<td>10 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipettes</td>
			<td>Alkali Scientific</td>
			<td>SP205-B</td>
			<td>5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaker flasks</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>PBV1000</td>
			<td>1 L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaker flasks</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>PBV50-0</td>
			<td>500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaker flasks</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>PBV250</td>
			<td>250 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaker flasks</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>PBV12-5</td>
			<td>125 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride solution (5 M)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC1752640</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile syringes</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>14-955-458</td>
			<td>5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe filter</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SLGV013SL</td>
			<td>0.22 micron</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl pH 8.5 (1 M)</td>
			<td>Kd Medical</td>
			<td>RGE3363</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue solution</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15250061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube rack assembly</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>361646</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube spacers (x4)</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>361669</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubing for peristaltic pump</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14190516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Type 70 Ti fixed-angle titanium rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>337922</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra low temperature freezer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Set at -70 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vivaspin 20 centrifugal concentrator</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>VS2041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Set at 37 &#176;C</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

suspension culture production and purification of adeno-associated virus by iodixanol density gradient centrifugation for in vivo applications

Ce protocole décrit la production et la purification de virus adéno-associés recombinants (rAAV) par centrifugation par gradient de densité d’iodixanol, une méthode de purification de l’AAV indépendante du sérotype décrite pour la première fois en 1999. Les vecteurs rAAV sont largement utilisés dans les applications de thérapie génique pour délivrer des transgènes à divers types de cellules humaines. Dans ce travail, le virus recombinant est produit par transfection de cellules Expi293 en culture en suspension avec des plasmides codant pour les gènes auxiliaires du transgène, de la capside vectorielle et de l’adénoviral. La centrifugation par gradient de densité d’iodixanol purifie les particules AAV complètes en fonction de la densité des particules. De plus, trois étapes sont incluses dans cette méthodologie désormais omniprésente afin d’augmenter le rendement total du virus, de diminuer le risque de précipitation due aux protéines contaminantes et de concentrer davantage le produit viral final, respectivement : précipitation des particules virales à partir de milieux cellulaires à l’aide d’une solution de polyéthylène glycol (PEG) et de chlorure de sodium, introduction d’un deuxième cycle de centrifugation par gradient de densité d’iodixanol, et échange de tampon via un filtre centrifuge. En utilisant cette méthode, il est possible d’obtenir des titres constants de l’ordre de 10à 12 particules virales/mL d’une pureté exceptionnelle pour une utilisation in vivo .

Recombinant adeno-associated viral (rAAV) vectors are widely used tools for the treatment of genetic diseases, including spinal muscular atrophy, retinal dystrophy, and hemophilia A1,2,3. rAAV vectors are engineered to lack viral genes present in wild-type AAV4, a small, non-envelope icosahedral virus with a linear single-stranded 4.7 kb DNA genome. AAV was first discovered in the 1960s as a contaminant of adenovirus preparations5. Despite its small capsid size, which limits the size of the transgene that can be packaged to a maximum of 4.9 kb excluding ITRs6, AAV is useful for transgene delivery because it is non-pathogenic in humans, allows expression of transgene in many dividing and nondividing cell types, and has limited immunogenic effects7.
As members of the genus dependoparvovirus, the production of rAAVs relies on the expression of helper genes present in adenovirus or herpes simplex virus8. Several strategies to produce rAAV have been developed, but production in HEK293 cells transformed with the adenoviral E1A/E1B helper genes is the most established method used today9. The general approach of rAAV production begins with the transfection of HEK293 cells with three plasmids containing the transgene within inverted terminal repeats (ITRs), AAV rep and cap genes, and additional adenoviral helper genes, respectively. Seventy-two hours after transfection, cells are harvested and processed to purify rAAV containing the transgene.
In the development of new rAAV vectors for therapeutic purposes, a major goal is producing vectors with increased transduction efficiency. An increase in the transduction efficiency of target cells would mean a decrease in the necessary clinical dose of rAAV, thus decreasing the likelihood of adverse immunogenic effects ranging from antibody-mediated neutralization to acute toxicities10,11. To improve the transduction efficacy of rAAV vectors, alterations can be made to the packaged genome or to the capsid. Viable methods to tune transduction efficacy via packaged genome design include the incorporation of strong and tissue-specific promoters, thoughtful selection of mRNA processing elements, and coding sequence optimization to improve translation efficiency12. Alterations to the capsid are made with the goal of increasing tropism for target human cell types. Efforts towards developing new rAAV transgene delivery vector capsids are generally characterized by a focus on either rational design of AAV capsids with specific mutations targeting specific cell receptors or directed evolution to identify capsids with tropism for specific cell types from high-complexity combinatorial capsid libraries without targeting one specific receptor (although some groups combine these approaches)13,14,15. In the directed evolution approach, combinatorial capsid libraries are constructed using a particular serotype backbone with mutated variable regions on the capsid exterior16. Combinatorial capsid libraries are often constructed from AAV serotypes not originating in humans, decreasing the risk of preexisting immunity during clinical use10. Therefore, purification methods that can be applied to any serotype are ideal to eliminate the need for serotype-specific optimization for the less commonly used serotypes serving as backbones for these libraries.
Iodixanol density gradient centrifugation is utilized to purify high titers of rAAV with high infectivity17. In this protocol, rAAV is produced in suspension cell culture to decrease the amount of labor needed to produce large titers of AAV. A centrifugation step is also included to clear cell lysate to reduce the presence of contaminating proteins and decrease the risk of virus precipitation. This protocol is a cost-effective method to produce preparations of high-purity rAAV suitable for pre-clinical use.

Pleins feux sur l’auteur : Isolement efficace des virus adéno-associés pour les applications précliniques

Culture en suspension, production et purification de virus adéno-associés par centrifugation par gradient de densité d’iodixanol pour des applications in vivo

We use a directed evolution approach to identify adeno-associated viral capits with higher tropism for target human cell types. Through this research, we aim to produce recombinant adeno-associated viral vectors with improved target cell transduction and clinical relevance within the field of gene therapy. Our group recently de-targeted several AAV serotypes from the liver by incorporating capsid residues original to an AAV serotype that naturally possesses decreased liver tropism.If successfully expanded to additional serotypes, this provides the groundwork to decrease necessary RAAV clinical dose by peripheral injection and reduce adverse patient outcomes. The IODIXanol purification method while being cost effective is difficult to scale up. Additionally, in downstream applications, the directed evolution approach is performed with animal models or in vitro.So capsid isolated by directed evolution may not transduce in vivo targets in humans to the same extent as in preclinical models. This protocol is affordable and accessible for smaller labs. Additionally, this method yields high purity, recombinant adeno-associated virus that can be used for downstream preclinical in vivo applications.

Cette méthode peut être utilisée pour obtenir des titres d’au moins 10à 12 particules virales par ml. Un titre peut être obtenu (Figure 3) par qPCR à l’aide des amorces ITR fournies dans le tableau supplémentaire 1, par ddPCR ou par toute autre méthode de titrage. Des titres sous-optimaux pourraient résulter de l’utilisation d’un gène cap codant pour une capside avec une faible efficacité d’emballage.
Une a...

Watch this Scientific Journal Video about Author Spotlight: Efficient Adeno-Associated Virus Isolation for Pre-Clinical Applications at JoVE.com

Le virus adéno-associé est produit en culture cellulaire en suspension et purifié par centrifugation à double gradient de densité d’iodixanol. Des étapes sont incluses pour augmenter le rendement total du virus, réduire le risque de précipitation du virus et concentrer davantage le produit viral final. Les titres finaux attendus atteignent 10à 12 particules virales/mL et conviennent à une utilisation préclinique in vivo .

This protocol describes recombinant adeno-associated virus (rAAV) production and purification by iodixanol density gradient centrifugation, a ...

Nous utilisons une approche d’évolution dirigée pour identifier les capits viraux adéno-associés avec un tropisme plus élevé pour les types de cellules humaines cibles. Grâce à cette recherche, nous visons à produire des vecteurs viraux adéno-associés recombinants avec une meilleure transduction des cellules cibles et une pertinence clinique dans le domaine de la thérapie génique. Notre groupe a récemment déciblé plusieurs sérotypes AAV du foie en incorporant des résidus de capside originaux d’un sérotype AAV qui possède naturellement un tropisme hépatique réduit.Si elle est étendue avec succès à d’autres sérotypes, cela fournit les bases pour réduire la dose clinique nécessaire de RAAV par injection périphérique et réduire les résultats indésirables pour les patients. La méthode de purification IODIXanol, bien qu’elle soit rentable, est difficile à mettre à l’échelle. De plus, dans les applications en aval, l’approche d’évolution dirigée est réalisée avec des modèles animaux ou in vitro.Ainsi, la capside isolée par évolution dirigée peut ne pas transduire les cibles in vivo chez l’homme dans la même mesure que dans les modèles précliniques. Ce protocole est abordable et accessible aux petits laboratoires. De plus, cette méthode produit un virus adéno-associé recombinant de haute pureté qui peut être utilisé pour des applications précliniques in vivo en aval.

suspension-culture-production-purification-adeno-associated-virus

Research

JoVE Journal

Medicine

Suspension Culture Production and Purification of Adeno-Associated Virus by Iodixanol Density Gradient Centrifugation for In Vivo Applications

This protocol describes recombinant adeno-associated virus (rAAV) production and purification by iodixanol density gradient centrifugation, a serotype-agnostic method of purifying AAV first described in 1999. rAAV vectors are widely used in gene therapy applications to deliver transgenes to various human cell types. In this work, the recombinant virus is produced by transfection of Expi293 cells in suspension culture with plasmids encoding the transgene, vector capsid, and adenoviral helper genes. Iodixanol density gradient centrifugation purifies full AAV particles based on particle density. Additionally, three steps are included in this now-ubiquitous methodology in order to increase total virus yield, decrease the risk of precipitation due to contaminating proteins, and further concentrate the final virus product, respectively: precipitation of viral particles from cell media using a solution of polyethylene glycol (PEG) and sodium chloride, the introduction of a second round of iodixanol density gradient centrifugation, and buffer exchange via a centrifugal filter. Using this method, it is possible to consistently achieve titers in the range of 1012 viral particles/mL of exceptional purity for in vivo use.

Adeno-associated virus is produced in suspension cell culture and purified by double iodixanol density gradient centrifugation. Steps are included to increase total virus yield, decrease the risk of virus precipitation, and further concentrate the final virus product. Expected final titers reach 1012 viral particles/mL and are suitable for pre-clinical in vivo use.